郎青云 李慧 祝謝民

摘 要：以甜葉菊為原料，采用超聲輔助纖維素酶法提取甜菊糖，以甜菊糖提取率為指標，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應面法分析得出最佳工藝條件;再用濾紙片法測定甜菊糖的抑菌活性，用液體培養(yǎng)法測定甜菊糖的最小抑菌濃度（MIC）。結(jié)果表明：最佳提取工藝條件為纖維素酶量0.5%，超聲時間35min，超聲溫度50℃，在此條件下，甜菊糖的提取率為18.86%;甜菊糖對4種供試菌均有抑制作用，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、毛霉、根霉的最小抑菌濃度分別為20、40、10、80mg/mL。

關(guān)鍵詞：甜菊糖;響應面法;抑菌活性;最小抑菌濃度（MIC）

中圖分類號 TS201.1文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）21-0030-06

Abstract：Stevia rebaudiana was used as raw material to extract stevioside by cellulase assisted by ultrasound.With the extraction rate of stevioside as the index，the optimum technological conditions were obtained by response surface methodology on the basis of single factor experiments.Then the antimicrobial activity of stevioside was determined by filter paper method，andthe minimum inhibitory concentration （MIC） of stevioside was determined by liquid culture method.The results showed that the optimum extraction conditions were cellulase 0.5%，ultrasonic time 35min and ultrasonic temperature 50 ℃. Under these conditions，the extraction rate of stevioside was 18.86%.Stevioside inhibited all the four tested bacteria，and the minimum inhibitory concentration of stevioside on Escherichia coli，Bacillus subtilis，Mucor and Rhizopus were 20，40，10 and 80 mg/mL，respectively.

Key words： Stevioside;Response face method;Bacterial activity;Minimum inhibitory concentration（MIC）

甜葉菊[Stevia rebaudiana （Bertoni） Hemsl.]是一種菊科甜葉菊屬的多年生草本植物。1977年，甜葉菊從日本引入到南京中山植物園、中國農(nóng)業(yè)科學院等科研機構(gòu)?，F(xiàn)如今，中國作為甜葉菊生產(chǎn)國已躍居世界首位，其出口貿(mào)易排世界首位。目前，我國甜葉菊主要以原材料或者粗加工的產(chǎn)品出口到發(fā)達國家，其精加工生產(chǎn)成品方面的研究仍較少。甜菊糖（Stevioside），又名甜菊糖苷，是一種高甜度、低熱量的新型天然甜味劑[1]，可廣泛應用于飲料、蜜餞、果脯、糕點、乳制品或減肥等功能性食品中[2];具有一定藥用價值，有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、降血壓、降血脂等功效[3];其產(chǎn)生的工業(yè)廢料，可添加到動物飼料和農(nóng)作物肥料中使用[4]。甜菊糖在各行各業(yè)的廣泛應用，提高了其市場開發(fā)價值。

目前，甜菊糖的提取方法主要有水浸提法[5]、溶劑萃取法[6]、連續(xù)逆流提取法[7]及超聲波提取法[8]。其中，超聲波輔助纖維素酶法提取，不僅具有操作簡單、耗時短、溶劑用量少的優(yōu)點，還可以有效提高甜菊糖的提取率。本課題旨在單因素試驗的基礎(chǔ)上結(jié)合響應面法，對超聲輔助纖維素酶提取甜葉菊中甜菊糖的生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化，并對其進行了抑菌活性的研究，為甜菊糖的深度開發(fā)提供有力的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 材料：甜葉菊，亳州市譙府茶業(yè)有限公司生產(chǎn)。試劑：纖維素酶，和氏璧生物工程有限公司生產(chǎn);苯酚、濃硫酸、葡萄糖標準品、無水乙醇均為分析純。培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基。菌種：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、毛霉和根霉，均為蚌埠學院微生物實驗室培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備 分析天平，上海海康電子儀器廠生產(chǎn);高速中藥粉碎機，吉首市中誠制藥機械廠生產(chǎn);電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司生產(chǎn);超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn);臺式高速冷凍離心機，湖南可成儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鞏義市予華儀器有限責任公司生產(chǎn);可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司生產(chǎn);立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn);超凈工作臺，聚創(chuàng)環(huán)保高新技術(shù)企業(yè)有限公司生產(chǎn);雙目顯微鏡，重慶光電儀器有限公司生產(chǎn);生化培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠生產(chǎn)。

1.3 試驗方法

1.3.1 葡萄糖標準曲線的繪制 稱取葡萄糖配置成0.2mg/mL葡萄糖溶液。取7支干凈的試管并標號，向其中分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL的0.2mg/mL葡萄糖溶液，定容至2.0mL。再加入5%苯酚溶液1.0mL于7支試管中，振蕩搖勻，緩慢逐滴加入濃硫酸5.0mL，充分搖勻后靜置30min。用0號管作為空白對照進行調(diào)零，在波長為490nm處測定1～6號管的吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線[9]。

