王清玄，鞠孟辰，卜崇峰1，

（1.中國(guó)科學(xué)院 水利部 水土保持研究所，陜西 楊凌712100；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 水土保持研究所 陜西 楊凌712100）

生物結(jié)皮是由苔蘚植物、地衣、藻類(lèi)、真菌和細(xì)菌等與土壤顆粒形成的復(fù)合體，廣泛分布于干旱、炎熱和貧瘠的環(huán)境中［1］。作為生物結(jié)皮的一種主要形式，苔蘚結(jié)皮有著多種水土保持功能與生態(tài)功能［2-4］，對(duì)植被恢復(fù)與重建具有積極意義［5］，應(yīng)用前景十分廣闊。研究表明，通過(guò)一定的技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)野外人工快速恢復(fù)苔蘚結(jié)皮是完全可行的［6-7］，然而，工程化推廣時(shí)遇到了生物結(jié)皮種源需求難以滿足的瓶頸問(wèn)題。初步的種源擴(kuò)繁試驗(yàn)顯示，營(yíng)造適宜的環(huán)境條件、采取適合的培養(yǎng)基（培養(yǎng)液），能夠?qū)崿F(xiàn)生物結(jié)皮種源的快速擴(kuò)繁［8-9］。不過(guò)，由于目前進(jìn)行種源擴(kuò)繁的實(shí)踐中存在培育周期長(zhǎng)、株高度低于自然發(fā)育的苔蘚、培育后期易發(fā)生衰敗和退化等問(wèn)題，嚴(yán)重阻礙了擴(kuò)繁的速度與有效性，使得生物結(jié)皮的種源供給不足成為限制這一技術(shù)推廣應(yīng)用的瓶頸。

土壤微生物是苔蘚結(jié)皮的重要組分，通過(guò)改善表土結(jié)構(gòu)、提高表土養(yǎng)分提供適宜苔蘚植物生長(zhǎng)的表土微環(huán)境［10］。芽孢桿菌是一類(lèi)可促進(jìn)多種植物生長(zhǎng)發(fā)育的微生物［11］，在荒漠地區(qū)約占土壤微生物的50%，是促進(jìn)生物結(jié)皮形成與發(fā)育的重要微生物［12］。將其引入苔蘚結(jié)皮的種源擴(kuò)繁過(guò)程中，可能會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育有一定的促進(jìn)作用。苔蘚植物莖葉碎片有很強(qiáng)的繁殖能力，在環(huán)境適宜時(shí)，其莖葉碎片細(xì)胞經(jīng)分裂和分化形成小植物體，進(jìn)而產(chǎn)生大量的新植物體［13］。研究表明，多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能通過(guò)誘導(dǎo)植物愈傷組織及增強(qiáng)光合作用等方式促進(jìn)苔蘚結(jié)皮的生長(zhǎng)發(fā)育［14-15］。目前，苔蘚結(jié)皮種源擴(kuò)繁的研究仍主要集中在對(duì)環(huán)境因子與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等方面。對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用雖有大量研究，但主要集中在組織培養(yǎng)與高度可控的培養(yǎng)箱環(huán)境下，溫室環(huán)境下的培育研究還有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

本研究在溫室培育實(shí)驗(yàn)中引入芽孢桿菌、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑兩種因子，觀測(cè)不同處理作用下苔蘚結(jié)皮的覆蓋度、株高度和株密度的變化，探討兩種因子對(duì)溫室苔蘚種源擴(kuò)繁的影響，以期為苔蘚種源室內(nèi)快速擴(kuò)繁提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 種源采集與制備

