呂建偉， 胡廷會(huì)， 成良強(qiáng)， 饒慶琳， 王 軍

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 油料研究所， 貴州 貴陽(yáng) 550006)

花生(ArachishypogaeaL.)脂肪酸成分主要包括油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、山崳酸、花生酸、花生烯酸和二十四烷酸8種。其中，油酸(45%～48%)和亞油酸(32%～35%)的含量占脂肪酸組成的80%以上[1-3]，二者都是有益脂肪酸。油酸能夠降低人體血液中的低密度脂蛋白(LDL)，保持高密度脂蛋白(HDL)，減少心血管疾病的發(fā)生，對(duì)人體脂質(zhì)代謝具有重要作用。與亞油酸相比，油酸的抗氧化能力強(qiáng)，高油酸花生(油酸含量80%、亞油酸2%左右)制品的貨架保質(zhì)期是普通花生(油酸45%、亞油酸35%)的3倍以上[4]。油酸和亞油酸含量的比值決定花生油的品質(zhì)，高油酸花生有助于提升營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保障其制品質(zhì)量安全。鑒于高油酸花生的生產(chǎn)意義，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外育種工作者已將提高油酸含量列為花生遺傳育種的主要目標(biāo)之一。

當(dāng)前，高油酸花生品種已在澳大利亞、阿根廷、美國(guó)、巴西、南非以及以色列等國(guó)家得到大規(guī)模推廣種植[5]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)育種單位在高油酸花生品種選育方面取得較大進(jìn)展，相繼育成冀花16、花育961、桂花37、開(kāi)農(nóng)176等近30個(gè)高油酸品種，有力推動(dòng)我國(guó)普通油酸品種向高油酸品種的更新，為實(shí)現(xiàn)我國(guó)高油酸花生產(chǎn)業(yè)化提供材料支撐。借助當(dāng)前分子輔助育種技術(shù)，制定合理的高油酸花生育種策略，是進(jìn)一步提高高油酸育種效率的重要措施。因此，圍繞高油酸花生不飽和脂肪酸的生物合成途徑、高油酸性狀的遺傳機(jī)制、分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)以及育種策略等幾個(gè)方面展開(kāi)綜述，旨在進(jìn)一步深化高油酸花生育種實(shí)踐，加快我國(guó)高油酸花生育種步伐。

1 花生油脂中不飽和脂肪酸的合成代謝途徑

1.1 合成不飽和脂肪酸的重要酶類(lèi)

花生油脂中的不飽和脂肪酸主要為油酸和亞油酸。甘油三酯(Triacylglycerol，TAG)是由1分子甘油與3分子長(zhǎng)鏈脂肪酸酯化形成的脂肪分子，在成熟的油料種子脂肪中的含量約占97%，其脂肪酸種類(lèi)和比例決定了脂肪酸組成。在TAG合成代謝的通路中，卵磷脂(Phosphatidylcholine，PC)是多不飽和脂肪酸合成的重要載體，90%以上的脂肪酸在PC上合成代謝。PC上酯化連接的油酸在脂肪酸去飽和酶(Fatty acid desaturase，F(xiàn)AD)催化下產(chǎn)生亞油酸，是油料種子中亞油酸合成的最重要途徑。在植物不飽和脂肪酸合成代謝途徑所涉及的FAD酶類(lèi)中，?；?ACP去飽和酶發(fā)揮了重要作用，其包括催化硬脂酸合成油酸的Δ9脂肪酸去飽和酶，以及催化油酸合成亞油酸的Δ12脂肪酸去飽和酶，而Δ12脂肪酸去飽和酶是直接決定花生脂肪酸中油酸、亞油酸含量的關(guān)鍵酶。

1.2 油酸、亞油酸的合成代謝途徑

在多不飽和脂肪酸合成代謝途徑中，卵磷脂(PC)上的亞油酸等多不飽和脂肪酸主要經(jīng)2種途徑被組裝在TAG分子上。第1種途徑是發(fā)生在?；?CoA池和PC間的?；庉?Acyl editing)反應(yīng)，經(jīng)溶血卵磷脂?；D(zhuǎn)移酶(Llysophosphatidylcholine acyltransferase，LPCAT)的酯化催化，完成油酰-CoA與PC的酰基化組裝，再經(jīng)FAD2和FAD3酶脫氫后形成不飽和脂肪酸卵磷脂(PUFA-PC)，又在LPCAT酶的反向催化作用下PUFA-PC去?；尫懦龅膩営王?CoA(Polyunsaturated fatty acid CoA)進(jìn)入?；鵆oA池[6-7]，最終亞油酰-CoA在二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(Diacylglyceryl transferase，DGAT)的作用下組裝在TAG上(圖 1b、c)；第2種途徑是發(fā)生在二酰甘油和PC間的酯酰交換反應(yīng)(圖1c)，主要在磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(Phosphatidylglyceryl transferase，PDAT)、磷脂酰膽堿二酰甘油膽堿磷酸酶(Phosphatidylcholine diacylglycerol cholinephosphotransferase，PDCT)和肉堿?；D(zhuǎn)移酶(Carnitine acyltransferase，CPT)等酶催化下的多不飽和脂肪酸摻入TAG的合成途徑[8-12]。

