靳大川 左雨點 武淑芳 郭 師 李 聰 路德榮 周 濤 郭寶強

自從1977年Zur Hausen等首次報道人乳頭瘤病毒(HPV)是人宮頸癌的致病因子，至今40余年。作為乳頭瘤家族的成員之一，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)200種以上的HPV亞型。它是公認(rèn)的世界上最常見的性傳播感染的病原體，每年有1400萬人以上獲得新發(fā)HPV感染。據(jù)估計，一個人一生中感染HPV的危險性達到70%～80%[1]。HPV全球人口的總感染率更是可能高達11.7%[2]。

雖然大部分HPV感染是一過性的，1～2年內(nèi)可以被人體自然清除掉,但是仍有約10%引起持續(xù)性感染。這是HPV引起癌前病變和最終發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的先決條件。雖然整個癌變進程可能長達10～20年，仍然需要足夠的重視[3]。目前國際癌癥研究組織(IARC)認(rèn)定的有致癌潛力的HPV亞型有12種亞型，還有13種可能致癌的亞型。這些亞型被稱為高危亞型(HR-HPV)。其他亞型被稱為低危亞型(LR-HPV)。

HPV是IARC認(rèn)定的11種一類生物致癌因子之一。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HPV高危亞型持續(xù)感染與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，HPV引起的癌癥占所有感染相關(guān)惡性腫瘤的1/3左右，占所有人類惡性腫瘤的4.5%～5.0%[4]。它不但與90%以上的肛管癌和宮頸癌有關(guān)，還與大約70%的陰道癌、外陰癌、口咽部癌以及60%以上的陰莖癌有關(guān)[4～6]。近年來，HPV相關(guān)癌癥的發(fā)生率不斷上升[7]。而癌癥是世界上排名第2位的死因。因此，有關(guān)研究越來越引起重視。

一、HPV的分子生物學(xué)特點和致癌機制

HPV是無包膜、有20面體衣殼的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，基因組約8000，主要編碼6種早期調(diào)節(jié)蛋白，分別是E1、E2、E4、E5、E6和E7; 2種晚期結(jié)構(gòu)蛋白，分別是L1和L2; 以及一個非編碼上游調(diào)節(jié)區(qū)(URR)。各個開放讀碼框架緊密重疊盤繞并接受順式調(diào)節(jié)元件轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。其基因轉(zhuǎn)錄受宿主細(xì)胞分化狀態(tài)的影響，分為早轉(zhuǎn)錄、中轉(zhuǎn)錄和晚轉(zhuǎn)錄，從不同的起始位點開始，產(chǎn)生不同的病毒蛋白[8]。

當(dāng)皮膚、黏膜有微小損傷時，HPV 通過損傷點感染基底層上皮細(xì)胞。HPV的L1/L2衣殼蛋白可以結(jié)合上皮細(xì)胞表面的受體，并通過內(nèi)吞侵入到上皮細(xì)胞的內(nèi)部。但最終只有病毒的基因組染色體和L2蛋白構(gòu)成的復(fù)合體進入細(xì)胞核[9]。這個入核過程只發(fā)生在細(xì)胞進行有絲分裂、核包膜分開的時機。E2蛋白有DNA結(jié)合位點，可以通過和病毒基因組URR區(qū)有反式調(diào)節(jié)激活作用的一個保守區(qū)(E2BS)結(jié)合，將病毒基因組與宿主細(xì)胞染色質(zhì)錨定在一起。這個錨定作用是病毒引起持續(xù)性感染的關(guān)鍵。

E5是一個小的跨膜蛋白，和E6協(xié)同作用促進挖空細(xì)胞的形成，這是HPV感染診斷的標(biāo)志性細(xì)胞。E6和E7蛋白是HR-HPV致癌的主要蛋白。E7蛋白和pRb基因結(jié)合并使之滅活，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失去控制。 抑癌基因p53是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要基因。E6蛋白與之結(jié)合，可以使p53泛素化并降解，抑制細(xì)胞凋亡。二者協(xié)同作用，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[6]。另外，大部分HPV相關(guān)的惡性腫瘤，可以發(fā)現(xiàn)病毒基因組整合進宿主基因組DNA的現(xiàn)象。這個整合過程往往會在基因組線性化的過程中破壞E2基因序列，并隨之破壞E2介導(dǎo)的病毒基因組的表達。E2蛋白對E6/E7基因的表達起到轉(zhuǎn)錄抑制作用，是重要的轉(zhuǎn)錄抑制因子[10]。E2基因的破會隨之導(dǎo)致E6/E7基因表達失控，引起宿主細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定和惡性轉(zhuǎn)化[8]。