苔蘚結(jié)皮樣品于2018年6月17日采自陜西省延 安 市 磚 窯 灣 鎮(zhèn) 賈 居 溝（109°08′—109°14′E，36°42′—36°48′N(xiāo)，海拔1 003～1 203 m）深處人為干擾較少地區(qū)，優(yōu)勢(shì)苔蘚種為土生對(duì)齒蘚（Didymodon vineɑlis），伴生有叢生真蘚（Bryum cɑespiticium）等。用小鏟取上部1 cm 較為完整、株高度大于5 mm 的發(fā)育良好的苔蘚結(jié)皮。將采集好的結(jié)皮置于干燥陰暗處晾干。剔除雜質(zhì)后用粉碎機(jī)粉碎至長(zhǎng)度分布在0.01～2 mm 的莖葉碎片，即為擴(kuò)繁試驗(yàn)所用種源。

1.2 擴(kuò)繁培育環(huán)境

使用西北農(nóng)林科技大學(xué)的科研溫室。試驗(yàn)開(kāi)始前，在溫室的頂部加裝反光膜，南北向掛搭遮光布，并定時(shí)開(kāi)啟濕簾、定期灑水，調(diào)節(jié)溫室內(nèi)溫度與光照強(qiáng)度到適合苔蘚生長(zhǎng)發(fā)育的水平?？刂苹|(zhì)含水率在15%～30%（由于基質(zhì)較薄，體積含水量日動(dòng)態(tài)變化以澆水后達(dá)到約100%的峰值，后隨水分蒸發(fā)逐漸降低至10%～30%間時(shí)，需要再次補(bǔ)水）。使用角鐵搭建多層支架，下鋪吊頂板，保證層間受光均勻，架高2 m，長(zhǎng)2.4 m，寬1.2 m。經(jīng)測(cè)定，整個(gè)培育周期內(nèi)溫度最大值為35 ℃，光照最大值2.60×104lux。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與布置

本試驗(yàn)考慮芽孢桿菌（巨大芽孢桿菌Bɑcillus megɑterium，BMe；膠質(zhì)芽孢桿菌Bɑcillus mucilɑginosus，BMu）和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（TDZ）兩個(gè)因素。設(shè)計(jì)完全試驗(yàn)，共6 個(gè)處理，重復(fù)4 次，共計(jì)24 個(gè)樣品。使用下部帶孔的方形30 cm×30 cm×2 cm 接種盤(pán)，將土工布?jí)|于接種盤(pán)底部，其上按照處理均勻覆蓋添加了膠質(zhì)芽孢桿菌（1 g／kg基質(zhì)）或巨大芽孢桿菌（1 g／kg基質(zhì)）的泥炭土基質(zhì)3～4 mm，使用高霧化度的噴頭噴水浸濕。按300 g／m2將等量長(zhǎng)度為0.01～2 mm莖葉碎片均勻撒播在基質(zhì)表面，并在相應(yīng)處理均勻噴灑生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑TDZ（1 mg／L）稀釋液200 ml。播種后于培養(yǎng)環(huán)境內(nèi)隨機(jī)擺放。每15 d噴灑Hoagland營(yíng)養(yǎng)液（2.1 L／m2）一次，并記錄當(dāng)日苔蘚覆蓋度、株高度和株密度。試驗(yàn)于2018 年8 月17 日啟動(dòng)，2018年10月17日結(jié)束，歷時(shí)兩個(gè)月。

1.4 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1 苔蘚覆蓋度 按照五點(diǎn)取樣法在接種盤(pán)內(nèi)選5個(gè)點(diǎn)。參考專利隱花植物蓋度野外測(cè)定樣框［16］，自制10 cm×10 cm 正方形網(wǎng)格板，網(wǎng)格尺寸2.5 cm×2.5 cm，共計(jì)16個(gè)網(wǎng)格。觀測(cè)每個(gè)網(wǎng)格下苔蘚覆蓋度，求和后除以網(wǎng)格板面積，即為該樣框下苔蘚覆蓋度。