圖1油料作物種子甘油三酯的合成路徑

Fig.1 Triglyceride synthesisi pathway in oil crop seed

2 花生高油酸性狀的遺傳基礎(chǔ)

20世紀(jì)80年代，NORDEN等[13]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高油酸花生種質(zhì)F435，其油酸含量為80%、亞油酸含量為2%，與橄欖油中的油酸含量相當(dāng)。高油酸花生種質(zhì)F435在世界范圍內(nèi)都有育種利用，我國(guó)育成的高油酸花生品種也多數(shù)來(lái)源于該種質(zhì)[14]。由于該自然突變種質(zhì)在育種上的廣泛應(yīng)用，明晰其高油酸性狀產(chǎn)生的遺傳規(guī)律及其分子機(jī)制成為推進(jìn)高油酸育種工作的關(guān)鍵。研究者將該突變體及其衍生材料作為研究對(duì)象開(kāi)展了大量的研究工作，為高油酸花生品種選育奠定了理論基礎(chǔ)[15-21]。

2.1 花生高油酸性狀的遺傳規(guī)律

在花生高油酸性狀遺傳研究中，研究者采用孟德?tīng)柦?jīng)典分離分析方法和數(shù)量性狀遺傳模型分析方法，將普通油酸和高油酸品種進(jìn)行雜交，統(tǒng)計(jì)分離世代的普通油酸、高油酸性狀單株或株系的數(shù)量和分離比例，分析高油酸性狀的遺傳規(guī)律。研究者將F435與普通油酸品種的雜交分離世代開(kāi)展油酸含量分析，證實(shí)花生高油酸性狀受2對(duì)隱性基因控制[18,22-23]，基因型命名為ol1ol1ol2ol2或aabb。丁錦平等[24]以親本汕油162和SunOleic95R雜交得到的F2代遺傳群體進(jìn)行油亞比值(O/L值)分析發(fā)現(xiàn)，O/L值受2對(duì)加性-顯性-上位性主基因控制；韓柱強(qiáng)等[25]利用高油酸親本8-153和普通油酸親本粵油13進(jìn)行雜交，對(duì)2個(gè)親本、F1、F2和F2:3的油酸、亞油酸進(jìn)行多世代聯(lián)合分析認(rèn)為，花生油酸性狀和亞油酸性狀同時(shí)由2對(duì)主基因控制，其對(duì)油酸、亞油酸的作用效應(yīng)相反，此外油酸含量還受其他微效基因的影響。BARKLEY等[5]利用高油酸和普通油酸花生種質(zhì)配制了6個(gè)雜交組合，并分析了539個(gè)F2的脂肪酸成分和ahFAD2基因型，其中5個(gè)雜交組合F2的高油酸性狀遺傳由2對(duì)隱性基因(ol1ol1ol2ol2)控制，另1個(gè)雜交組合高油酸性狀的遺傳表現(xiàn)單基因(ol2ol2)遺傳分離模式，在分子水平上分析解釋了該組合普通油酸親本含有與高油酸親本相同的ol1ol1隱性基因位點(diǎn)，即由于ol1/FAD2A基因序列突變所致。

2.2 花生高油酸性狀的分子機(jī)制

花生油酸到亞油酸的轉(zhuǎn)化主要由ahFAD2A和ahFAD2B2對(duì)分別定位于A09和B09染色體上的同源非等位基因控制[26]。花生高油酸突變體F435的ahFAD2A和ahFAD2B基因序列在ORF區(qū)域具有99%的同源性，ahFAD2A基因的ORF-448 bp處發(fā)生G/A替換，編碼的天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於０罚a(chǎn)生的FAD2A酶活性下降；ahFad2B基因的ORF-441_442 bp處發(fā)生A堿基插入導(dǎo)致移碼突變，產(chǎn)生的FAD2B酶完全失活。F435的高油酸性狀是由ahFAD2A和ahFAD2B兩對(duì)同源非等位基因的共同突變產(chǎn)生[16-17]，與F435類(lèi)型的高油酸突變體不同，化學(xué)突變創(chuàng)制的M2-225和C458高油酸突變體的ahFAD2B基因功能喪失是由反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件插入到ORF編碼區(qū)導(dǎo)致[27]?？傊?，花生高油酸性狀產(chǎn)生的分子機(jī)制與FAD2A和FAD2B基因的突變導(dǎo)致對(duì)應(yīng)編碼的酶失活或活性下降有關(guān)。