1.3.2 原料預處理 取一定量甜葉菊干葉放入中藥粉碎機中，粉碎過篩，60℃烘箱中干燥至恒重后，裝入試劑瓶備用。

1.3.3 甜菊糖的提取 稱取甜葉菊粉末按料液比1∶40（mg/mL）加入蒸餾水，0.5%纖維素酶，pH4.5，50℃超聲提取35min，抽濾，向濾渣中加入等體積的蒸餾水，同等條件二次提取。合并濾液加熱去除蛋白質(zhì)等不溶性物質(zhì)。在25℃條件下，10000r/min，離心10min。離心后，取上清液，濃縮至原體積1/10。加入3倍體積無水乙醇，混合，置于4℃，醇沉12h。在4℃下，4000r/min，離心20min，取出醇沉產(chǎn)物，置于60℃干燥得甜菊糖粗多糖[10]。

1.3.4 甜菊糖提取率的計算[11] 移取濾液0.5mL，稀釋80倍后，按1.3.1方法測定490nm波長下吸光度A，并根據(jù)回歸方程計算待測溶液的甜菊糖質(zhì)量濃度。甜菊糖提取率計算公式如下：

1.3.5 甜菊糖抑菌試驗

1.3.5.1 供試菌種的活化與菌懸液的制備 配置斜面固體培養(yǎng)基，用劃線法將4種供試菌種活化（細菌：37℃，24h;真菌：28℃，48h）。挑取1環(huán)無雜菌污染的單菌落于9mL無菌水中，振蕩搖勻，制成一系列菌懸液，濃度約為1.0×106～1.0×108CFU/mL，備用[12]。

1.3.5.2 抑菌效果測定 濾紙片法抑菌效果測定：用打孔器獲得6mm圓形濾紙片，與固體培養(yǎng)基、鑷子、涂布棒高壓滅菌（121℃，20min）。滅菌干燥后的濾紙片分別浸泡在不同的甜菊糖溶液（80、40、20、10、5mg/mL）中2h，備用。用涂布法接種供試菌，吸收后，用無菌鑷子夾取濾紙片貼于已涂布有供試菌的平板上，無菌水作為空白對照，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（細菌：37℃，24h;真菌：28℃，48h）。培養(yǎng)后，觀察濾紙片周圍抑菌圈大小并測量，計算取平均值。每一菌種做3組平行試驗[13]。

1.3.5.3 最低抑菌濃度（MIC）的測定 配置80mg/mL的甜菊糖溶液，用二倍稀釋法配置好濃度為40、20、10、5mg/mL的甜菊糖溶液，取不同濃度的甜菊糖稀釋液各0.1mL于試管中，再分別吸取0.1mL菌懸液和5mL液體培養(yǎng)基于對應的試管中均勻混合，以無菌水作為對照試驗。將6支試管放于培養(yǎng)箱培養(yǎng)（細菌：37℃，24h;真菌：28℃，48h），觀察菌落的生長情況，做3組平行試驗，將不長菌的甜菊糖最低濃度作為最小抑菌濃度（MIC）。

1.4 試驗設(shè)計

1.4.1 單因素試驗 分別稱取5份甜葉菊干葉粉末1g，以水為提取液，選取料液比、纖維素酶量、溶液pH、超聲溫度、超聲時間5個因素，以甜菊糖提取率為衡量標準，進行單因素試驗。

1.4.2 響應面試驗 依據(jù) Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取對甜菊糖提取率有較顯著影響的3個因素，即纖維素酶量、超聲溫度、超聲時間。設(shè)計3因素3水平的響應面分析試驗方案，優(yōu)化超聲波輔助纖維素酶提取甜葉菊中甜菊糖的提取工藝，分別用A、B、C代表纖維素酶量（%）、超聲溫度（℃）、超聲時間（min）3個因素，用-1、0、1代表變量的3個水平，對自變量進行編碼，響應面分析因素與水平編碼表見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線 葡萄糖標準曲線回歸方程y=11.036x-0.0015，R2=0.9995，式中：x為葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL;y為吸光度，見圖1。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 料液比對甜菊糖提取率的影響 在纖維素酶量0.5%、溶液pH4.5、超聲溫度50℃、超聲時間35min條件下，研究料液比（W/V）1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60對甜菊糖提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，甜菊糖的提取率在1∶20～1∶40（W/V）料液比，隨著溶劑量的增加而增大，在1∶40（W/V）料液比處出現(xiàn)峰值，此后甜菊糖的提取率呈下降的趨勢。分析其原因，可能是因為添加溶劑的量超過最適值后，溶劑會吸收掉部分超聲波輻射，用于溶解雜質(zhì)的溶劑量增多，在樣品提取上的用量卻減少了。故初步判定當料液比達到1∶40（W/V）時，對提取甜葉菊中的甜菊糖影響最顯著。

2.2.2 纖維素酶量對甜菊糖提取率的影響 在料液比（W/V）1∶40、溶液pH4.5、超聲溫度50℃、超聲時間35min條件下，研究纖維素酶量0、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%對甜菊糖提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在0～0.50%纖維素酶量，甜菊糖的提取率不斷升高，并在0.5%纖維素酶量處達到峰值。當纖維素酶量大于0.50%之后，甜菊糖的提取率趨于平緩，這可能是因為底物已處于飽和狀態(tài)。因此，可初步判定0.50%纖維素酶量對提取甜葉菊中的甜菊糖影響最顯著。