1.4.2 苔蘚株高度 用電子游標(biāo)卡尺隨機(jī)測(cè)量接種盤(pán)內(nèi)15株苔蘚，每株重復(fù)測(cè)量3次。

1.4.3 苔蘚株密度 按照五點(diǎn)取樣法在接種盤(pán)內(nèi)選5個(gè)點(diǎn)，使用1.3.1中自制網(wǎng)格板，觀測(cè)每個(gè)網(wǎng)格下苔蘚株數(shù)，求和后除以網(wǎng)格板面積，即為該樣框下苔蘚株密度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，使用R 3.4.1進(jìn)行巴特萊特方差齊性檢驗(yàn)，并使用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差分析與Tukey HSD 多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加物對(duì)苔蘚覆蓋度的影響

圖1為不同處理在60 d內(nèi)苔蘚覆蓋度的變化情況?？梢钥吹剑谡麄€(gè)培育期內(nèi)，苔蘚覆蓋度增長(zhǎng)速度先慢后快，第15 d與第30 d所測(cè)數(shù)據(jù)差異很小，平均增幅僅為2.09%。此后苔蘚覆蓋度增速明顯變快，不同處理間差異更加明顯。此外，TDZ，BMe＋TDZ兩種處理的差異在4次觀測(cè)中蓋度均較為接近；添加巨大芽孢桿菌與空白對(duì)照兩種處理的蓋度差異不大。

圖1 苔蘚結(jié)皮覆蓋度變化情況

對(duì)苔蘚覆蓋度數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)與方差齊性檢驗(yàn)，結(jié)果均不顯著（p＞0.05），表明該組數(shù)據(jù)滿足方差分析的前提假設(shè)。60 d結(jié)皮蓋度方差分析結(jié)果（見(jiàn)表1）顯示，芽孢桿菌、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)覆蓋度均有顯著的影響（p＜0.05）。其中芽孢桿菌的F 值（21.32）大于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（13.76），表明前者解釋了更多部分的差異，對(duì)生物結(jié)皮蓋度的影響大于后者。

多重比較結(jié)果顯示不同處理的苔蘚覆蓋度由小到大分別為：TDZ（3.33%）＝BMe ＋TDZ（4.33%）＜BMe（12.22%）＝CK（15.11%）＜BMu ＋TDZ（22.44%）＜BMu（34.44%）。1 mg／L的TDZ對(duì)苔蘚覆蓋度有顯著地負(fù)效應(yīng)，相比于空白對(duì)照，蓋度減少了11.8%。BMu 處理與CK 相比蓋度提高了127.93%，但BMe處理與CK 無(wú)明顯差異。

表1 苔蘚結(jié)皮覆蓋度的方差分析

2.2 不同添加物對(duì)苔蘚株高度的影響

圖2為不同處理在60 d內(nèi)苔蘚株高度的變化情況。在整個(gè)培育期內(nèi)，不同處理下苔蘚株高度的變化呈現(xiàn)出多種模式。第一個(gè)15 d內(nèi)BMu處理株高度最大，達(dá)到0.89 mm。第二個(gè)15 d內(nèi)BMu處理株高度幾乎沒(méi)有變化，此時(shí)CK 處理株高度增長(zhǎng)幅度最大，達(dá)到1.90 mm。此后的兩個(gè)15 d各處理株高度均有大幅增長(zhǎng)，其中TDZ與BMe＋TDZ處理株高度遠(yuǎn)小于其他處理。

圖2 苔蘚株高度變化情況

對(duì)苔蘚株高度數(shù)據(jù)進(jìn)行巴特萊特方差齊性檢驗(yàn)，p＝0.6，表明各處理苔蘚株高的主要差異來(lái)自處理。60 d苔蘚株高度的方差分析結(jié)果（見(jiàn)表2）顯示：功能性微生物、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)覆蓋度均有顯著的影響（p＜0.05）。其中芽孢桿菌的F 值（5.70）小于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（10.57），表明兩種因素中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)苔蘚株高度的影響更大。

