張翠綿，賈楠，馬佳，彭杰麗，李書鴻，胡棟，魏曉燕，王春燕，王占武*

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，河北省植物轉(zhuǎn)基因中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050051；2.河北三農(nóng)農(nóng)用化工有限公司，河北 石家莊 050051）

隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，蔬菜產(chǎn)業(yè)正朝著專業(yè)化、集約化方向發(fā)展。然而，連年種植導(dǎo)致蔬菜連作障礙問題日漸突出，尤其是在設(shè)施栽培中，蔬菜復(fù)種指數(shù)高，農(nóng)藥和化肥的使用頻率和投入量增加現(xiàn)象普遍，加速了連作障礙的產(chǎn)生。連作障礙主要包括土壤次生鹽漬化、病原菌增多、根際毒素積累等，這些問題往往同時(shí)存在，交互影響[1～3]，因此采用單一防治方法效果往往不理想。

目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)連作障礙的研究雖然較多[4～7]，但由于其發(fā)生原因復(fù)雜和地域的差異，因此，截至目前仍然尚未發(fā)現(xiàn)防控效果穩(wěn)定的方法。根際微生物是修復(fù)退化土壤最活躍的組分，但應(yīng)用僅具有促生、防病或抗逆等1～2種功能的菌株進(jìn)行修復(fù)效果較差且不穩(wěn)定，因此，亟需篩選具有改善根際營(yíng)養(yǎng)環(huán)境、拮抗病原菌、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和提高植株抗性等多種功能的菌株。

芽孢桿菌（Bacillus spp．）廣泛存在于植物根際土壤，有些菌株能夠產(chǎn)生拮抗物質(zhì)、促生物質(zhì)，具有繁殖快、生長(zhǎng)能力強(qiáng)、可產(chǎn)生休眠體、易產(chǎn)業(yè)化等特點(diǎn)[8，9]，是微生物肥料等產(chǎn)品開發(fā)的重要微生物類群。以從番茄根際、根表篩選出有促生和抑菌效應(yīng)的芽孢桿菌為目標(biāo)，采用根際養(yǎng)分利用、促生、抗病等層級(jí)篩選方法，初步篩選同時(shí)具有上述功能的芽孢桿菌菌株，并通過盆栽番茄試驗(yàn)對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株的促生效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，不僅可為克服番茄連作障礙植物根際促生菌（PGPR）接種劑的研制提供良好的菌種資源，還可為進(jìn)一步探索PGPR對(duì)蔬菜的促長(zhǎng)機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 根際土壤 從河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所蔬菜大棚以及石家莊市藁城區(qū)和無(wú)極縣的番茄基地（常年連作），挖出整株帶土的健康番茄幼苗，將根部土壤抖落后裝入無(wú)菌紙袋，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 菌株分離采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）[10]；植物病原真菌的培養(yǎng)和對(duì)峙試驗(yàn)采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）[11]；解（溶）磷功能的測(cè)定采用無(wú)機(jī)、有機(jī)磷培養(yǎng)基[12，13]；菌株固氮能力的測(cè)定采用Ashby液體培養(yǎng)基[14]；產(chǎn)鐵載體能力的定性檢測(cè)采用CAS培養(yǎng)基[15]；產(chǎn)吲哚乙酸（IAA） 功能的定性檢測(cè)采用IAA培養(yǎng)基[16]。菌種鑒定用培養(yǎng)基參照宋大新等[17]的方法配制。

1.1.3 番茄 供試番茄品種為冀番135，由河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。

1.1.4 病原真菌指示菌 供試病原真菌指示菌有番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）、茄子早疫病菌（Alternaria solan）i、番茄絲核菌 （Rhizoctonia solan）i、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、辣椒腐霉菌（Pythium aphanidermatum） 和黃瓜鐮刀菌 （Fusarium moniliforme），均由河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所微生物室保存。

