張翠綿，賈楠，馬佳，彭杰麗，李書鴻，胡棟，魏曉燕，王春燕，王占武*

（1.河北省農(nóng)林科學院遺傳生理研究所，河北省植物轉基因中心重點實驗室，河北 石家莊 050051；2.河北三農(nóng)農(nóng)用化工有限公司，河北 石家莊 050051）

隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結構的調整，蔬菜產(chǎn)業(yè)正朝著專業(yè)化、集約化方向發(fā)展。然而，連年種植導致蔬菜連作障礙問題日漸突出，尤其是在設施栽培中，蔬菜復種指數(shù)高，農(nóng)藥和化肥的使用頻率和投入量增加現(xiàn)象普遍，加速了連作障礙的產(chǎn)生。連作障礙主要包括土壤次生鹽漬化、病原菌增多、根際毒素積累等，這些問題往往同時存在，交互影響[1～3]，因此采用單一防治方法效果往往不理想。

目前，國內外針對連作障礙的研究雖然較多[4～7]，但由于其發(fā)生原因復雜和地域的差異，因此，截至目前仍然尚未發(fā)現(xiàn)防控效果穩(wěn)定的方法。根際微生物是修復退化土壤最活躍的組分，但應用僅具有促生、防病或抗逆等1～2種功能的菌株進行修復效果較差且不穩(wěn)定，因此，亟需篩選具有改善根際營養(yǎng)環(huán)境、拮抗病原菌、促進植物生長和提高植株抗性等多種功能的菌株。

芽孢桿菌（Bacillus spp．）廣泛存在于植物根際土壤，有些菌株能夠產(chǎn)生拮抗物質、促生物質，具有繁殖快、生長能力強、可產(chǎn)生休眠體、易產(chǎn)業(yè)化等特點[8，9]，是微生物肥料等產(chǎn)品開發(fā)的重要微生物類群。以從番茄根際、根表篩選出有促生和抑菌效應的芽孢桿菌為目標，采用根際養(yǎng)分利用、促生、抗病等層級篩選方法，初步篩選同時具有上述功能的芽孢桿菌菌株，并通過盆栽番茄試驗對優(yōu)勢菌株的促生效果進行評價，不僅可為克服番茄連作障礙植物根際促生菌（PGPR）接種劑的研制提供良好的菌種資源，還可為進一步探索PGPR對蔬菜的促長機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 根際土壤 從河北省農(nóng)林科學院經(jīng)濟作物研究所蔬菜大棚以及石家莊市藁城區(qū)和無極縣的番茄基地（常年連作），挖出整株帶土的健康番茄幼苗，將根部土壤抖落后裝入無菌紙袋，帶回實驗室備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 菌株分離采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）[10]；植物病原真菌的培養(yǎng)和對峙試驗采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）[11]；解（溶）磷功能的測定采用無機、有機磷培養(yǎng)基[12，13]；菌株固氮能力的測定采用Ashby液體培養(yǎng)基[14]；產(chǎn)鐵載體能力的定性檢測采用CAS培養(yǎng)基[15]；產(chǎn)吲哚乙酸（IAA） 功能的定性檢測采用IAA培養(yǎng)基[16]。菌種鑒定用培養(yǎng)基參照宋大新等[17]的方法配制。

1.1.3 番茄 供試番茄品種為冀番135，由河北省農(nóng)林科學院經(jīng)濟作物研究所提供。

1.1.4 病原真菌指示菌 供試病原真菌指示菌有番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）、茄子早疫病菌（Alternaria solan）i、番茄絲核菌 （Rhizoctonia solan）i、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、辣椒腐霉菌（Pythium aphanidermatum） 和黃瓜鐮刀菌 （Fusarium moniliforme），均由河北省農(nóng)林科學院遺傳生理研究所微生物室保存。

1.1.5 盆栽基質 盆栽試驗土壤采自大田，用孔徑為5 mm的篩子過篩后與蛭石按照體積比2∶1混合均勻，裝入直徑25 cm、高17 cm的塑料盆中備用，裝入量約 2.0 kg/盆。

1.2 試驗方法

1.2.1 番茄幼苗根際菌種的分離與純化 將番茄幼苗根際土用無菌刷輕輕刷下，連同已用無菌水充分消毒的幼苗根一起放入無菌水中充分振搖，系列稀釋，涂布于牛肉膏蛋白胨平板上。在30℃下培養(yǎng)2 d，選取產(chǎn)芽孢的菌落，純化后得到斜面菌株，保存于4℃冰箱。