培育60 d后，不同處理間苔蘚株高度由小到大分別為：BMe＋TDZ（1.94 mm）＜TDZ（2.12 mm）＜BMe（4.67 mm）＜CK（5.48 mm）＜BMu＋TDZ（5.66 mm）＝BMu（6.33 mm）。1 mg／L生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑TDZ對(duì)苔蘚株高度有顯著的負(fù)效應(yīng)，與CK 相比TDZ處理的株高度降低了61.26%。BMe與CK 處理無(wú)顯著差異。BMu處理的株高度最高，達(dá)到了6.33 mm，比最低的BMe＋TDZ處理多生長(zhǎng)4.39 mm。

表2 苔蘚株高度的方差分析

2.3 不同添加物對(duì)苔蘚株密度的影響

圖3為不同處理在60 d內(nèi)苔蘚株密度的變化情況。BMu處理在第15 d 觀測(cè)時(shí)株密度最大（2.44株／cm2），CK 最?。?.28 株／cm2）。至培育第30 d，BMe＋DZ 處理株密度最大，達(dá)到4.60 株／cm2，而CK 與TDZ處理幾乎無(wú)變化。第30 d至第45 d期間，BMu處理株密度由2.90株／cm2增至14.95株／cm2，遠(yuǎn)高于其他處理。此外，BMe處理株密度小于BMu處理，但添加TDZ 后二者大小關(guān)系相反，表明TDZ與BMe間存在一定的相互作用。

圖3 苔蘚結(jié)皮株密度變化情況

巴特萊特齊性檢驗(yàn)p 值為0.20，滿足方差分析的前提假設(shè)。方差分析結(jié)果表明（見(jiàn)表3），芽孢桿菌及二者交互作用均對(duì)苔蘚結(jié)皮株密度有極顯著（p＜0.001）的影響，其F 值分別為16.90和10.30。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的影響不顯著（F＝2.67，p＝0.11）。

培育60 d 后，各處理株密度由小到大分別為：CK（1.61 株／cm2）＝TDZ（2.19 株／cm2）＜BMu＋TDZ（5.91株／cm2）＝BMe（7.37 株／cm2）＜BMe＋TDZ（11.04 株／cm2）＜BMu（17.05 株／cm2）?？梢园l(fā)現(xiàn)，除TDZ處理外其他4種處理株密度均顯著大于CK 組。相比BMu處理，BMu＋TDZ的株密度減少了65.34%，差異達(dá)到極顯著水平，表明1 mg／L濃度TDZ會(huì)減弱BMu的正效應(yīng)。與之相反，BMe＋TDZ處理較BMe處理株密度增加49.73%，表明施加TDZ強(qiáng)化了BMe對(duì)苔蘚株密度生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。而B(niǎo)Me＋TDZ與BMu＋TDZ處理株密度均顯著高于TDZ處理，表明芽孢桿菌能促進(jìn)TDZ在苔蘚株密度方面的增長(zhǎng)。

表3 苔蘚結(jié)皮株密度的方差分析

3 討論

3.1 芽孢桿菌對(duì)苔蘚結(jié)皮的影響

芽孢桿菌顯著地促進(jìn)了溫室苔蘚結(jié)皮的生長(zhǎng)發(fā)育。具體表現(xiàn)為：膠質(zhì)芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌都能顯著提高苔蘚株密度，前者還能促進(jìn)苔蘚覆蓋度、株高度的發(fā)育。這可能與芽孢桿菌自身特性及適宜的培育方式有關(guān)。在培養(yǎng)期內(nèi)定期噴灑Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液勢(shì)必會(huì)使添加的芽孢桿菌大量繁殖，其解體后自身累積的營(yíng)養(yǎng)元素通常以可溶性的陽(yáng)離子狀態(tài)存在［17］，而本次培育過(guò)程中定期補(bǔ)水也有利于這些離子持續(xù)溶解，延長(zhǎng)了苔蘚植物可吸收的時(shí)間。此外，本試驗(yàn)所使用的培育基質(zhì)泥炭土富含大量的營(yíng)養(yǎng)元素，而芽孢桿菌作為根際微生物的一種，被證實(shí)夠通過(guò)其在生命活動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的多種代謝物質(zhì)將土壤中的礦物鉀、固定鉀溶解為植物可直接吸收利用的形態(tài)［18］。因此推斷可能是施加的芽孢桿菌將泥炭土中的營(yíng)養(yǎng)元素活化，轉(zhuǎn)化為可供苔蘚植物直接吸收的形態(tài)。

