龍旭 高靜 張光輝

摘 ?????要：對竹葉中的黃酮類化合物進(jìn)行提取、純化及抗氧化性能研究?？疾炝舜罂讟渲瑢χ袢~黃酮的吸附、解吸工藝參數(shù)，當(dāng)黃酮上樣量流速為1.0 mL/min，pH為5.0時，黃酮吸附率最高為80.13%。當(dāng)洗脫劑乙醇流速為1.5 mL/min，乙醇濃度為60%時，黃酮解吸率最佳為90.6%。竹葉黃酮在光照、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿條件下，自由基清除率下降明顯。

關(guān) ?鍵 ?詞：竹葉;黃酮;抗氧化

中圖分類號：R 284 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）02-0299-04

Abstract： The extraction， purification and antioxidation of the flavonoids from bamboo leaves were studied. The best conditions for adsorption and desorption of the flavonoids by macroporous resin were investigated. When the samples flow velocity was 1.0 mL/min and pH was 5.0， the highest adsorption amount of flavonoids was 80.13%. Meanwhile， the highest desorption amount was 90.6% when ethanol flow velocity was 1.5 mL/min and ethanol concentration was 60%. The test results of antioxidant activities showed that illumination， strong acid and alkali conditions made free radical scavenging rate of flavonoids markedly decrease.

Key words： Bamboo leaves; Flavonoids; Antioxidant

竹子是禾本科、竹亞科的多年生常綠植物，其種類較多，全世界約有70多屬，約1 200余種，總種植面積達(dá)2 100萬公頃[1]。竹葉在中國具有悠久的藥食使用歷史，竹葉黃酮是竹葉的主要功能物質(zhì)，具有顯著的降血脂、抗炎、抗突變、抗?jié)儭⒖咕?、抗癌活性、降血清膽固醇、抗氧化、抗病毒、抗衰老及抗疲勞等生理活性，是一種優(yōu)質(zhì)的天然活性產(chǎn)物[2-6]。因此，以竹葉作為原料提取黃酮類有效成分對我國竹資源的充分利用具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實意義。

竹葉黃酮具有抗氧化生物活性，本研究為了獲得有效利用竹葉中黃酮類物質(zhì)的途徑，擬通過熱回流提取、大孔樹脂純化后再考察竹葉黃酮體外抗氧化性能，為竹葉的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 ?實驗部分

1.1 ?實驗試劑與儀器

1.1.1 ?實驗試劑

竹葉（學(xué)校采摘），無水乙醇（AR，天津天力化學(xué)試劑有限公司），石油醚（AR，天津天力化學(xué)試劑有限公司），硝酸鋁（AR，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司），亞硝酸鈉（AR，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司），氫氧化鈉（AR，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC 98%，北京萬佳首化生物科技有限公司），1， 1-二苯基-2-苦肼基（DPPH，分析純，Sigma-Aldrich公司）。

1.1.2 ?實驗儀器

恒溫磁力攪拌器（HJ-3A），紫外-可見分光光度計（UV1102，日本島津），循環(huán)水多用真空泵（SHB-III），電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒），粉碎機(jī)（HX-200），電子分析天平，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Buchi R-210），恒溫振蕩器（THZ-82A）。

1.2 ?實驗步驟及表征

1.2.1 ?竹葉黃酮熱回流提取

新鮮竹葉用清水清洗干凈后在鼓風(fēng)干燥箱中于50 ℃干燥24 h，再用粉碎機(jī)粉碎過40目篩子備用。稱取竹葉細(xì)分20 g加入至回流瓶中，加200 mL 80%的無水乙醇，在80 ℃回流3 h，獲得竹葉提取液。抽濾獲得濾液，再對殘渣重復(fù)提取2次后合并濾液，將總濾液于80 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，去除多余溶劑獲得濃縮液。為了去除濃縮液中的脂類成分，采用石油醚萃取3～5次，直至上層液呈現(xiàn)無色或近似無色為止。

1.2.2 ?蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.002 5 g置于小燒杯中，加40%乙醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，即得0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.50 mL，置于10 mL容量瓶中，再加入5%的亞硝酸鈉溶液0.30 mL，搖勻，放置6 min;隨后加入10%硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，放置6 min;加入1.0 mol/L的氫氧化鈉溶液4.00 mL，用40%乙醇溶液定容，搖勻，放置15 min備用。以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為空白樣。將含不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的溶液置于紫外—分光光度計（波長范圍：400～600 nm）內(nèi)進(jìn)行測定。

量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.30 mL，搖勻，放置6 min;加10%硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，放置6 min。加1.0 mol/L氫氧化鈉溶液4.00 mL，用40%的乙醇溶液進(jìn)行定容，搖勻，放置15 min。以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為空白樣。采用紫外—分光光度法在510 nm波長處測定吸光度，以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 ?大孔樹脂預(yù)處理