1.1.5 盆栽基質(zhì) 盆栽試驗(yàn)土壤采自大田，用孔徑為5 mm的篩子過篩后與蛭石按照體積比2∶1混合均勻，裝入直徑25 cm、高17 cm的塑料盆中備用，裝入量約 2.0 kg/盆。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 番茄幼苗根際菌種的分離與純化 將番茄幼苗根際土用無(wú)菌刷輕輕刷下，連同已用無(wú)菌水充分消毒的幼苗根一起放入無(wú)菌水中充分振搖，系列稀釋，涂布于牛肉膏蛋白胨平板上。在30℃下培養(yǎng)2 d，選取產(chǎn)芽孢的菌落，純化后得到斜面菌株，保存于4℃冰箱。

1.2.2 優(yōu)勢(shì)菌株的篩選 對(duì)經(jīng)分離、純化后得到的產(chǎn)芽孢細(xì)菌，進(jìn)行解（溶）磷、固氮、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA能力的定性檢測(cè)，據(jù)此篩選出綜合能力較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)菌株。

1.2.2.1 解（溶） 磷能力的確定。將待測(cè)菌株點(diǎn)植于有機(jī)磷培養(yǎng)基及無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中，點(diǎn)植數(shù)量6個(gè)/皿，3次重復(fù)，在30℃下培養(yǎng)48 h。測(cè)定溶磷圈直徑（HD） 和菌落直徑（CD）。根據(jù)各菌株的HD/CD，確定其溶磷能力的強(qiáng)弱。

1.2.2.2 固氮能力的確定。將待測(cè)菌株接入Ashby液體培養(yǎng)基中，在30℃、120 rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)3 d。然后，將能在Ashbg液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌株再次轉(zhuǎn)接到Ashby液體培養(yǎng)基中，重復(fù)3次，選出最終生長(zhǎng)的細(xì)菌即為有固氮能力的細(xì)菌。測(cè)定波長(zhǎng)620 nm處的吸光度值（OD）。根據(jù)各菌株的OD620，確定其固氮能力的強(qiáng)弱。

1.2.2.3 產(chǎn)鐵載體能力的確定。將待測(cè)菌株點(diǎn)植于CAS檢測(cè)平板上，30℃恒溫倒置培養(yǎng)，點(diǎn)植數(shù)量6個(gè)/皿，3次重復(fù)，在30℃下培養(yǎng)48 h。觀測(cè)經(jīng)過培養(yǎng)的CAS檢測(cè)平板，分泌鐵載體的細(xì)菌菌落周圍會(huì)出現(xiàn)明顯的橙色鐵載體暈圈。通過比較平板上橙色透明圈的大小，來確定各菌株產(chǎn)鐵載體能力的強(qiáng)弱。

1.2.2.4 產(chǎn)IAA能力的確定。試驗(yàn)樣品為待測(cè)菌株發(fā)酵液；對(duì)照樣品有3個(gè)，分別為含有100 mg/L色氨酸的KingB空白培養(yǎng)基、50 mg/L IAA溶液、含有50 mg/L IAA的KingB培養(yǎng)基。吸取0.5 mL待測(cè)樣品于1.5 mL離心管中，加入等體積的Salkouski試劑，置于暗處反應(yīng)15 min。根據(jù)測(cè)試樣品溶液顯色的深淺，判斷其產(chǎn)IAA能力的強(qiáng)弱。

1.2.3 最優(yōu)菌株抑菌能力的確定 以番茄灰霉病菌、茄子早疫病菌、番茄絲核病菌、棉花枯萎病菌、黃瓜鐮刀菌、辣椒腐霉6種病原真菌為靶標(biāo)，采用改良平板對(duì)峙法[11]，對(duì)篩選出的優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行抑菌效果測(cè)定，以篩選出更優(yōu)的菌株。將直徑5 mm的指示病原真菌菌餅接于PDA平板中央，與之相距3 cm兩側(cè)接活化的待測(cè)菌株，每處理3次重復(fù)，以只接種病原真菌的培養(yǎng)基為對(duì)照，在30℃下培養(yǎng)3～5 d。待對(duì)照病原真菌長(zhǎng)滿平板時(shí)，測(cè)定菌株與各指示菌間拮抗帶的寬度。