二、HPV治療性疫苗

已知E2、E5、E6、E7是公認(rèn)的HPV免疫逃避和惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵性蛋白。目前處在研究階段的治療性的HPV疫苗，主要選擇病毒的E6/E7蛋白作為靶抗原[11]。因為E6/E7蛋白是HPV的主要致癌蛋白，不會通過突變逃避免疫監(jiān)視，且在細(xì)胞內(nèi)有高表達[10, 11]。但是E6/E7蛋白對p53和pRb基因的滅活潛力，可能引起宿主細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，故多采用重組手段將E6/E7蛋白的編碼基因進行人為的修飾改造。保留其抗原性，又不誘發(fā)宿主細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。

E5蛋白一般在癌變的細(xì)胞中不表達，可能只在病毒導(dǎo)致的惡性轉(zhuǎn)化的早期階段起作用，因此多不作為治療性疫苗的靶抗原。理論上E1/E2蛋白也可以作為治療性疫苗的靶蛋白。因為它們對于病毒復(fù)制的起始和維持有重要作用，是病毒DNA整合進宿主基因組以前需要早期高水平表達的蛋白。但是在病毒整合進宿主細(xì)胞基因組的過程中，E2、E4、E5、L1、L2基因常常被破壞或丟失，因此不是理想的靶抗原[10, 12]。

當(dāng)前處在研發(fā)階段的HPV治療性疫苗主要有以下幾類：

1.核酸疫苗：是以DNA或RNA分子構(gòu)建載體，并使之在宿主細(xì)胞內(nèi)表達HPV特定靶抗原蛋白，刺激機體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。

(1)DNA疫苗：原理是利用一個有強大病毒啟動子的重組細(xì)菌質(zhì)粒，攜帶重組的靶抗原基因和轉(zhuǎn)錄終止序列，采用有效的手段使之進入人體細(xì)胞進行表達，刺激人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答[6]。優(yōu)點是費用低廉、應(yīng)用簡單、產(chǎn)品穩(wěn)定、易生產(chǎn)純化。另外，因為DNA不具有抗原性，不刺激機體產(chǎn)生針對載體的免疫應(yīng)答，所以可多次接種[10, 13]。主要的安全性顧慮是重組DNA本身可能會整合進宿主細(xì)胞DNA，但目前尚無任何相關(guān)證據(jù)[6]。2015年美國Trimble等通過一個多中心聯(lián)合的隨機雙盲對照Ⅱ期臨床試驗證實了美國Inovio制藥公司HPV-DNA疫苗VGX-3100的療效。他們對167例分別來自美國、南非共和國、印度共和國、加拿大、澳大利亞、喬治亞民主共和國以及愛沙尼亞共和國，HPV16/18陽性、組織病理學(xué)證實為CIN2/3的女性患者，在第0、4、12周的時候肌內(nèi)注射VGX-3100，然后應(yīng)用VGX-3100進行電穿孔轉(zhuǎn)化治療。發(fā)現(xiàn)49.5%的治療組患者病變得到了逆轉(zhuǎn)，而應(yīng)用了安慰劑的對照組只有30.6%的患者有逆轉(zhuǎn)。這也是世界上第1種同時成功誘導(dǎo)針對HPV的E6/E7蛋白，產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答的治療性HPV-DNA疫苗[14]。VGX-3100也是迄今為止最成功的HPV的治療性DNA疫苗[10]。

(2)RNA疫苗：與DNA疫苗比較，mRNA只要通過內(nèi)吞作用進入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)就可以直接開始轉(zhuǎn)錄，不需要像DNA一樣進入細(xì)胞核才可以。但是RNA極不穩(wěn)定，易降解，而且不能在細(xì)胞之間傳遞。相關(guān)的研究很不成熟，還遠(yuǎn)沒有進展到臨床試驗的程度。