2.3 花生 ahFAD2基因的遺傳效應(yīng)

ahFAD2A和ahFAD2B2個(gè)非等位基因共包含9種基因型，其中aabb基因型花生的油酸含量最高[17]，這些基因型按照突變位點(diǎn)數(shù)量分為0、1、2、3、4個(gè)5種類(lèi)型。研究表明，隨著個(gè)體的ahFAD2基因突變位點(diǎn)數(shù)量增多，油酸含量升高，亞油酸含量降低，突變位點(diǎn)數(shù)量相同(如AaBb、aaBB和AAbb)的則沒(méi)有差異[5]?？梢?jiàn)，ahFAD2A和ahFAD2B基因表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，ahFAD2A對(duì)油酸和亞油酸的表型變異解釋率分別為17.4%和19.5%，ahFAD2B的表型變異解釋率分別為33.8%和41.0%，ahFAD2B的基因效應(yīng)大于ahFAD2A的基因效應(yīng)[19]。PANDEY等[26]在研究中同樣發(fā)現(xiàn)FAD2B的表型變異解釋分別為26.54%、25.59%和41.02%，F(xiàn)AD2A的表型變異解釋分別為8.08%、6.86%和3.78%。BARKLEY等[5]還認(rèn)為，ahFAD2A和ahFAD2B基因存在加性效應(yīng)，協(xié)同調(diào)控花生種子油酸含量，2對(duì)基因具有不完全顯性，子代油酸含量受親本表型影響，其他微效修飾基因也參與了油酸的合成代謝。

花生ahFAD2基因還與其他脂肪酸具有一定相關(guān)性。研究表明，油酸與亞油酸、硬脂酸、花生酸的含量呈顯著負(fù)相關(guān)，其中，與亞油酸相關(guān)性最高(相關(guān)性系數(shù)R=-0.701，P<0.0001)[21]。ahFAD2A和ahFAD2B基因型與油酸、亞油酸、棕櫚酸和油亞比(O/L)含量顯著相關(guān)，具有遺傳多效性[5,22,28]。

3 常用花生高油酸分子輔助選擇技術(shù)

在作物育種過(guò)程中，常規(guī)育種方法存在育種周期長(zhǎng)、育種群體龐大且選擇低效等問(wèn)題，為選擇出含有目標(biāo)性狀的優(yōu)異品系，需投入大量人力、物力。隨著生命科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，分子輔助選擇技術(shù)(Marker assisted selection，MAS)已在作物育種上得到應(yīng)用，其可快速、準(zhǔn)確地將含有目標(biāo)性狀和目的基因的個(gè)體從雜交子代中選擇出來(lái)。在花生高油酸育種中，根據(jù)ahFAD2A、ahFAD2B編碼區(qū)及突變位點(diǎn)(ahFAD2A448G>A、ahFAD2B441_442insA)信息開(kāi)發(fā)出了一系列MAS檢測(cè)技術(shù)，包括酶切擴(kuò)增多態(tài)性(Cleaved amplified polymorphisms，CAPS)[29-30]、qRT-PCR分型檢測(cè)[31-32]、PCR產(chǎn)物直接測(cè)序及位點(diǎn)特異性PCR(AS-PCR)[33-35]等技術(shù)。MAS技術(shù)能夠精準(zhǔn)地將ahFAD2(a_b_)基因型的單株從F2或F3早期分離世代群體中篩選出來(lái)，去除未攜帶目標(biāo)基因位點(diǎn)的單株，可縮小群體數(shù)量，提高育種效率4～16倍[36]，育種周期可縮短3年左右。

