劉泉體 高海明 蘭 婷 吳佳奇

西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院創(chuàng)傷外科，四川省瀘州市 646000

富血小板血漿是血液經(jīng)過(guò)離心、分離而得到的血小板高度濃縮的血液制品，通常認(rèn)為其血小板含量為正常全血的5倍以上[1]。而富血小板凝膠是富血小板血漿中血小板激活的產(chǎn)物，通常由凝血酶、鈣離子介導(dǎo)激活。由于其富含多種生長(zhǎng)因子，臨床上將其應(yīng)用于創(chuàng)面及軟組織的修復(fù)[2]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)其研究的深入，發(fā)現(xiàn)PRP有著一定的抗菌效應(yīng)，涉及到的細(xì)菌包括甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌[3]、糞腸球菌[4]等。近年來(lái)甚至有學(xué)者表示其對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)也有抗菌效應(yīng)[5-6]。由于MRSA作為多重耐藥細(xì)菌，其高致病性及高毒力，使得其造成的傷口感染易遷移不愈及反復(fù)發(fā)作，治療困難。而關(guān)于PRP抗菌效應(yīng)的研究受限于多種因素，其抗菌譜目前尚無(wú)統(tǒng)一結(jié)論，為此，本研究將通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察健康志愿者全血提取的PRP及其激活產(chǎn)物PRG對(duì)MRSA是否有抗菌效應(yīng)，為PRP的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 MRSA臨床菌株由西南醫(yī)科大學(xué)病原微生物實(shí)驗(yàn)室提供(來(lái)源于1例慢性骨髓炎患者)。

1.2 材料及設(shè)備 一次性真空采血管(10ml、2ml，藍(lán)管)、采血針、一次性注射器(江蘇宇力醫(yī)療)、全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(希森美康)、葡萄糖酸鈣注射液(四川美大康華康)、凝血酶凍干粉(湖南一格)、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂平板(杭州微生物)、分光光度儀、比色皿(上海元析)、電子天平(梅特勒—托利多)、一次性培養(yǎng)皿(90mm)、牛津杯(上海兢翀)、硫酸慶大霉素注射液(西南藥業(yè))、立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海齊欣)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣)、低速離心機(jī)(中佳 SC-2546)、氣浴恒溫振蕩器(金壇市瑞華儀器)、生物安全柜(海爾)等。

1.3 菌株的活化、增菌 將凍存的MRSA臨床菌株取1接種環(huán)劃線法接種至血瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。配置100ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，高溫蒸汽滅菌鍋121℃滅菌20min。取2支15ml離心管，各加入10ml已冷卻的上述營(yíng)養(yǎng)肉湯，將血培養(yǎng)皿上形態(tài)規(guī)則的菌落1接種環(huán)接種至其中1支離心管，2只離心管均放入搖床，150rpm，37℃，16h后取出。

1.4 PRP的制備 采集6名健康志愿者(3男，3女，平均年齡26歲)，志愿者無(wú)心腦血管等基礎(chǔ)疾病，實(shí)驗(yàn)前3個(gè)月內(nèi)無(wú)感染性疾患、未服用過(guò)抗生素、抗凝藥物或免疫抑制藥物。一次性10ml、2ml真空采血管采集每名志愿者肘部靜脈血，2ml采血管直接血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)血小板，10ml采血管使用低速離心機(jī)以300×g離心力(1 410rpm)，離心10min，以注射器抽取全部上層血清至紅細(xì)胞層下約3mm轉(zhuǎn)移至另一真空離心管(不含任何藥物)，再次以700×g離心力(2 150rpm),離心10min，抽取約3/4上層血清，余下約1ml，反復(fù)搖勻即為PRP，取200μl血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)血小板。余下PRP于3h內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 慶大霉素溶液、葡萄糖酸鈣—凝血酶溶液制備 取硫酸慶大霉素注射液(40 000U/ml)用滅菌純水梯度稀釋法稀釋至40U/ml備用。取10%葡萄糖酸鈣注射液2ml加入200U凝血酶凍干粉中，臨用前配置。