2.肽類疫苗：是通過抗原遞呈細(xì)胞，例如樹突狀細(xì)胞，攝取和遞呈肽片段抗原給CD8+T細(xì)胞，從而產(chǎn)生免疫應(yīng)答。優(yōu)點是穩(wěn)定、安全，易于大規(guī)模生產(chǎn)，耐受性好，可引起廣泛的T細(xì)胞應(yīng)答[6]。

肽類片段本身免疫原性比較差，因此需要一些措施增強其免疫原性，例如同時使用免疫佐劑，或者采用融合蛋白的形式，以刺激機體產(chǎn)生更強的免疫應(yīng)答，獲得更好的治療效果。已經(jīng)有研究對加用Montanide ISA-51佐劑的HPV肽類疫苗進行的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗，做了毒性、安全性和免疫原性方面的研究。未觀察到嚴(yán)重不良反應(yīng)。僅少數(shù)人出現(xiàn)乏力、發(fā)熱等一過性流感樣的癥狀。酶聯(lián)免疫斑點試驗證實，加用免疫佐劑的HPV肽疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生了強烈而廣泛的免疫應(yīng)答[1]。美國Nakagawa等采用新的免疫佐劑，應(yīng)用含有HPV16 E6蛋白的4個肽片段的疫苗PepCan，對24例活檢證實的CIN2/3患者進行了Ⅰ期臨床試驗，觀察到83%的病例在注射50μg劑量治療后，病變得到明顯的逆轉(zhuǎn)[15]。目前正進行Ⅱ期臨床試驗[6]。Daayana等采用融合蛋白形式的HPV肽疫苗TA-CIN，對19例有外陰表皮內(nèi)瘤變2級/3級的患者，進行了Ⅱ期臨床試驗，取得了明顯的治療效果。在應(yīng)用疫苗后第10、20、52周，分別觀察到有32%、58%、63%的患者，病變得到了完全的逆轉(zhuǎn)。并在患者病變組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了大量的CD8+和CD4+T細(xì)胞浸潤[10]。

3.蛋白質(zhì)疫苗：HPV蛋白抗原包含大量的抗原表位，但是通常更傾向于激活MHC Ⅱ類分子途徑，誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。但是對于T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，激活效果比較弱[6, 16]。而細(xì)胞免疫應(yīng)答對于終止CIN的進程、病毒的清除、癌前病變的逆轉(zhuǎn)等是一個關(guān)鍵性因素，體液免疫應(yīng)答主要是預(yù)防HPV感染的主要方面[6, 17]。因此，需要在疫苗里采用來自E6/E7蛋白的MHC Ⅰ類分子限制性肽，可以產(chǎn)生更強的細(xì)胞免疫應(yīng)答[16, 18]。應(yīng)用佐劑也可以增強其細(xì)胞免疫應(yīng)答[6]。

法國Genticel公司開發(fā)的ProCervix(GTL001)是 HPV16/18的E7蛋白和來自百日咳桿菌的去毒化腺苷酸環(huán)化酶的融合蛋白，采用咪喹莫特作為佐劑，對47例女性HPV16/18感染者進行了隨機、對照、雙盲的Ⅰ期臨床試驗，皮內(nèi)注射不同劑量的GTL001，評估其安全性、耐受性和治療效果[17]。研究發(fā)現(xiàn)GTL001的引起的不良反應(yīng)為輕中度，可以耐受，在600μg劑量的時候，病毒的清除效果最好，可以誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答。該公司隨后開發(fā)的第2代多價HPV治療疫苗——GTL002，目前正在進行Ⅱ期臨床試驗。

4.活載體疫苗：是利用重組消除致病性的活細(xì)菌或者病毒作為載體，在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和擴散靶抗原，然后通過MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ途徑遞呈抗原，刺激CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞和CD4+輔助性T細(xì)胞(TH細(xì)胞)，從而產(chǎn)生強烈的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答[13]。