本試驗(yàn)中，巨大芽孢桿菌對(duì)苔蘚結(jié)皮的影響并不全都是積極的：其顯著地降低了苔蘚的株高度，對(duì)蓋度的影響也不顯著。這與膠質(zhì)芽孢桿菌的效應(yīng)截然不同，具體原因可能由以下兩方面所致。首先，兩種微生物的特性有所差異。膠質(zhì)芽孢桿菌能夠通過(guò)分泌胞外代謝物、固氮作用來(lái)促進(jìn)作物生長(zhǎng)與抗病抗旱能力［19］，而巨大芽孢桿菌的研究中未有類(lèi)似的結(jié)論。丁玲等［20］研究膠質(zhì)／巨大芽孢桿菌對(duì)印度芥菜生長(zhǎng)的影響，其結(jié)果與本研究一致：相同濃度下膠質(zhì)芽孢桿菌對(duì)印度芥菜生長(zhǎng)的促進(jìn)作用顯著優(yōu)于巨大芽孢桿菌。其次，高濃度施用微生物會(huì)對(duì)植物起抑制作用。柳艷艷等［21］研究表明，0.1 g／kg 濃度巨大芽孢桿菌對(duì)油菜產(chǎn)量和根系生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用，但1 g／kg濃度時(shí)會(huì)抑制油菜生長(zhǎng)。這與本研究結(jié)果一致：施用1 g／kg巨大芽孢桿菌后，苔蘚的株高度顯著小于未施用巨大芽孢桿菌處理。這種微生物固有屬性的差異和施用量的不同可能是添加膠質(zhì)芽孢桿菌的處理在苔蘚覆蓋度、株高度方面優(yōu)于添加巨大芽孢桿菌處理的原因。

3.2 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)苔蘚結(jié)皮的影響

本試驗(yàn)所選擇的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑TDZ對(duì)苔蘚結(jié)皮表現(xiàn)出顯著的負(fù)效應(yīng)：除與巨大芽孢桿菌共同添加能顯著增大苔蘚株密度外，其余含TDZ 的處理均顯著減小了苔蘚的蓋度、株高度與株密度。這與Yang等［22］的結(jié)論相反，該研究同樣施用1mg／L 的TDZ，培育結(jié)束后顯著增大了苔蘚的覆蓋度、株高度、株密度及生物量。這可能與TDZ的施用濃度有關(guān)。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能對(duì)苔蘚結(jié)皮生長(zhǎng)發(fā)育有顯著的影響［23］，但生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的施用濃度會(huì)顯著改變其對(duì)苔蘚的效應(yīng)。研究表明，4-D，KT，IBA，NAA，TDZ和6BA 這4種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑隨著施用濃度的提高對(duì)苔蘚結(jié)皮生長(zhǎng)發(fā)育的影響均表現(xiàn)出由促進(jìn)轉(zhuǎn)為抑制的趨勢(shì)［15］。駱華容等［24］研究有類(lèi)似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)施用不同濃度的植物激素對(duì)苔蘚生長(zhǎng)的影響有顯著不同，高濃度可能會(huì)抑制苔蘚正常生長(zhǎng)發(fā)育。其他植物的研究中也有類(lèi)似的結(jié)論：0.02 mg／L 的TDZ施用量對(duì)毛萼紫薇種子出苗率提高最大，但隨著濃度升高反而會(huì)降低種子出苗率［25］。