1.2.4 最優(yōu)菌株促長(zhǎng)效果的確定 將篩選出的最優(yōu)菌株轉(zhuǎn)接至NA無(wú)菌液體培養(yǎng)基中，在30℃下振蕩培養(yǎng)48 h，4 000 rpm離心10 min，去除上清液，無(wú)菌水重懸菌體備用。

挑選飽滿整齊一致的番茄種子，用溫湯法滅菌，催芽后播種于56孔育苗缽（育苗基質(zhì)由蛭石和草炭按體積比1∶2混合而成）中，溫室培育，待番茄幼苗長(zhǎng)至3葉1心時(shí)移栽定植。

選擇長(zhǎng)勢(shì)基本一致的健壯番茄苗定植于塑料盆中，待定植苗生長(zhǎng)5 d后，采用灌根法接種優(yōu)勢(shì)菌株，菌液濃度設(shè)稀釋100倍 （G81-100）、稀釋 200倍（G81-200） 和稀釋300倍（G81-300） 3個(gè)處理，以無(wú)菌水灌根為對(duì)照（CK）。每處理10盆，等量（50mL）灌根后于溫室中培育。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 菌株特征 參照《微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程》[17]對(duì)菌株的形態(tài)和生理生化特征進(jìn)行鑒定。

1.3.2 菌株分子學(xué)鑒定 將優(yōu)勢(shì)菌株用NA液體培養(yǎng)液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體。細(xì)菌總DNA提取采用SDS-CTAB法。用27F（AGAGTTTGATC CTGGCTCAG） 和 1492R （GGTTACCTTGTTACGACTT）為引物PCR擴(kuò)增菌株的16S rDNA基因序列。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，56℃退火40 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測(cè)序，將測(cè)得的16SrDNA序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)上采用Blast程序進(jìn)行同源性比較分析。

1.3.3 番茄生物學(xué)特征 待番茄幼苗長(zhǎng)至4葉1心時(shí)，測(cè)定量試驗(yàn)組和對(duì)照組番茄植株的株高、鮮重、葉面積、主根長(zhǎng)、毛細(xì)根數(shù)量。然后，于烘箱中105℃殺青15 min，75℃烘干至恒重，稱量地上部干重和根系干重。

1.3.4 番茄葉片葉綠素含量 待番茄幼苗長(zhǎng)至4葉1心時(shí)，每盆均選取頂部第2片葉子，采用浸提法[18]測(cè)定葉片的葉綠素含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄幼苗根際細(xì)菌的分離

采用平板稀釋法，經(jīng)分離、純化后共得到產(chǎn)芽孢細(xì)菌11株。進(jìn)行解磷、固氮、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA能力的定性檢測(cè)后，篩選出優(yōu)勢(shì)菌3株，編號(hào)為G81、G92和G99（表1）。

表1 優(yōu)勢(shì)菌株功能檢測(cè)結(jié)果Table 1 Functional test results of dominant strains

2.2 優(yōu)勢(shì)菌株抑菌能力的比較

采用對(duì)峙試驗(yàn)對(duì)3株優(yōu)勢(shì)菌株的抑菌能力進(jìn)行鑒定。結(jié)果（表2） 顯示，G81、G92和G99菌株對(duì)供試的6種病原真菌都具有明顯的抑制作用，抑菌帶寬度為5.9～9.3 mm，其中G81菌株的整體抑菌效果最佳。G81菌株對(duì)茄子早疫病菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬為9.3 mm，指標(biāo)值＞其他2個(gè)菌株，且與G99菌株差異達(dá)到了顯著水平；對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用次之，抑菌帶寬為8.6 mm，指標(biāo)值與其他2個(gè)菌株差異不顯著；對(duì)辣椒腐霉的抑制作用也較強(qiáng)，抑菌帶寬為8.1 mm，指標(biāo)值顯著＞其他2個(gè)菌株；對(duì)番茄絲核病菌、棉花枯萎病菌和黃瓜鐮刀菌的抑菌帶寬均為7.0 mm左右，除對(duì)番茄絲核病菌的抑菌帶寬與G92菌株差異不顯著外，其他指標(biāo)值均顯著＞其他2個(gè)菌株。綜上分析，篩選出G81為最優(yōu)菌株。