(1)細(xì)菌性活載體疫苗：常用的細(xì)菌載體包括單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Lm)、干酪乳桿菌、乳酸桿菌、沙門菌等。最常選用Lm作為細(xì)菌載體。它是革蘭陽性菌，不產(chǎn)生脂多糖內(nèi)毒素；又是胞內(nèi)菌，能利用MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ途徑激活CD8+和CD4+細(xì)胞，也可以在相鄰細(xì)胞間傳播。還可以觸發(fā)固有免疫應(yīng)答，像天然免疫佐劑一樣進一步增強抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的強度[10]。這一類的疫苗有的已經(jīng)進入了Ⅲ期臨床試驗階段，例如美國Advaxis公司開發(fā)的AXAL疫苗于2016年得到FDA的批準(zhǔn)。Tomoyuki等進行的一個Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中，17例有CIN3病變的患者口服干酪乳酸菌為載體的HPV疫苗GLBL101c，治療9周后，有9例患者的病變逆轉(zhuǎn)為CIN2，5例患者的病變逆轉(zhuǎn)為LSIL。并且沒有觀察到明顯的不良反應(yīng)[10]。

(2)病毒性活載體疫苗：病毒本身有感染宿主細(xì)胞，并將其DNA送入細(xì)胞內(nèi)的自然特性，這是其作為載體的優(yōu)勢所在。這一類疫苗的原理，是改造病毒的基因組，將HPV靶基因替代病毒基因組中不重要的部分，并重組消除病毒致病基因[6]。這樣改造后的病毒感染宿主細(xì)胞，基因組就可以在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和表達靶抗原，并且不會引起其他疾病。常用的病毒載體包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、α病毒、牛痘病毒等[13]。病毒載體疫苗是最有希望的HPV抗原特異性免疫治療。這類疫苗的優(yōu)點是可以快速大量生產(chǎn)，可以誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

重組修飾的牛痘病毒Ankara(MVA)疫苗可以表達HPV16/18的E6/E7蛋白，在Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中，有28%的晚期宮頸癌患者，接種后產(chǎn)生了HPV特異性的CTL應(yīng)答。在另一個Ⅱ期臨床試驗中，83%的42～54歲患者，病變至少縮小了40%。最近的一個包含1356例男性和女性患者的Ⅲ期臨床試驗發(fā)現(xiàn)，有效率達到了90%。所有男性患者的病變得到了完全的根除[19]。腺病毒：對多種細(xì)胞有廣泛的趨向性，可以通過重組攜帶6500的外來DNA片段，進入細(xì)胞核后持續(xù)性以游離形式存在。因此腺病毒是一個理想的病毒載體。但是因為腺病毒在人體是一個常見的病毒，因此很多人體內(nèi)有針對腺病毒的高滴度中和性抗體。這樣不得不選用一些少見的亞型，例如Ad26、Ad35；或者采用其他宿主的腺病毒，例如羊、豬、牛、黑猩猩等。其中以黑猩猩攜帶的腺病毒最理想，因為在人類的流行性很低，而免疫原性又很強大[6, 20]。Wunderlich等采用少見的腺病毒亞型Ad26、Ad35作為載體，開發(fā)的針對E2/E6/E7的治療性HPV疫苗正在進行Ⅰ期臨床試驗[21]。

RNA復(fù)制子疫苗是用來自α病毒的某些RNA病毒重組得到的RNA病毒載體疫苗。這類病毒包括辛德畢斯病毒、委內(nèi)瑞拉豬腦炎病毒等[10,22]。RNA復(fù)制子能自我復(fù)制，進行持續(xù)性的抗原表達，產(chǎn)生增強的免疫原性。這類疫苗例如VP22-E7、E7-VRP疫苗等。其中E7-VRP疫苗的動物試驗的結(jié)果很驚人，使67%的荷瘤小鼠的腫瘤消失。另一種RNA復(fù)制子疫苗，Vvax001疫苗，正在進行Ⅰ期臨床試驗[10]。

5.基于細(xì)胞的HPV治療疫苗：是將分離出的活細(xì)胞，在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)或其他處理，使細(xì)胞可表達靶抗原而刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。然后將處理后的細(xì)胞輸?shù)交颊唧w內(nèi)。