1.2.2 優(yōu)勢菌株的篩選 對經(jīng)分離、純化后得到的產(chǎn)芽孢細菌，進行解（溶）磷、固氮、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA能力的定性檢測，據(jù)此篩選出綜合能力較強的優(yōu)勢菌株。

1.2.2.1 解（溶） 磷能力的確定。將待測菌株點植于有機磷培養(yǎng)基及無機磷培養(yǎng)基中，點植數(shù)量6個/皿，3次重復，在30℃下培養(yǎng)48 h。測定溶磷圈直徑（HD） 和菌落直徑（CD）。根據(jù)各菌株的HD/CD，確定其溶磷能力的強弱。

1.2.2.2 固氮能力的確定。將待測菌株接入Ashby液體培養(yǎng)基中，在30℃、120 rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)3 d。然后，將能在Ashbg液體培養(yǎng)基中生長的菌株再次轉接到Ashby液體培養(yǎng)基中，重復3次，選出最終生長的細菌即為有固氮能力的細菌。測定波長620 nm處的吸光度值（OD）。根據(jù)各菌株的OD620，確定其固氮能力的強弱。

1.2.2.3 產(chǎn)鐵載體能力的確定。將待測菌株點植于CAS檢測平板上，30℃恒溫倒置培養(yǎng)，點植數(shù)量6個/皿，3次重復，在30℃下培養(yǎng)48 h。觀測經(jīng)過培養(yǎng)的CAS檢測平板，分泌鐵載體的細菌菌落周圍會出現(xiàn)明顯的橙色鐵載體暈圈。通過比較平板上橙色透明圈的大小，來確定各菌株產(chǎn)鐵載體能力的強弱。

1.2.2.4 產(chǎn)IAA能力的確定。試驗樣品為待測菌株發(fā)酵液；對照樣品有3個，分別為含有100 mg/L色氨酸的KingB空白培養(yǎng)基、50 mg/L IAA溶液、含有50 mg/L IAA的KingB培養(yǎng)基。吸取0.5 mL待測樣品于1.5 mL離心管中，加入等體積的Salkouski試劑，置于暗處反應15 min。根據(jù)測試樣品溶液顯色的深淺，判斷其產(chǎn)IAA能力的強弱。

1.2.3 最優(yōu)菌株抑菌能力的確定 以番茄灰霉病菌、茄子早疫病菌、番茄絲核病菌、棉花枯萎病菌、黃瓜鐮刀菌、辣椒腐霉6種病原真菌為靶標，采用改良平板對峙法[11]，對篩選出的優(yōu)勢菌株進行抑菌效果測定，以篩選出更優(yōu)的菌株。將直徑5 mm的指示病原真菌菌餅接于PDA平板中央，與之相距3 cm兩側接活化的待測菌株，每處理3次重復，以只接種病原真菌的培養(yǎng)基為對照，在30℃下培養(yǎng)3～5 d。待對照病原真菌長滿平板時，測定菌株與各指示菌間拮抗帶的寬度。

1.2.4 最優(yōu)菌株促長效果的確定 將篩選出的最優(yōu)菌株轉接至NA無菌液體培養(yǎng)基中，在30℃下振蕩培養(yǎng)48 h，4 000 rpm離心10 min，去除上清液，無菌水重懸菌體備用。

挑選飽滿整齊一致的番茄種子，用溫湯法滅菌，催芽后播種于56孔育苗缽（育苗基質由蛭石和草炭按體積比1∶2混合而成）中，溫室培育，待番茄幼苗長至3葉1心時移栽定植。

選擇長勢基本一致的健壯番茄苗定植于塑料盆中，待定植苗生長5 d后，采用灌根法接種優(yōu)勢菌株，菌液濃度設稀釋100倍 （G81-100）、稀釋 200倍（G81-200） 和稀釋300倍（G81-300） 3個處理，以無菌水灌根為對照（CK）。每處理10盆，等量（50mL）灌根后于溫室中培育。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 菌株特征 參照《微生物實驗技術教程》[17]對菌株的形態(tài)和生理生化特征進行鑒定。

