徐怡朦 楊亞冬 楊 耿 宋勇飛 張文元

癌癥是全球死亡的主要原因之一，盡管研發(fā)人員和制藥界作出了巨大努力，但腫瘤藥物開發(fā)仍然充滿挑戰(zhàn)，即使是最先進的臨床前藥物測試，也難以預料藥物毒性作用、不良反應、藥物耐受及藥物相互作用。腫瘤模型的藥敏試驗在指導臨床用藥及個體化治療方面具有重要作用?？煽康乃幟粼囼?，可幫助選擇有效的化療藥物，避免藥物毒性不良反應，設計合理的治療方案，提高治療效果。一個理想的腫瘤模型應與其模擬的腫瘤在分子、形態(tài)、組織結構及生物學特征方面有許多共同性，即真實地仿生[1]。細胞培養(yǎng)模型一直是抗癌藥物研發(fā)計劃的核心。為了在體外腫瘤模型中了解腫瘤微環(huán)境的詳細情況，研究人員開發(fā)了大量二維(2D)和三維(3D)模型。其中3D體外模型正成為傳統(tǒng)2D細胞培養(yǎng)和動物模型之間的橋梁。而3D生物打印腫瘤模型可將細胞與材料同時操作，實現(xiàn)多種細胞和細胞外基質材料的特定空間排布，構建比傳統(tǒng)3D模型更為仿真的3D腫瘤模型，以發(fā)揮其在抗癌藥物篩選評估中的作用。

一、二維(2D)腫瘤模型與藥敏試驗及藥物研發(fā)

2D細胞培養(yǎng)是生物技術中最核心、最基礎的技術。腫瘤細胞2D培養(yǎng)模型由于操作簡便，反應靈敏，觀察分析快捷，實驗周期短等諸多優(yōu)點而成為目前生物學和醫(yī)學研究中最常用的一種細胞培養(yǎng)方式。各種癌細胞系的體外2D培養(yǎng)被廣泛用于腫瘤疾病研究，以及候選藥物高通量篩選評估，是目前廣泛使用的腫瘤模型。然而在從臨床前模型轉向人體試驗后， 2D培養(yǎng)模型預測治療方案和策略的有效性值得商榷：①體內的腫瘤細胞團呈三維球形；②腫瘤細胞在遺傳和表型上呈現(xiàn)多樣化，2D細胞培養(yǎng)難以模擬如此巨大的克隆多樣性(腫瘤異質性)以測試候選藥物的功效和毒性不良反應；③腫瘤微環(huán)境非常復雜，而2D腫瘤模型由于缺乏有效的腫瘤微環(huán)境而不能被認為是類腫瘤組織；④2D培養(yǎng)的細胞缺乏3D細胞培養(yǎng)支架的空間深度和細胞連接性，無法支持細胞維持適當的組織功能，而實體腫瘤耐藥性的產生與其三維立體的空間結構密切相關[2,3]。因此，用2D細胞評估的藥物功效、藥代動力學、作用機制、毒性不良反應、遺傳毒性和致癌性等并不總能準確預測人類患者的真實反應。

使用2D培養(yǎng)模型進行抗腫瘤藥物篩選，越來越被認為是導致腫瘤耐藥/腫瘤惡化及抗癌治療失敗的主要原因。因為，體內存在的實體瘤是一個3D細胞團，所有細胞均處于3D空間之中，包括增殖旺盛的細胞、靜止細胞和壞死組織等，具有明顯的異質性，可使腫瘤耐藥物性提高[4]。而目前使用較多的2D腫瘤細胞培養(yǎng)未能真實地模擬出腫瘤細胞在體內所處的狀態(tài)，往往造成耐藥性消失。而3D腫瘤細胞模型卻易產生耐藥性[5，6]。另外，動物模型的組織微環(huán)境與人類不同，也存在無法控制的變量，這限制了在分子水平上理解疾病進展的機制的定量分析。藥物測試結果提示，動物模型可能由于種間差異而不能準確預測人類患者的結果[7]。并且在藥物篩選領域的評價技術中，動物篩選模型存在種屬差異和周期長，裸鼠飼養(yǎng)條件苛刻，價格昂貴等缺點。而且動物模型和體內研究都存在不可預測的特性和倫理認同的問題。因此，建立一個在生理上相對真實的3D模型變得十分重要。

二、三維(3D)腫瘤模型與藥敏試驗及藥物研發(fā)

