熊琳姝

摘 要：通過(guò)基礎(chǔ)培養(yǎng)基配置和孵化罩子自制并先后完成量雌雄果蠅交配，F(xiàn)1代果蠅培育與篩選，一日齡雄性果蠅精巢解剖，組織染色觀察，RNA提取與反轉(zhuǎn)錄，DNA的提取，cDNA熒光定量等實(shí)驗(yàn)，由簡(jiǎn)入繁，順利完成了為期兩個(gè)月左右的實(shí)驗(yàn)，得出了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

關(guān)鍵詞：HmgD過(guò)量表達(dá);果蠅;孵化率;電泳;熒光定量;吸光度

中圖分類號(hào)：Q964 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2019）20-0208-02

通過(guò)對(duì)“HmgD基因過(guò)量表達(dá)調(diào)控”實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行為期兩個(gè)月學(xué)習(xí)與實(shí)際操作，順利完成了相關(guān)實(shí)驗(yàn)并收獲了很多新的實(shí)驗(yàn)技能操作方法與實(shí)驗(yàn)儀器使用方法。實(shí)驗(yàn)期間，主要使用了普通培養(yǎng)基和葡萄汁培養(yǎng)基的成分表與配置;果蠅胚胎孵化率統(tǒng)計(jì)的實(shí)驗(yàn)流程與相關(guān)操作技術(shù);雄性一日齡果蠅精巢解剖實(shí)驗(yàn)操作技能;果蠅精巢RNA提取與cDNA合成;qRT-PCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR）原理及操作流程。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)期間還使用了果蠅生化培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、解剖鏡、電動(dòng)勻漿器、低溫離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、-80℃超低溫冰箱等實(shí)驗(yàn)儀器，以及自制了果蠅孵化罩子。

具體來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)材料是黑腹果蠅，其均是在溫度25℃，濕度在45%～70℃條件下培養(yǎng)的，使用紅糖-玉米培養(yǎng)基飼養(yǎng)而成的。我們分成兩組，第一組負(fù)責(zé)USA-Rpt4R過(guò)量表達(dá)，第二組負(fù)責(zé)int6-RNAi基因敲降。所使用的果蠅品系一共有四種，分別是syncrip RNAi轉(zhuǎn)基因品系、BamGal4vp16、ActGal/CyopscGFP和NosGal4/TM6B。筆者主要負(fù)責(zé)的的基因?qū)κ牵篈ct/cyo♀×4T1♂。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)分析如下。

在該實(shí)驗(yàn)中，見(jiàn)表1，一共有五組孵化罩，每隔一天（24h）換一次培養(yǎng)基，并數(shù)出培養(yǎng)基上總卵數(shù)。第二天數(shù)飽滿的未孵化卵數(shù)，而已孵化出幼蟲(chóng)的卵只剩下干癟的卵殼，不進(jìn)行計(jì)數(shù)。四組生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的總平均孵化率約為60%，而對(duì)照組為67.7%>實(shí)驗(yàn)組平均孵化率，說(shuō)明經(jīng)過(guò)基因敲降處理的實(shí)驗(yàn)組雄性果蠅育性降低，說(shuō)明α4T1這一基因與雄性育性相關(guān)聯(lián)。

2 DNA電泳圖

利用DNA在泳動(dòng)時(shí)的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，可達(dá)到分離混合物的目的。DNA在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，向陽(yáng)極移動(dòng)，其遷移速率與其相對(duì)分子量成反比。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳上顯示的DNA（RNA）帶的亮度來(lái)分析EB作為一種熒光染料，能插DNA的堿基對(duì)平面之間而結(jié)合于其上，在紫外光的激發(fā)下產(chǎn)生熒光，DNA分子上EB的量與DNA分子的長(zhǎng)度和數(shù)量成正比。條帶越亮，DNA濃度越高。根據(jù)上圖結(jié)果顯示，除去marker以外的第二泳道條帶亮度很高，說(shuō)明此處加樣的樣品為目的DNA樣品。

3 熒光定量結(jié)果

熒光定量結(jié)果的總體趨勢(shì)走向正確，Act/cyo×4T1基因?qū)橄抡{(diào)表達(dá)，而對(duì)照組是上調(diào)表達(dá)。但是數(shù)值反映出具有較大的誤差，經(jīng)過(guò)反思與分析，可能原因是因?yàn)闊晒舛繉?shí)驗(yàn)之前預(yù)習(xí)功課沒(méi)有完全做好，實(shí)際上手操作時(shí)可能有的微小失誤導(dǎo)致總體結(jié)果不盡人意。今后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作前，要保證清楚每一步的過(guò)程與意義何在，要專心致志、細(xì)致完成每一步的操作，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠，成功完成實(shí)驗(yàn)。

4 RNA濃度及吸光度值

吸光度值之比一般在1.90～2.0區(qū)間內(nèi)最好，吸光度值之比越大，說(shuō)明提取的RNA純度越高，反之則純度越低。而濃度在600以上為較高濃度。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)反映，RNA提取總體比較成功，但也有部分基因?qū)舛容^低純度一般，說(shuō)明在精巢解剖過(guò)程中可能帶入了果蠅內(nèi)臟碎片等雜質(zhì)來(lái)源，也可能是組織破碎操作出現(xiàn)了問(wèn)題，或者是由于裝有RNA的EP管離開(kāi)冰上時(shí)間長(zhǎng)導(dǎo)致降解等因素影響，見(jiàn)表2。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳靜，龔艷芬，胡爭(zhēng)，王玉鳳.高流動(dòng)性蛋白基因過(guò)量表達(dá)對(duì)果蠅發(fā)育的影響[J].動(dòng)物學(xué)報(bào)，2006，02：89-90.

[2] 趙超，李萍，謝冬生，胡純?nèi)A，熊焰，何麗英，李衛(wèi)虹，肖春，楊普云，李正躍.斑翅果蠅田間發(fā)生與為害特性觀察[J].應(yīng)用昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2017，05：56-59.

[3] 汪惠.HmgD過(guò)量表達(dá)對(duì)果蠅化蛹及血細(xì)胞發(fā)育影響機(jī)制的研究[D].華中師范大學(xué)，2008.

[4] 陳靜.過(guò)量表達(dá)HmgD對(duì)果蠅發(fā)育的影響[D].華中師范大學(xué)，2006.

On the Regulation of ?Overexpression of ?HmgD Gene

XIONG Lin-shu

（School of life sciences， central China Normal University，Wuhan Hubei ?430079）

Abstract：Through the experiments of basic medium configuration and hatching cover self-made and successively completed the mating of male and female Drosophila flies， F1 generation Drosophila breeding and screening， one-day-old male Drosophila testis dissection， tissue staining observation， RNA extraction and reverse transcription， DNA extraction， quantitative fluorescence of DNA， etc.， from simple to complex， successfully completed the experiment for about two months， and obtained the corresponding experimental results.

Key words：overexpression of HmgD; Drosophila melanogaster; hatchability; electrophoresis; fluorescence quantification; absorbance