以AB-8型大孔樹脂對竹葉黃酮進(jìn)行分離純化。用95%的乙醇溶液浸泡24 h使其充分溶脹，然后將樹脂裝入填充柱，用4 BV（柱床體積）濃度為4%的鹽酸溶液過柱，蒸餾水洗至中性，再用4 BV濃度為4%的氫氧化鈉過柱，蒸餾水洗至中性，處理后的AB-8型樹脂即可用于后續(xù)實驗。

1.2.4 ?大孔樹脂對竹葉黃酮的動態(tài)吸附及解吸實驗

（1）上樣流速對樹脂吸附性能的影響

將樹脂裝入層析柱后連接恒流泵及樣品自動收集器，在298 K時，讓竹葉黃酮樣品按照不同的速率上樣，考察大孔樹脂的吸附性能，每間隔5 mL收集流分，用紫外-可見分光光度計檢測黃酮含量。

（2）進(jìn)料pH對樹脂吸附性能的影響

考察竹葉黃酮溶液pH值的改變對大孔樹脂吸附性能的影響。通過在298 K時，控制進(jìn)料濃度為1.0 mg/mL，流速為1 mL/min，進(jìn)行動態(tài)吸附。

（3）洗脫劑洗脫速率對樹脂解吸性能的影響

在298 K時，控制進(jìn)料濃度為1.0 mg/mL，流速為1 mL/min，對大孔樹脂進(jìn)行上樣。用100 mL的蒸餾水洗滌后，用濃度為60%的乙醇分別按照0.5，1.0，1.5 mL/min的洗脫速率對吸附在大孔樹脂上的黃酮樣品進(jìn)行洗脫，每間隔5 mL收集流分，用紫外-可見分光光度計檢測黃酮含量。

（4）洗脫劑濃度對樹脂解吸性能的影響

在298 K時，控制進(jìn)料濃度為1.0 mg/mL，流速為1 mL/min，對大孔樹脂進(jìn)行上樣。用100 mL的蒸餾水洗滌后，用不同濃度的乙醇溶液按照1.0 mL/min的速率進(jìn)行洗脫，每間隔5 mL收集流分，用紫外-可見分光光度計檢測黃酮含量。

1.2.5 ?抗氧化研究

測定竹葉黃酮清除DPPH自由基的能力，考察其抗氧化活性。測定時，將竹葉黃酮試樣配置成系列不同濃度的溶液，測定不同濃度的竹葉黃酮試樣對DPPH自由基的清除率[7，8]。以濃度作為橫坐標(biāo)，DPPH自由基清除率作為縱坐標(biāo)作圖，得到竹葉黃酮濃度與自由基清除率的關(guān)系圖譜。在517 nm波長下，通過測定竹葉黃酮在不同光強(qiáng)度和pH等條件下吸光度值的變化，對竹葉黃酮抗氧化活性的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

2 ?實驗結(jié)果與分析

2.1 ?蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照上述實驗方法分析獲得蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。以濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度作為縱坐標(biāo)，通過線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A = 0.001 81+9.414 07C，R = 0.999 98。

2.2 ?上樣流速對竹葉黃酮吸附性能的影響

上樣流速對大孔樹脂的吸附效率及目標(biāo)成分的吸附量均存在一定的影響。通過調(diào)控上樣液的流速分別為1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL/min，考察對大孔樹脂吸附效果的影響，結(jié)果如圖2所示。從圖中可以明顯看出，隨著上樣流速的逐漸增加，吸附量急速降低，這是由于流速過快時，竹葉黃酮中的大分子化合物與AB-8樹脂的接觸時間較短，導(dǎo)致目標(biāo)成分還來不及擴(kuò)散并吸附到樹脂內(nèi)表面就隨著上樣液流出。但是，當(dāng)上樣液流動速度較慢時，竹葉黃酮中的有效成分與大孔樹脂有相對充分的時間進(jìn)行吸附，所以當(dāng)上樣吸附速率為1.0 mL/min吸附率最高。

2.3 ?進(jìn)料pH對樹脂吸附性能的影響

本研究考察了黃酮原液pH分別為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0和8.0時，樹脂吸附性能的變化情況。從圖3可以看出，當(dāng)原液pH為5.0時樹脂的吸附量最大，但逐漸增大原液pH值或減小pH值時，樹脂的吸附率均有所下降。這是由于原液酸度過大時，黃酮與酸會生成烊鹽并以離子的狀態(tài)存在不利于吸附。當(dāng)原液堿度過大時，則質(zhì)子易被強(qiáng)堿俘獲，使酚羥基上的氫解離形成酸根離子，而AB-8樹脂只對分子態(tài)物質(zhì)有吸附，對離子態(tài)的物質(zhì)無吸附，導(dǎo)致黃酮與樹脂的結(jié)合減弱使吸附量降低。