表2 優(yōu)勢(shì)菌株對(duì)病原真菌的抑菌帶寬Table 2 Antimicrobial bandwidth of dominant strains to pathogenic bacteria （mm）

2.3 最優(yōu)菌株G81的鑒定

2.3.1 形態(tài)及生理生化特征 經(jīng)平板劃線觀察G81的形態(tài)特征，結(jié)果（表3） 顯示，G81菌落表面粗糙，中央隆起、有褶皺，灰白色，無(wú)光澤，不透明。生理生化測(cè)試結(jié)果顯示，G81能利用葡萄糖、木糖醇、淀粉和明膠等多種碳源。根據(jù)以上特征，可初步確定G81為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

表3 G81菌株的形態(tài)和生理生化特征Table 3 Morphological，physiological and biochemical characteristics of strain G81

2.3.2 16S rDNA的序列比對(duì)與分析 為進(jìn)一步確定G81菌株的分類學(xué)地位，以G81菌株的總DNA為模板，27F/1492R為引物，擴(kuò)增出了長(zhǎng)約1.5 kb的16S rDNA，測(cè)序結(jié)果通過NCBI-Blast比對(duì)分析，與枯草芽孢桿菌的16S rDNA序列同源性達(dá)到100%。同時(shí)結(jié)合其表型特征，最終確定G81菌株為枯草芽孢桿菌。

2.4 優(yōu)勢(shì)菌株G81的盆栽促長(zhǎng)效果

2.4.1 對(duì)番茄幼苗生物量的影響 G81對(duì)番茄根系和莖葉具有協(xié)同促長(zhǎng)作用，以稀釋200倍處理促生效果最佳，各項(xiàng)指標(biāo)值均較CK提高30%以上，毛細(xì)根數(shù)量增加2倍以上，差異均達(dá)到了極顯著水平（表4）。即G81菌株稀釋200倍處理可極顯著促進(jìn)番茄地下部和地上部的生長(zhǎng)，改善根系結(jié)構(gòu)，提高植株對(duì)養(yǎng)分的吸收能力，為植株系統(tǒng)抗性的提高奠定了基礎(chǔ)。

2.4.2 對(duì)葉片葉綠素含量的影響 G81可顯著提高番茄葉片的葉綠素含量，以稀釋200倍處理效果最佳，各指標(biāo)值均顯著高于其他處理，其中葉綠素a、b含量分別較CK提高了2.68倍和2.43倍（表5）。稀釋100倍與稀釋300倍處理的番茄葉片葉綠素含量差異不顯著，但均顯著＞CK，其中葉綠素a含量分別較CK提高了1.83倍和1.81倍，葉綠素b含量分別提高了1.09倍和1.36倍。番茄植株葉片葉綠素含量的提高可能與G81菌株的促生長(zhǎng)作用有關(guān)。

表4 不同處理對(duì)苗期番茄生物學(xué)特征的影響Table 4 Effects of different treatments on biological characteristics of tomato at seedling stage

表5 不同處理對(duì)番茄葉綠素含量的影響Table 5 Effects of different treatments on chlorophyll content of tomato