3D細胞培養(yǎng)是繼2D細胞培養(yǎng)和動物模型之后的第3個模型，在創(chuàng)建含有活細胞的復雜支架方面顯示出明顯的優(yōu)勢，同時它也是一種低成本，高通量和高重現(xiàn)性的有效方法。由細胞聚集形成的多細胞腫瘤球體模型因簡單易用而被認為是3D癌癥模型的“金標準”[8]。3D體外癌癥模型提供了維度和生理相關度高于常規(guī)2D模型的方法，更便于研究致瘤及耐藥現(xiàn)象。與2D模型比較，3D模型在細胞增殖，基因表達和抗癌藥物反應方面都表現(xiàn)出了與實體瘤更為相似的行為，更好地模擬細胞在體內的自然生長環(huán)境，人體活細胞的生物打印可在體外進行更有效真實地復制，可用于高通量藥敏試驗及新藥開發(fā)篩選[9，10]。研究表明，與2D癌細胞培養(yǎng)模型比較，3D培養(yǎng)癌細胞間的相互作用明顯增強，具有更強的抗輻射和抗化學活性，顯示了異質性的增加和對細胞凋亡抗性的提高[11，12]。

惡性腫瘤的異質性可導致不同個體治療效果相去甚遠，其耐藥性是影響化療治療效果和預后的重要因素，這將對常規(guī)診斷及患者管理決策造成影響，造成診斷不一致和治療性抵抗，以及造成化療藥物的多藥耐藥和嚴重的藥物毒性不良反應等缺陷，是腫瘤化療失敗的主要原因[13，14]。因此，建立合適的體外3D耐藥模型是耐藥研究的關鍵所在，體外腫瘤藥敏實驗尤為重要，將為惡性腫瘤的個體化治療提供有力的循證醫(yī)學依據。從而實現(xiàn)“個體化”化療以取代經驗性、盲目性化療。

與傳統(tǒng)的二維單層比較，3D腫瘤球狀體模型更忠實地再現(xiàn)了體內腫瘤的宏觀結構，能更好地反映體內腫瘤的生長和發(fā)育情況，是一種更接近體內癌細胞病變特性的腫瘤模型，可更準確地預測藥物在體內的治療效果，對腫瘤學研究、癌癥個體化治療和抗癌藥物研發(fā)等都會產生重要的促進作用[15]。并可對抗癌藥物的篩選、作用和抵抗進行分析，具有重要的臨床意義[14]。

事實上，越來越多的癌癥研究正在利用3D培養(yǎng)模型，并且觀察到許多與傳統(tǒng)2D模型明顯不同的反應。Huang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，NSC 23766在三維水凝膠中刺激了U87 GBM細胞的遷移，而在二維單層培養(yǎng)基中抑制了細胞的活性，表明3D水凝膠研究腫瘤細胞侵襲的優(yōu)勢。此外，Eguchi等[17]研究發(fā)現(xiàn)，基于納米培養(yǎng)板的3D環(huán)境使細胞能夠形成類多能干細胞腫瘤體，并在形態(tài)和基因表達水平上更準確地模擬體內腫瘤狀態(tài)。先進的體外三維培養(yǎng)系統(tǒng)克服了許多2D系統(tǒng)的局限性，比較真實地反映腫瘤體內的情況。因此，細胞在3D條件下更能代表其在體內條件下的響應，藥物篩選更有效。體外3D腫瘤模型替代現(xiàn)有2D腫瘤模型用于藥物篩選與藥物研發(fā)是腫瘤藥篩技術發(fā)展的必然趨勢。

三、3D打印腫瘤模型的發(fā)展

腫瘤組織是由微環(huán)境中生存的惡性細胞與基質組成，基質在癌癥惡化中起著關鍵作用。因此，光有3D是不夠的，還需要建立一個對細胞有觸發(fā)性的微環(huán)境，用于腫瘤間質微組織的構建[18]。3D打印技術通過將計算機輔助設計逐層沉積生物墨水(生物材料基質與細胞混合)來制造復雜3D生物結構，并將具有3D結構不同材料基質的載體與各種不同種類的細胞在體外共同培養(yǎng)，使細胞能夠在載體的3D空間結構中遷移、生長，構成3D細胞-載體基質復合物的一種方法[19]。