3.1 CAPS分型檢測(cè)技術(shù)

酶切擴(kuò)增多態(tài)性(Cleaved amplified polymorphisms，CAPS)技術(shù)利用限制性?xún)?nèi)切酶(如Hpy99I、DdeⅠ等)識(shí)別、酶切ahFAD2A/ahFAD2B基因448 bp處的 G>A和442 insA SNP位點(diǎn)，使酶切產(chǎn)物片段呈現(xiàn)大小不同的多態(tài)性，以此為判斷依據(jù)對(duì)FAD2A/FAD2B基因分型[23,29]。根據(jù)ahFAD2A基因的上游5′UTR區(qū)和編碼區(qū)設(shè)計(jì)特異引物，上游引物序列為5′- GATTACTGATTATTGACTT-3′，含有19 bp特異序列，下游引物5′-CCAACCCAAACCTTTCAGAG-3′。經(jīng)PCR擴(kuò)增，目的產(chǎn)物條帶大小826 bp，純化后利用能夠識(shí)別CGACG序列的限制性?xún)?nèi)切酶Hpy99I酶切，識(shí)別位點(diǎn)序列的堿基G是ahFAD2A基因序列448 bp處的G堿基，因而只有野生型的ahFAD2A基因擴(kuò)增片段才能夠被酶切為598 bp和228 bp的產(chǎn)物，而純合隱性突變型的擴(kuò)增片段則不能發(fā)生酶切(圖2)。

圖2 利用 CAPS鑒定花生核心種質(zhì) ahFAD2A的基因型

Fig.2 GenotypingahFAD2Aof peanut core collection employing CAPS technology

3.2 AS-PCR分型檢測(cè)技術(shù)

等位基因特異性PCR(allele-specific PCR)分型檢測(cè)技術(shù)基于SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增、電泳，根據(jù)電泳結(jié)果的有無(wú)判斷目的基因的基因型。CHEN等[33]最先設(shè)計(jì)出花生FAD2基因的AS-PCR分型檢測(cè)方法，但其方法不能準(zhǔn)確分辨出AaBB和aaBB或AABb和AAbb的基因類(lèi)型。YU等[34]根據(jù)ahFAD2A(448G>A)/ahFAD2B(441_442insA)突變堿基的差異共設(shè)計(jì)7條AS-PCR引物(表1)，通過(guò)將1個(gè)錯(cuò)配堿基置于其中4條引物的3’端的第二或第三位以確保檢測(cè)的特異性。經(jīng)4個(gè)PCR反應(yīng)來(lái)檢測(cè)ahFAD2A/ahFAD2B的突變型或野生型以及通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳條帶大小來(lái)判斷各位點(diǎn)的雜合或純合性，按照?qǐng)D22〗3所示的4個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)行。其中，反應(yīng)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分別鑒定ahFAD2A/ahFAD2B的野生型(A)、突變型(a)、野生型(B)、突變型(b)位點(diǎn)，反應(yīng)Ⅰ、Ⅱ和反應(yīng)Ⅲ、Ⅳ分別能夠雙向驗(yàn)證ahFAD2A/ahFAD2B的純合性。在PCR反應(yīng)中，每個(gè)反應(yīng)體系需要加入3條引物，其他反應(yīng)條件與常規(guī)PCR相同。

根據(jù)電泳結(jié)果，當(dāng)反應(yīng)Ⅰ中出現(xiàn)2條帶，則ahFAD2A含有野生型A，出現(xiàn)1條帶，則ahFAD2A不含有野生型A；當(dāng)反應(yīng)Ⅱ中出現(xiàn)2條帶時(shí)，則ahFAD2A含有突變型a，出現(xiàn)1條帶，則ahFAD2A不含有突變型a；同樣，反應(yīng)Ⅲ中出現(xiàn)2條帶，則ahFAD2B含有野生型位點(diǎn)B，出現(xiàn)1條帶，則不含有野生型位點(diǎn)B；反應(yīng)Ⅳ出現(xiàn)2條帶，則ahFAD2B含有突變型位點(diǎn)b，出現(xiàn)1條帶，則ahFAD2B不含有突變型位點(diǎn)b。如圖4所示，泳道1～9代表9種基因型。其中，泳道1表示野生純合基因型(AABB)，泳道2表示AABb，泳道3表示AAbb，泳道4表示AaBB，泳道5表示AaBb，泳道6表示Aabb，泳道7表示aaBB，泳道8表示aaBb，泳道9表示aabb。該技術(shù)通過(guò)4次PCR反應(yīng)，可快速、有效地將9種基因型分辨出來(lái)。

表1ahFAD2A/ahFAD2BAS-PCR引物序列信息

Table 1 AS-PCR primer information ofahFAD2A/ahFAD2B

引物名稱(chēng)Primer引物序列Sequence (5' to 3') FAD2A-F GATTACTGATTATTGACTTGCTTTG FAD2A-G GTTTTGGGACAAACACTTCTTC FAD2A-A GTTTTGGGACAAACACTTCTTT FAD2B-F CAGAACCATTAGCTTTGTAGTAGTG FAD2B-C AACACTTCGTCGCGGTTG FAD2B-A AACACTTCGTCGCGGTTT FAD2-R CTCTGACTATGCATCAGAACTTGT

注：引物序列中下劃線(xiàn)標(biāo)注指錯(cuò)配堿基。

Note: Mismatched bases were underlined in some primer sequences.