1.3.2 菌株分子學鑒定 將優(yōu)勢菌株用NA液體培養(yǎng)液培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體。細菌總DNA提取采用SDS-CTAB法。用27F（AGAGTTTGATC CTGGCTCAG） 和 1492R （GGTTACCTTGTTACGACTT）為引物PCR擴增菌株的16S rDNA基因序列。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性40 s，56℃退火40 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測序，將測得的16SrDNA序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫上采用Blast程序進行同源性比較分析。

1.3.3 番茄生物學特征 待番茄幼苗長至4葉1心時，測定量試驗組和對照組番茄植株的株高、鮮重、葉面積、主根長、毛細根數(shù)量。然后，于烘箱中105℃殺青15 min，75℃烘干至恒重，稱量地上部干重和根系干重。

1.3.4 番茄葉片葉綠素含量 待番茄幼苗長至4葉1心時，每盆均選取頂部第2片葉子，采用浸提法[18]測定葉片的葉綠素含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 番茄幼苗根際細菌的分離

采用平板稀釋法，經(jīng)分離、純化后共得到產(chǎn)芽孢細菌11株。進行解磷、固氮、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA能力的定性檢測后，篩選出優(yōu)勢菌3株，編號為G81、G92和G99（表1）。

表1 優(yōu)勢菌株功能檢測結果Table 1 Functional test results of dominant strains

2.2 優(yōu)勢菌株抑菌能力的比較

采用對峙試驗對3株優(yōu)勢菌株的抑菌能力進行鑒定。結果（表2） 顯示，G81、G92和G99菌株對供試的6種病原真菌都具有明顯的抑制作用，抑菌帶寬度為5.9～9.3 mm，其中G81菌株的整體抑菌效果最佳。G81菌株對茄子早疫病菌的抑制作用最強，抑菌帶寬為9.3 mm，指標值＞其他2個菌株，且與G99菌株差異達到了顯著水平；對番茄灰霉病菌的抑制作用次之，抑菌帶寬為8.6 mm，指標值與其他2個菌株差異不顯著；對辣椒腐霉的抑制作用也較強，抑菌帶寬為8.1 mm，指標值顯著＞其他2個菌株；對番茄絲核病菌、棉花枯萎病菌和黃瓜鐮刀菌的抑菌帶寬均為7.0 mm左右，除對番茄絲核病菌的抑菌帶寬與G92菌株差異不顯著外，其他指標值均顯著＞其他2個菌株。綜上分析，篩選出G81為最優(yōu)菌株。

表2 優(yōu)勢菌株對病原真菌的抑菌帶寬Table 2 Antimicrobial bandwidth of dominant strains to pathogenic bacteria （mm）

2.3 最優(yōu)菌株G81的鑒定

2.3.1 形態(tài)及生理生化特征 經(jīng)平板劃線觀察G81的形態(tài)特征，結果（表3） 顯示，G81菌落表面粗糙，中央隆起、有褶皺，灰白色，無光澤，不透明。生理生化測試結果顯示，G81能利用葡萄糖、木糖醇、淀粉和明膠等多種碳源。根據(jù)以上特征，可初步確定G81為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

表3 G81菌株的形態(tài)和生理生化特征Table 3 Morphological，physiological and biochemical characteristics of strain G81

2.3.2 16S rDNA的序列比對與分析 為進一步確定G81菌株的分類學地位，以G81菌株的總DNA為模板，27F/1492R為引物，擴增出了長約1.5 kb的16S rDNA，測序結果通過NCBI-Blast比對分析，與枯草芽孢桿菌的16S rDNA序列同源性達到100%。同時結合其表型特征，最終確定G81菌株為枯草芽孢桿菌。

2.4 優(yōu)勢菌株G81的盆栽促長效果

2.4.1 對番茄幼苗生物量的影響 G81對番茄根系和莖葉具有協(xié)同促長作用，以稀釋200倍處理促生效果最佳，各項指標值均較CK提高30%以上，毛細根數(shù)量增加2倍以上，差異均達到了極顯著水平（表4）。即G81菌株稀釋200倍處理可極顯著促進番茄地下部和地上部的生長，改善根系結構，提高植株對養(yǎng)分的吸收能力，為植株系統(tǒng)抗性的提高奠定了基礎。