近年來，3D打印技術在組織工程等學科領域發(fā)展迅速。相比于來自2D培養(yǎng)、傳統(tǒng)組織工程3D模型及實驗動物腫瘤模型，3D生物打印的腫瘤模型具有如下優(yōu)點：①可以在打印前設計模型的大小和形狀;②可以根據打印機的噴嘴和相關匹配參數控制水凝絲的粗細;③可以將幾種不同類型的細胞與材料基質同時精確地組合打印;④可以在多層次上制作雙重分子(不同的營養(yǎng)與氧氣濃度)梯度。一方面，可以在生物打印的腫瘤樣組織上呈現(xiàn)內部和外部雙分子梯度；另一方面，內部和外部生物分子也可以呈現(xiàn)在水凝膠薄片中。因為雙分子梯度在趨化性和癌癥轉移中發(fā)揮重要作用，在非黏附條件下細胞在水凝膠形成的球體中生長，形成營養(yǎng)和氧氣的梯度，更能模擬人體內的營養(yǎng)物質濃度，以及藥物篩選中藥物分子的濃度梯度。生物材料是組織工程的核心部分，可以提供促進細胞黏附、增殖的分子和機械信號，并增強細胞外基質(ECM)蛋白沉積和組織形成。可通過精確設計，模擬體內腫瘤組織，用于研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展，腫瘤異質性，腫瘤侵襲和轉移，以及進行抗癌藥物敏感性研究。

由于高通量篩選和細胞篩選模型與體內環(huán)境差異大，藥物篩選準確率低。因此，可用細胞3D打印技術制造仿真的組織器官模型，并構建更準確的藥物篩選模型。目前已經開發(fā)了皮膚復制模型來模擬黑色素瘤，以研究腫瘤細胞球狀體的疾病機制和藥物篩選。有研究利用永生化肝細胞與ECM衍生水凝膠構建的肝模型不僅可恢復部分肝功能，也可用于體外評估肝毒性的高通量藥物篩選。3D打印細胞培養(yǎng)模型將有助于抗癌新藥的鑒定，毒理學分析，以及精準藥物的研發(fā)。

包含腫瘤微環(huán)境的多個特征并代表癌癥進展的3D生物打印癌癥模型正在出現(xiàn)，并用于腫瘤轉移研究，以及藥物篩選測試研究[20]。3D生物打印腫瘤模型在創(chuàng)建快速、廉價、高度仿真3D癌癥組織模型方面已邁出重要一步，為研究癌癥遷移提供了強有力的工具。利用創(chuàng)新的生物學方法和技術開發(fā)更復雜的系統(tǒng)用來研究腫瘤微環(huán)境，對于改進藥物發(fā)現(xiàn)實踐及抗癌藥物研發(fā)至關重要。

藥敏試驗及藥物計劃失敗的一個主要原因是缺乏臨床療效和相關毒性不良反應問題。鑒于3D生物打印結構能產生更好的腫瘤組織模型，可以降低臨床前研究和藥物開發(fā)過程的成本。在臨床評估的重要階段，準確的臨床前期治療效果和毒性不良反應測定將降低新藥物的失敗率。在3D生物打印的人體器官上進行藥物測試可以消除從臨床前動物和細胞培養(yǎng)研究中得出不確定結論的可能性。為了準確預測候選藥物在臨床試驗中不需要的參數，可以使用各種現(xiàn)有的和新興的技術(模型)，例如球狀體，凝膠包埋培養(yǎng)，共培養(yǎng)系統(tǒng)和3D組織模型等。預計技術創(chuàng)新將擴大腫瘤工程的范圍，允許操縱特定于腫瘤的因素，從而促進未來的癌癥藥物發(fā)現(xiàn)實踐。

四、展 望

雖然傳統(tǒng)3D腫瘤模型具有很高的應用潛力，但是它存在固有的局限性，仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。挑戰(zhàn)之一是滿足組織工程應用要求的理想材料仍難以捉摸，是目前最大的瓶頸。另外，傳統(tǒng)3D模型通常僅模擬單個時間節(jié)點，或者腫瘤發(fā)生、發(fā)展的某個階段。

至今研究人員已經開發(fā)了多種方法來模擬復雜的3D癌癥模型，現(xiàn)在正在采取同時滿足腫瘤復雜性和異質性的方案，這一努力將能夠使癌癥模擬的領域更加準確和先進。先進的腫瘤建模有助于通過對新分子治療藥物的鑒定和(或)驗證來解決腫瘤復雜性和異質性問題，增加對新致癌驅動因素和生物標志物的理解，為腫瘤模型和生物標志物開發(fā)鋪平道路。除了識別和評估新的化學實體外，更多創(chuàng)新的腫瘤模型在預測精密藥物，以及在患者個體化藥物治療功效方面得到真正體現(xiàn)。隨著科技的發(fā)展，將來有可能將整個腫瘤生態(tài)納入3D模型系統(tǒng)之中?？傊?，3D生物打印技術的進步將為腫瘤研究開辟新的前沿，一個漸進式臨床癌癥療法時代即將到來。