2.2.3 超聲溫度對甜菊糖提取率的影響 在纖維素酶酶量0.5%、料液比（W/V）1∶40、溶液pH4.5、超聲時間35min條件下，研究超聲溫度35、40、45、50、55℃對甜菊糖提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，在20～50℃，甜菊糖的提取率不斷增大，并在超聲溫度50℃時達到峰值。當超聲溫度高于50℃之后，甜菊糖的提取率逐漸下降，可能由于超聲溫度達到50℃時，纖維素酶活力達到最大，當溫度高于50℃時，纖維素酶的活力降低，從而影響了甜菊糖的溶出。故可初步判定超聲溫度50℃對提取甜葉菊的甜菊糖影響最顯著。

2.4.2 最小抑菌濃度 通過抑菌效果測定實驗分析，甜菊糖對4種供試菌都有一定的抑制作用。因此，可采用二倍法稀釋甜菊糖溶液加入到液體培養(yǎng)基中，觀察不同供試菌的生長情況，將培養(yǎng)基中不長菌時的甜菊糖最低濃度作為最小抑菌濃度（MIC），實驗結(jié)果見表5。結(jié)合抑菌效果測定結(jié)果：當甜菊糖濃度較高時，對細菌的抑制效果更顯著，當甜菊糖濃度較低時，對霉菌的抑制效果更顯著。從表5可以看出，隨著甜菊糖濃度降低，培養(yǎng)基中開始有菌生長。從實驗結(jié)果來看，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、毛霉、根霉的最小抑菌濃度（MIC）分別為20、40、10、80mg/mL。

3 結(jié)論

本文采用Design Expert 8.0.6 軟件，通過響應面分析得到甜菊糖提取率和纖維素酶量、超聲溫度、超聲時間3因素的模型方程，各因素對甜菊糖提取率的影響從大到小依次為纖維素酶量>超聲時間>超聲溫度。最佳提取工藝參數(shù)為纖維素酶0.5%，超聲溫度50℃，超聲時間35min，在此條件下，甜菊糖的提取率為18.86%。因此，在保證甜菊糖提取率的前提下，利用超聲波輔助纖維素酶提取甜葉菊中的甜菊糖的提取更為高效。

甜菊糖對4種供試菌均表現(xiàn)出一定的抑制作用，對各供試菌的抑菌性大小為大腸桿菌>枯草芽孢桿菌、毛霉>根霉。當甜菊糖濃度較高時，對細菌的抑制效果比霉菌更顯著;當甜菊糖濃度較低時，對霉菌的抑制效果比細菌更顯著。其中，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、毛霉、根霉的最小抑菌濃度（MIC）分別為20、40、10、80mg/mL。

參考文獻

[1]趙秀玲.我國甜味劑甜菊糖苷發(fā)展狀況[J].中國調(diào)味品，2009，34（05）：110-113.

[2]劉貴君，石浩.甜菊糖的應用研究進展[J].浙江化工，2016，47（11）：34-41.

[3]陳育如，楊鳳平，楊帆，等.甜葉菊及甜菊糖的多效功能與保健應用[J].南京師大學報（自然科學版），2016，39（02）：56-60.

[4]楊洋，李啟明，高航，等.甜菊糖苷功能特性與應用現(xiàn)狀[J].食品工業(yè)，2018，39（11）：270-272.

[5]張麗娜，于濤，高冷.從甜菊葉中提取和精制甜菊苷的工藝研究[J].中國調(diào)味品，2008（01）：58-59，64.

[6]王永祥，祁斌，何唯東，等.溶劑法提取甜葉菊甙（Ⅰ）[J].杭州師院學報（自然科學版），1984（S1）：24-25.

[7]郁軍，岳鵬翔，郁紅，等.三級逆流法提取甜菊糖甙的工藝研究[J].食品科學，2009，30（02）：146-148.

[8]萬水昌，王志祥，樂龍，等.超聲提取技術(shù)在中藥及天然產(chǎn)物提取中的應用[J].西北藥學雜志，2008（01）：60-62.

[9]黃瓊，何燕萍.超聲波輔助提取玫瑰茄多糖工藝研究[J].食品研究與開發(fā)，2019，40（05）：123-127.

[10]王雨東.蟲草多糖酶提取及純化工藝研究和優(yōu)化[D].上海：華東理工大學，2017.

[11]黎英，陳雪梅，嚴月萍，等.超聲波輔助酶法提取紅腰豆多糖工藝優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)工程學報，2015，31（15）：293-301.

[12]孟憲軍，劉曉晶，孫希云，等.藍莓多糖的抗氧化性與抑菌作用[J].食品科學，2010，31（17）：110-114.

[13]孫義玄，包怡紅.艾蒿多糖抑菌活性及穩(wěn)定性[J].食品與生物技術(shù)學報，2017，36（09）：990-995.

（責編：張宏民）