樹突狀細(xì)胞(DCs)本身就是最有效的專業(yè)抗原遞呈細(xì)胞，能激活固有和獲得性免疫系統(tǒng)。通過將抗原遞呈給MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子途徑，能誘導(dǎo)強大的CD4+和CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答[13]。這一點與DNA疫苗及肽類/蛋白質(zhì)疫苗比較很有優(yōu)勢。但是DCs的缺點也很明顯，不易大規(guī)模生產(chǎn)，生命周期短，質(zhì)量控制不易、缺乏理想的接種途徑等[10]。這一類疫苗有的也已經(jīng)進入Ⅰ期臨床試驗。發(fā)現(xiàn)患者對疫苗耐受性良好，對于晚期宮頸癌也顯示出療效。

過繼細(xì)胞傳輸(ACT)是另一種基于細(xì)胞的疫苗治療方式。這種方式是在體外生產(chǎn)抗原特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTLs)，然后輸入到患者體內(nèi)進行治療。這個方法的優(yōu)勢是能在體外生產(chǎn)大量的抗原特異性CTLs，體外激活使其具有抗原性。并且在回輸治療前，可以去除免疫應(yīng)答的抑制性細(xì)胞，例如Treg細(xì)胞等。從而獲得更好的治療效果。這類疫苗也已經(jīng)進入Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗，對HPV相關(guān)癌癥患者進行試驗治療。觀察到部分患者已經(jīng)轉(zhuǎn)移的HPV(+)的惡性腫瘤發(fā)生了消退，證明這是一種有效的治療手段[10]。

其他還包括HPV特異性T細(xì)胞(HPVST)疫苗治療，這是直接提取和處理HPV相關(guān)惡性腫瘤患者體內(nèi)的血液中的T細(xì)胞。使其對癌細(xì)胞的反應(yīng)更活躍、具有攻擊性。而后將這些處理后的HPVST回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。這種療法的I期臨床試驗也正在進行中。嵌合抗原受體(CAR)T細(xì)胞疫苗是最新的基于細(xì)胞的免疫療法。該法將改造的能表達特定受體，吸引多克隆T細(xì)胞到暴露腫瘤相關(guān)抗原的表面，進行腫瘤清除[23]。這種方法的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗正在進行，關(guān)于其可行性、安全性和治療效果還沒有明確的結(jié)論。也有用基于腫瘤細(xì)胞的HPV疫苗，是將特定腫瘤細(xì)胞在體外進行遺傳學(xué)修飾，使之編碼和分泌細(xì)胞因子，例如IL-2、IL-12等，以增強其免疫原性。但是考慮到即使是經(jīng)過基因修飾改造的腫瘤細(xì)胞，仍然存在安全性方面的顧慮。因此基于腫瘤細(xì)胞的HPV治療性疫苗不考慮用于癌前病變或癌癥早期的情況。

綜上所述，研制HPV治療性疫苗有重要的臨床意義和社會價值。雖然預(yù)防更為重要，但HPV預(yù)防性疫苗價格高昂，限制了其普及應(yīng)用，尤其在不發(fā)達國家更為明顯。據(jù)報道，2016年中期為止，只有8%的低收入和中等收入國家引入了預(yù)防性HPV疫苗[6]。即使在美國這樣的發(fā)達國家，接種率也只有38%，13～17歲女孩只有大約21%完成了3針HPV預(yù)防疫苗注射，并且即使接種了預(yù)防性HPV疫苗，仍然有若干沒有被預(yù)防性疫苗覆蓋的HPV高危亞型。而現(xiàn)有的預(yù)防性HPV疫苗對于已經(jīng)感染的HPV的廣大患者來說，沒有任何治療效果。因此開發(fā)治療性HPV疫苗是一項很急迫的任務(wù)。目前多種HPV治療性疫苗在進行不同階段的臨床試驗，并有若干很有希望的產(chǎn)品。雖然暫時還沒有獲得批準(zhǔn)的商業(yè)化的HPV治療性疫苗，但是相信在不久的將來，價廉物美的治療性疫苗一定會出現(xiàn)，給廣大HPV相關(guān)惡性腫瘤患者帶來生命的曙光。