2.4 ?洗脫劑洗脫速率對樹脂解吸性能的影響

洗脫劑流速對樹脂解吸性能的影響結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，當(dāng)洗脫液流速不同時，對應(yīng)的洗脫峰位置和洗脫峰形狀也會略有所差異。對比三種洗脫峰可知，洗脫劑流速為1.5 mL/min時，對應(yīng)的洗脫峰峰形較窄、對稱性好且基本無拖尾。但是，隨著洗脫劑流速逐漸降低，峰形越來越寬且拖尾明顯[9]。

2.5 ?洗脫劑濃度對樹脂解吸性能的影響

改變洗脫劑乙醇的濃度對黃酮的解吸率的影響如圖5所示，從圖中可以看出隨著乙醇濃度的增大解吸率逐漸升高，當(dāng)乙醇濃度為60%時，解吸率達(dá)到90.6%。但是再增加乙醇濃度，解吸率緩慢降低。

2.6 ?光強(qiáng)度對竹葉黃酮抗氧化性能的影響

光對竹葉黃酮抗氧化性能的影響結(jié)果如圖6所示。

從圖6中可以看出，光照對DPPH自由基的清除率影響較大。在避光情況下，竹葉黃酮對自由基的清除率隨時間的增長雖然有所下降但是變化不是很明顯。在光照的條件下，自由基的清除率隨時間增長急劇減小，這是由于竹葉黃酮類化合物中含有酚羥基，而在光照的條件下酚羥基易于被氧化[10]，因此，竹葉黃酮的抗氧化性能下降明顯。

2.7 ?pH對竹葉黃酮抗氧化性能的影響

改變?nèi)芤旱膒H值會影響竹葉黃酮在溶液中的存在形態(tài)，從而導(dǎo)致其抗氧化性能發(fā)生改變（如圖7）。與圖3結(jié)果類似，在pH較低時，竹葉黃酮會與酸生成烊鹽，導(dǎo)致抗氧化性能下降。而pH值較高時，黃酮中的酚羥基會發(fā)生解離，使其抗氧化性能下降。因此，當(dāng)pH值在5.0時，黃酮的自由基清除率最高達(dá)到82.9%。

3 ?結(jié) 論

以竹葉作為原料，采用熱回流法提取其中的竹葉黃酮，通過大孔樹脂AB-8對總黃酮進(jìn)行分離、純化，當(dāng)竹葉黃酮的上樣流速為1.0 mL/min，樣品pH值控制在5.0時，大孔樹脂對竹葉黃酮的吸附率最高。當(dāng)洗脫劑乙醇的流速為1.5 mL/min，濃度為60%時，黃酮的解吸率最好。通過清除DPPH自由基法考察竹葉黃酮的抗氧化性能，結(jié)果表明在光照、溶液pH過低或過高的條件下，均會導(dǎo)致自由基清除率急劇下降，因此，竹葉黃酮的相關(guān)制藥及工藝研究均需控制溶液酸堿度和避光進(jìn)行。

參考文獻(xiàn)：

[1]高夢祥， 張佳蘭， 王江明. 微波浸提竹葉黃酮的工藝研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報， 2005， 33（7）： 147-154.

[2]鄒小琳， 呂兆林， 王媛媛， 等. 竹葉黃酮不同熱加工方式穩(wěn)定性[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2016， 38（11）： 111-117.

[3]游輝， 孫愛東， 唐玲， 等. 竹葉黃酮純化中吸附劑的優(yōu)選及解析特性研究[J]. 食品科學(xué)， 2010， 31（8）： 24-27.

[4] Y. Zhang， W. Xu， X. Wu， X. Zhang， Y. Zhang. Addition of antioxidant from bamboo leaves as an effective way to reduce the formation of acrylamide in fried chicken wings [J]. Food Additives and Contaminants， 2007， 24（3）： 242-251.

[5] G.-Y. Luo， Y.-G. Luo， R. Zhou， M. Zhou， J. Gu， Q. Ye， Y. Dai， G.-L. Zhang. Antioxidant compounds from ethanol extracts of bamboo （Neosinocalamus affinis） leaves [J]. Journal of Asian Natural Products Research， 2015， 17（3）： 248-255.

[6]羅宇倩， 郭輝， 胡林福， 等. 竹葉黃酮的抗氧化活性研究[J]. 食品科技， 2011， 36（7）： 201-203.

[7]馮愛娟， 吳酬飛， 葉茂， 等. 大孔樹脂吸附法分離純化竹葉黃酮研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 19： 89-94.

[8]張光輝， 張栓， 龍旭， 等. 異甘草素合成工藝優(yōu)化及其清除自由基活性研究[J]. 當(dāng)代化工， 2017， 46（9）： 1749-1751.

[9]游輝， 孫愛東， 唐玲， 等. 大孔樹脂提純竹葉黃酮的吸附解吸動力學(xué)研究[J]. 河北林果研究， 2009， 24（2）： 137-140.

[10]史娟， 李江， 葛紅光. 漢中毛竹葉黃酮提取及抗氧化穩(wěn)定性研究[J]. 食品研究與開發(fā)， 2016， 37（11）： 53-57.