3 結(jié)論與討論

根際微生物在植物根際代謝旺盛，可分泌出促進(jìn)植物生長(zhǎng)的多種酶類等物質(zhì)。根際微生物通過分泌鐵載體，可為寄主植物提供鐵元素，進(jìn)而抑制有害微生物的生長(zhǎng)和繁殖；通過分泌IAA，直接參與植物的生長(zhǎng)，有利于植物地上部和根部的生長(zhǎng)；通過改變植物根際微環(huán)境，活化土壤中的難溶性磷，改善植物的磷營(yíng)養(yǎng)狀況[19]。榮良燕等[20]分離出的產(chǎn)鐵載體PGPR菌LHS11對(duì)黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）抑制率達(dá)80%以上。李引等[21]分離篩選出的花生根際益生菌既產(chǎn)IAA又具有解磷能力?？蒂O軍等[22]從小麥、油菜等根際土壤中分離的菌株RBP1，在培養(yǎng)基中利用鉬銻抗比色法測(cè)定該菌的最高含磷量為106.75 mg/L。

PGPR的促生長(zhǎng)效應(yīng)一般是通過其產(chǎn)IAA、產(chǎn)嗜鐵素、溶磷等多種功能共同作用實(shí)現(xiàn)的[23～26]，尤其是在植物幼苗期。劉秀花等[25]對(duì)小麥根際促生菌進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種促生菌株B5后，小麥幼苗的株高、鮮重、根長(zhǎng)分別較CK增加了17.2%、21.0%和20.5%；段秀梅等[26]對(duì)玉米、樹莓等的根際土壤促生菌進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在玉米上混接菌株P(guān)9和P28，玉米苗期的株高和干重分別較CK增加了35.5%和28.9%。

目前對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有重要作用的根際促生菌株，不僅要具有促生長(zhǎng)作用，還要具有抑制病原菌的能力[27]。孫廣正等[28]發(fā)現(xiàn)，根際促生菌不僅能夠促進(jìn)油菜生長(zhǎng)，而且對(duì)菌核病菌和立枯絲核菌具有良好的抑制效果；王靜等[29]發(fā)現(xiàn)，短小芽胞桿菌AR03菌株的菌懸液對(duì)煙草炭疽病的防治效果為83.03%，可顯著抑制煙草炭疽病的發(fā)生。

本研究條件下，從番茄根際土壤中分離出了11株同時(shí)具有溶磷和產(chǎn)IAA等能力的功能菌，其中G81、G92和G99具有解磷、固氮、產(chǎn)鐵、產(chǎn)IAA的功能；采用平板對(duì)峙法測(cè)定了3個(gè)菌株對(duì)番茄灰霉病菌、茄子早疫病菌、番茄絲核病菌、棉花枯萎病菌、黃瓜鐮刀菌和辣椒腐霉的抑制效果，結(jié)果顯示，3個(gè)菌株的抑菌作用均較為明顯，抑菌帶寬度為5.9～9.3 mm，其中G81對(duì)6種病原真菌的抑菌效果最佳。采用盆栽方法對(duì)篩選出的優(yōu)勢(shì)菌株G81進(jìn)行番茄促生長(zhǎng)效應(yīng)測(cè)定，結(jié)果顯示，接種G81的番茄幼苗各項(xiàng)生理指標(biāo)均明顯高于對(duì)照?？蛇M(jìn)一步對(duì)G81菌株進(jìn)行研發(fā)，以制備促生菌劑。

植物根際細(xì)菌對(duì)植物的作用，與植物種類和菌種代謝產(chǎn)物的濃度有關(guān)[30]。G81稀釋200倍處理的番茄幼苗株高、主根長(zhǎng)、整株鮮重、地上部干重、根系干重和葉綠素a+b含量分別較CK增加了55.6%、30.4%、39.4%、38.7%、33.3%和2.61倍，效果顯著優(yōu)于稀釋100倍和300倍處理，但其田間應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，為了后期更好地應(yīng)用和推廣根際促生菌株，采用熒光顯微鏡定期觀測(cè)優(yōu)勢(shì)菌株在土壤中的定殖能力及變化動(dòng)態(tài)試驗(yàn)正在進(jìn)行中。