此外，環(huán)境條件可能會(huì)間接改變TDZ對(duì)苔蘚結(jié)皮影響的效果。TDZ在一定情況下會(huì)造成植物體內(nèi)礦物質(zhì)或其他代謝物質(zhì)的積累超過(guò)正常水平，使植物進(jìn)入了逆境脅迫狀態(tài)導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育受阻［26］。本研究的培養(yǎng)期處在在8—9月，溫室環(huán)境溫度高，水分蒸發(fā)速度很快快，還進(jìn)行定期補(bǔ)水。這種干濕交替可能造成接種盤(pán)內(nèi)TDZ濃度期性的上升與下降，若此過(guò)程中TDZ濃度超過(guò)苔蘚的適用范圍，則可能導(dǎo)致上述研究中的逆境脅迫現(xiàn)象，造成施加TDZ的處理其生長(zhǎng)狀況顯著低于未施加的處理。因此，本研究的結(jié)果僅適用于夏季溫室特定的光溫水條件，在其他培養(yǎng)環(huán)境下植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)苔蘚生長(zhǎng)發(fā)育的影響程度尚需更多針對(duì)性的研究。

3.3 苔蘚結(jié)皮種源擴(kuò)繁技術(shù)的優(yōu)化

本研究驗(yàn)證了芽孢桿菌以及芽孢桿菌＋TDZ對(duì)黃土區(qū)優(yōu)勢(shì)苔蘚種培育有明顯的促進(jìn)作用，但有關(guān)芽孢桿菌與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的水平設(shè)置存在不足。今后尚需從不同濃度、不同菌種等方面做進(jìn)一步設(shè)計(jì)，觀測(cè)相關(guān)的生理化學(xué)指標(biāo)，探討相關(guān)作用的機(jī)理機(jī)制，最終形成一套完善的種源擴(kuò)繁的生物添加技術(shù)。

楊永勝等［27］在人工氣候室培育苔蘚結(jié)皮，各處理培育60 d后苔蘚覆蓋度、株高度普遍高于本試驗(yàn)，這種差異可能與培育期間的溫度有關(guān)。適宜苔蘚生長(zhǎng)的大致溫度范圍在15 ℃～30 ℃［28-29］。本試驗(yàn)培育期為8—9月，當(dāng)?shù)厥彝鉁囟乳L(zhǎng)期處于30 ℃以上，盡管采取了遮蔭與開(kāi)啟濕簾等方法，但由于所使用溫室面積較?。?8.8 m2），濕簾的調(diào)控能力有限，溫室內(nèi)溫度在正午仍長(zhǎng)期處于30～35 ℃，水分蒸發(fā)極為迅速。而楊永勝試驗(yàn)設(shè)置溫度為20／10℃（晝／夜）。在高溫環(huán)境下進(jìn)行定期的補(bǔ)水與施加營(yíng)養(yǎng)液，可能會(huì)導(dǎo)致苔蘚發(fā)育過(guò)程中頻繁發(fā)生失水—復(fù)水過(guò)程，阻礙其正常生理活動(dòng)的持續(xù)有效進(jìn)行［30］。因此，后續(xù)研究應(yīng)避開(kāi)高溫強(qiáng)光照的夏季，并選擇更大面積的溫室，確保培育環(huán)境均質(zhì)且穩(wěn)定。

4 結(jié)論

本研究表明，在溫室條件下，膠質(zhì)芽孢桿菌顯著促進(jìn)了苔蘚結(jié)皮覆蓋度、株高度與株密度的增長(zhǎng)，巨大芽孢桿菌顯著促進(jìn)了苔蘚結(jié)皮株密度的增長(zhǎng)，而1 g／kg濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑TDZ 則表現(xiàn)出顯著的負(fù)作用。我們認(rèn)為，構(gòu)建穩(wěn)定、適生的環(huán)境條件，并適量添加芽孢桿菌與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，能夠?qū)崿F(xiàn)苔蘚結(jié)皮種源的快速擴(kuò)繁。