1.6 打孔法抑菌實(shí)驗(yàn) 配置MH瓊脂培養(yǎng)基270ml，分裝至3瓶100ml容量瓶中，每瓶裝90ml，高溫蒸汽滅菌鍋121℃滅菌20min，放置于室溫下逐漸冷卻。將增菌完畢的菌懸液在搖菌16h取出，以增菌用營(yíng)養(yǎng)肉湯為對(duì)照，分光光度計(jì)測(cè)定原菌液OD600值，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)肉湯倍比稀釋至OD值為0.5左右。取稀釋后的該菌懸液以滅菌純水梯度稀釋100倍，取10ml分別倒入冷卻至45℃左右的MH瓊脂培養(yǎng)基中搖勻，再另取該菌懸液1ml以滅菌純水梯度稀釋法稀釋至10-6、10-7、10-8數(shù)量級(jí)，各取100μl于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中涂板計(jì)數(shù)，每個(gè)數(shù)量級(jí)涂板2個(gè)，取平均數(shù)。取20個(gè)一次性培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿均分為A、B、C、D四個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域即為一組，區(qū)域中心放置牛津杯(內(nèi)徑為6mm，外徑為8mm)，將配置好的帶菌液的培養(yǎng)基每15ml傾注至一次性培養(yǎng)皿中制備帶菌平板共20個(gè)。放置5min后取出牛津杯，此時(shí)MH瓊脂培養(yǎng)基已凝固，四個(gè)區(qū)域中心各1個(gè)直徑約8mm孔，分別于上述ABCD四個(gè)區(qū)域各孔中加入50μl硫酸慶大霉素溶液、PRP、PRP、滅菌純水。于C區(qū)域中加入5μl葡萄糖酸鈣—凝血酶溶液。將培養(yǎng)皿放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，12h取出觀察結(jié)果。

1.7 結(jié)果判定 使用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑(mm)=所測(cè)得的直徑平均數(shù)-8mm。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Ecxel匯總數(shù)據(jù)，SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)分析，P值<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌接種于血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后取出可見(jiàn)金黃色菌落形成，接種MRSA的離心管經(jīng)增菌培養(yǎng)后16h后可見(jiàn)試管內(nèi)溶液渾濁，而僅含有營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的離心管中仍清亮。提示MRSA細(xì)菌生長(zhǎng)良好，以營(yíng)養(yǎng)肉湯為對(duì)照，測(cè)得原菌懸液OD值為1.375。經(jīng)過(guò)倍比稀釋后測(cè)得細(xì)菌懸液OD值為0.534。倍比稀釋后的菌懸液再經(jīng)梯度稀釋后涂板測(cè)得細(xì)菌濃度為1.76×109CFU/ml，故經(jīng)過(guò)生理鹽水稀釋100倍后再倒入MH瓊脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌濃度為1.76×106CFU/ml。

2.2 6名健康志愿者全血中所含血小板計(jì)數(shù)為(161±19.2)×109/L，經(jīng)2次離心法手工制備的PRP中血小板值為(876.3±73.3)×109/L，血小板富集倍數(shù)平均為5.4倍，符合PRP的制備標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 打孔法抑菌實(shí)驗(yàn)中，在PRP中加入葡萄糖酸鈣—凝血酶溶液后，10min內(nèi)迅速凝固成塊激活形成PRG，而PRP在平板中緩慢擴(kuò)散并凝固。在冷卻至45℃的瓊脂培養(yǎng)基中預(yù)加菌液后使用傾注平板法，所制備的平板菌落分布均勻，重復(fù)性好。在培養(yǎng)12h后取出觀察可見(jiàn)：40U/ml的慶大霉素溶液組產(chǎn)生明顯的抑菌圈，其平均直徑大小為(17.15±0.96)mm，而PRP及PRG組與滅菌純水一致，均無(wú)抑菌圈產(chǎn)生。見(jiàn)圖1。

圖1 培養(yǎng)12h后抑菌圈產(chǎn)生情況

注：左上角“P”代表PRP，右上角“G”PRG，左下角“+”代表慶大霉素，右下角“-”代表滅純水。

3 討論

富血小板血漿的抗菌效應(yīng)研究由來(lái)已久，關(guān)于其抗菌機(jī)制，目前更多的觀點(diǎn)將其歸功于高濃度的血小板及白細(xì)胞。血小板裂解后釋放的抗菌肽被認(rèn)為是血小板的主要抗菌機(jī)制，一些抗菌肽可以通過(guò)破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，抑制微生物RNA的合成、蛋白的合成或者蛋白折疊，滅活細(xì)菌毒素，激活細(xì)菌的自溶系統(tǒng)。血小板還能介導(dǎo)炎性細(xì)胞的趨化，也被認(rèn)為是其抗菌的主要機(jī)制[7-8]。