2.4.2 對葉片葉綠素含量的影響 G81可顯著提高番茄葉片的葉綠素含量，以稀釋200倍處理效果最佳，各指標值均顯著高于其他處理，其中葉綠素a、b含量分別較CK提高了2.68倍和2.43倍（表5）。稀釋100倍與稀釋300倍處理的番茄葉片葉綠素含量差異不顯著，但均顯著＞CK，其中葉綠素a含量分別較CK提高了1.83倍和1.81倍，葉綠素b含量分別提高了1.09倍和1.36倍。番茄植株葉片葉綠素含量的提高可能與G81菌株的促生長作用有關。

表4 不同處理對苗期番茄生物學特征的影響Table 4 Effects of different treatments on biological characteristics of tomato at seedling stage

表5 不同處理對番茄葉綠素含量的影響Table 5 Effects of different treatments on chlorophyll content of tomato

3 結論與討論

根際微生物在植物根際代謝旺盛，可分泌出促進植物生長的多種酶類等物質。根際微生物通過分泌鐵載體，可為寄主植物提供鐵元素，進而抑制有害微生物的生長和繁殖；通過分泌IAA，直接參與植物的生長，有利于植物地上部和根部的生長；通過改變植物根際微環(huán)境，活化土壤中的難溶性磷，改善植物的磷營養(yǎng)狀況[19]。榮良燕等[20]分離出的產(chǎn)鐵載體PGPR菌LHS11對黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）抑制率達80%以上。李引等[21]分離篩選出的花生根際益生菌既產(chǎn)IAA又具有解磷能力?？蒂O軍等[22]從小麥、油菜等根際土壤中分離的菌株RBP1，在培養(yǎng)基中利用鉬銻抗比色法測定該菌的最高含磷量為106.75 mg/L。

PGPR的促生長效應一般是通過其產(chǎn)IAA、產(chǎn)嗜鐵素、溶磷等多種功能共同作用實現(xiàn)的[23～26]，尤其是在植物幼苗期。劉秀花等[25]對小麥根際促生菌進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)接種促生菌株B5后，小麥幼苗的株高、鮮重、根長分別較CK增加了17.2%、21.0%和20.5%；段秀梅等[26]對玉米、樹莓等的根際土壤促生菌進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)在玉米上混接菌株P9和P28，玉米苗期的株高和干重分別較CK增加了35.5%和28.9%。

目前對生產(chǎn)實踐具有重要作用的根際促生菌株，不僅要具有促生長作用，還要具有抑制病原菌的能力[27]。孫廣正等[28]發(fā)現(xiàn)，根際促生菌不僅能夠促進油菜生長，而且對菌核病菌和立枯絲核菌具有良好的抑制效果；王靜等[29]發(fā)現(xiàn)，短小芽胞桿菌AR03菌株的菌懸液對煙草炭疽病的防治效果為83.03%，可顯著抑制煙草炭疽病的發(fā)生。

本研究條件下，從番茄根際土壤中分離出了11株同時具有溶磷和產(chǎn)IAA等能力的功能菌，其中G81、G92和G99具有解磷、固氮、產(chǎn)鐵、產(chǎn)IAA的功能；采用平板對峙法測定了3個菌株對番茄灰霉病菌、茄子早疫病菌、番茄絲核病菌、棉花枯萎病菌、黃瓜鐮刀菌和辣椒腐霉的抑制效果，結果顯示，3個菌株的抑菌作用均較為明顯，抑菌帶寬度為5.9～9.3 mm，其中G81對6種病原真菌的抑菌效果最佳。采用盆栽方法對篩選出的優(yōu)勢菌株G81進行番茄促生長效應測定，結果顯示，接種G81的番茄幼苗各項生理指標均明顯高于對照?？蛇M一步對G81菌株進行研發(fā)，以制備促生菌劑。

植物根際細菌對植物的作用，與植物種類和菌種代謝產(chǎn)物的濃度有關[30]。G81稀釋200倍處理的番茄幼苗株高、主根長、整株鮮重、地上部干重、根系干重和葉綠素a+b含量分別較CK增加了55.6%、30.4%、39.4%、38.7%、33.3%和2.61倍，效果顯著優(yōu)于稀釋100倍和300倍處理，但其田間應用效果還有待進一步驗證。此外，為了后期更好地應用和推廣根際促生菌株，采用熒光顯微鏡定期觀測優(yōu)勢菌株在土壤中的定殖能力及變化動態(tài)試驗正在進行中。