而關(guān)于富血小板血漿中所含白細(xì)胞抗菌作用目前仍有爭(zhēng)議，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，白細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫，在機(jī)體抵御外來(lái)感染的斗爭(zhēng)中占據(jù)主導(dǎo)地位，而Mariani等人[9]通過(guò)體外抗菌實(shí)驗(yàn)研究了含不同白細(xì)胞的PRP制劑對(duì)一些細(xì)菌的抗菌效應(yīng)，得出白細(xì)胞的存在并不會(huì)增加血小板在體外抗菌效應(yīng)。

對(duì)于富血小板血漿的抗菌譜，目前的研究認(rèn)為PRP及PRG對(duì)包括甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、糞腸球菌、肺炎克雷伯桿菌、白色念珠菌、口腔鏈球菌、痤瘡丙酸桿菌等可能存在抗菌效應(yīng)，由于所納入的研究眾多，菌種不同、實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)方法及對(duì)象差異也較大，因此即便是對(duì)同一種細(xì)菌，不同的研究也可能得出不同的結(jié)論。如吳兵[10]以免血制備PRP與抗生素聯(lián)合使用的實(shí)驗(yàn)中，未能發(fā)現(xiàn)PRP對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果。楊閻峙等[11]以健康志愿者靜脈血制備PRP進(jìn)行體外抗菌實(shí)驗(yàn)，得出結(jié)論為富血小板凝膠對(duì)大腸桿菌及銅綠假單胞菌無(wú)明顯抑菌作用。PRP 對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及銅綠假單胞菌均無(wú)明顯抑菌作用。而?etinkaya等[6]研究表明PRP和PPP在體外對(duì)MRSA、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌有抑制作用。不僅如此，在一些大型的臨床研究中依然存在不同的結(jié)論[12-13]。一方面目前許多的體外研究實(shí)驗(yàn)所采用的方法為時(shí)間—抑菌曲線法，而這種方法存在一個(gè)非常關(guān)鍵并且容易被忽略的問(wèn)題：所有時(shí)間抑菌曲線法都需要配置反應(yīng)管，在共混合物培養(yǎng)中，PRP會(huì)被其余加入的物質(zhì)稀釋，可以認(rèn)為在加入反應(yīng)管之前的物質(zhì)是PRP，但存在于反應(yīng)管內(nèi)的物質(zhì)由于其血小板濃度被稀釋后已達(dá)不到PRP標(biāo)準(zhǔn)甚至低于全血，故此種方法得出的結(jié)論可靠性有待考量。由于MRSA多重耐藥的特性，在骨科領(lǐng)域中，其治療一直是許多外科醫(yī)師所頭疼的問(wèn)題，并且近年來(lái)MRSA檢出率逐漸增高，由其感染所致的骨髓炎患者，常常需要多次手術(shù)，并且存在終身不愈的風(fēng)險(xiǎn)。為了明確PRP或PRG能否對(duì)MRSA臨床菌株有抗菌效果，為骨科領(lǐng)域中難愈性感染的治療提供新的參考，故本實(shí)驗(yàn)采用定性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)紙片擴(kuò)散法原理，在不改變PRP使用濃度的情況下，觀察抑菌圈的有無(wú)及大小來(lái)求證。

在本實(shí)驗(yàn)中，筆者選擇含枸櫞酸鈉的藍(lán)色蓋頭一次性真空采血管作為血小板的保存劑，是由于該采血管相比含乙二胺四乙二酸鹽的紫色蓋頭管更有利于血小板的保存，并且枸櫞酸鹽對(duì)人體安全性更高，采血管獲取方便。在實(shí)驗(yàn)前，查閱了骨髓炎患者M(jìn)RSA的耐藥情況并收集了本院相關(guān)資料，發(fā)現(xiàn)MRSA對(duì)于臨床上常用于沖洗創(chuàng)口的慶大霉素耐藥率相對(duì)不高，并且于實(shí)驗(yàn)前已將菌種送檢藥敏證實(shí)其對(duì)慶大霉素敏感，故本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照組采用慶大霉素。由健康志愿者全血經(jīng)過(guò)離心后血小板濃集倍數(shù)達(dá)到了目前公認(rèn)PRP的標(biāo)準(zhǔn)，是一種實(shí)用、經(jīng)濟(jì)、安全的制備方法。制備過(guò)程中需要注意的是，初次離心后白膜層富含大量的血小板，確保吸取轉(zhuǎn)移至二次離心，在二次離心后仍然可見(jiàn)到白膜層，移去較多的血清可以進(jìn)一步提高PRP中血小板的濃度。制備后的PRP需要充分搖勻以確保血小板分布均勻，否則由于離心后大量的血小板沉淀在管底，將使測(cè)得的PRP中的血小板數(shù)量比實(shí)際偏低[14]。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)采用的預(yù)加菌液傾注平板法[15]，制備的帶菌平板細(xì)菌分布均勻，可以避免普通的涂布法出現(xiàn)細(xì)菌分布不均的情況，打孔法使得藥物能夠在瓊脂中均勻擴(kuò)散，彌補(bǔ)了紙片擴(kuò)散法的不足，使該實(shí)驗(yàn)可行性及重復(fù)性得到提高，并且在條件許可下盡量選擇較低的細(xì)菌濃度，以利于觀察細(xì)微的變化。 在PRG組中的平板孔中加入葡萄糖酸鈣—凝血酶復(fù)合物時(shí)，可以明顯地看到，在10min內(nèi)PRP迅速于滴加藥物的位置凝聚成塊形成PRG。而PRP組血小板均勻向瓊脂周圍擴(kuò)散，于孔邊緣緩慢凝固。在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，慶大霉素組產(chǎn)生均勻的抑菌圈，邊界清晰，識(shí)別度高，平均抑菌圈直徑為(17.15±0.96)mm。PRP組及PRG組同陰性對(duì)照組在本次實(shí)驗(yàn)中均未看到抑菌圈產(chǎn)生，提示健康志愿者全血所制備的PRP及其激活產(chǎn)物PRG對(duì)MRSA臨床菌株無(wú)抗菌效應(yīng)，PRP及PRG對(duì)臨床上MRSA感染控制可能無(wú)益。

由于研究條件的限制，本實(shí)驗(yàn)仍然存在著不足：(1)由于實(shí)驗(yàn)所需血液樣本并不多，納入的研究對(duì)象不大，并且實(shí)驗(yàn)對(duì)象為健康志愿者，有別于住院患者。由于創(chuàng)傷、感染等多重因素刺激，患者體內(nèi)的血小板水平往往較高，經(jīng)過(guò)同樣的方法制備的PRP其血小板水平與健康人不在同一水平。(2)本實(shí)驗(yàn)中觀察時(shí)間選定為12h，盡管一些文獻(xiàn)中PRP和細(xì)菌共培養(yǎng)24h或者48h后仍能夠產(chǎn)生抑菌圈[16]，但一些學(xué)者通過(guò)繪制時(shí)間—抑菌曲線的研究認(rèn)為PRP發(fā)揮抗菌效應(yīng)有時(shí)效性，維持時(shí)間較短，并且PRP發(fā)揮的是抑菌作用而非殺菌作用，當(dāng)這種抑制作用消失后，細(xì)菌又會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)。而本實(shí)驗(yàn)為定性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，抑菌圈的形成需要未被抑制生長(zhǎng)的細(xì)菌不斷傳代而顯示，無(wú)法了解實(shí)驗(yàn)組周圍細(xì)菌每一時(shí)間的活性變化，并且在能夠產(chǎn)生肉眼可辨的抑菌圈情況下，選擇了盡可能低的細(xì)菌濃度，但這種濃度與臨床上患者傷口中細(xì)菌濃度仍有差異。(3)本實(shí)驗(yàn)中PRP及PRG對(duì)MRSA無(wú)抑菌效應(yīng)，但臨床上感染該細(xì)菌的患者通常都會(huì)使用諸如萬(wàn)古霉素之類的強(qiáng)效抗生素，在這類患者中PRP或PRG的使用是否會(huì)影響抗生素的抗感染效果不得而知。此外，體外實(shí)驗(yàn)僅針對(duì)體外環(huán)境，可以作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的參考，在體內(nèi)是否也是如此結(jié)論，有待于進(jìn)一步研究。