圖3 FAD2 基因分型的4個(gè) AS-PCR反應(yīng)

圖4 AS-PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè) ahFAD2A/ahFAD2B的基因型

Fig.4 Electrophoresis detection of AS-PCR products for genotypingahFAD2/ahFAD2B

3.3 Real-time PCR分型檢測(cè)技術(shù)

通過(guò)在ahFAD2A和ahFAD2B突變位點(diǎn)上各設(shè)計(jì)突變型探針和野生型探針，在兩端保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，然后根據(jù)熒光信號(hào)分辨其基因型[31-32,37]。根據(jù)ahFAD2A和ahFAD2B的基因序列及其突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)了引物，以及與各個(gè)基因?qū)?yīng)的突變型6-FAM和野生型VIC熒光基團(tuán)探針(表2)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分別用于檢測(cè)ahFAD2A和ahFAD2B的基因型，利用該方法可檢測(cè)所有的9種基因型。

表2 熒光定量 PCR技術(shù)的引物和探針信息

3.4 KASP分型檢測(cè)技術(shù)

KASP(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)是一種獨(dú)特的競(jìng)爭(zhēng)性位點(diǎn)特異PCR，基于雙熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)原理對(duì)SNP位點(diǎn)檢測(cè)分型[38-40]。ZHAO等[41]根據(jù)ahFAD2A和ahFAD2B的SNP位點(diǎn)信息，利用KASP技術(shù)原理將突變型等位基因引物序列ahFAD2A-Allele-l或ahFAD2B-Allele-l的5’端連接帶有FAM熒光染料的Allele-l Tail引物，同樣在野生型等位基因引物序列ahFAD2A-Allele-2或ahFAD2B-Allele-2的5’端連接帶有HEX熒光染料的Allele-l Tail引物(表3)。當(dāng)引物與ahFAD2A或ahFAD2B序列結(jié)合，熒光染料與淬滅基團(tuán)分離，產(chǎn)生熒光信號(hào)。不同的基因型產(chǎn)生不同的熒光信號(hào)，從而完成基因分型。兩條common引物存在堿基序列差異，可將ahFAD2A和ahFAD2B區(qū)分開(kāi)，因此一個(gè)反應(yīng)能夠同時(shí)完成ahFAD2A和ahFAD2B的基因分型。

表3ahFAD2A和ahFAD2B基因分型的 KASP引物信息

Table 3 Information of KASP primer sequences for genotypingahFAD2AandahFAD2B

引物Primer序列Sequence(5′ to 3′)AhFAD2A-Allele-lGTTTTGGGACAAACACTTCGTTAhFAD2A-Allele-2GTTTTGGGACAAACACTTCGTCAhFAD2A-commonCGCCACCACTCCAACACCAhFAD2B-Allele-lCAAACACTTCGTCGCGGTCTAhFAD2B-Allele-2CAAACACTTCGTCGCGGTCGAhFAD2B-commonCCGCCACCACTCCAACACAAllele-l Tail (FAM tail)GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAllele-2 Tail (HEX tail)GAAGGTCGGAGTCAACGGATT

注：下劃線(xiàn)標(biāo)識(shí)堿基為ahFAD2A和ahFAD2B野生型和突變型的SNP位點(diǎn)。

Note:SNP loci was marked with bold type and underlines both in wild and mutant types.

KASP技術(shù)方法中的熒光染料較qRT-PCR的Taqman探針的成本低，該技術(shù)還具有高通量、高度特異性和高度靈敏性等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于水稻[42]、小麥葉片銹病抗性[43]、柑橘[44-45]、大豆線(xiàn)蟲(chóng)抗性[46-47]、蘋(píng)果抗病性[48]等作物的SNP檢測(cè)分型。

3.5 PCR產(chǎn)物測(cè)序法

該方法是最直接、最準(zhǔn)確檢測(cè)親本、雜交F1、BC1F1～BC4F1基因型的方法。親本基因型的鑒定需要2次PCR反應(yīng)，利用引物對(duì)FAD2A-F/FAD2A-R進(jìn)行單個(gè)PCR擴(kuò)增親本的ahFAD2A基因片段，引物對(duì)FAD2B-F/FAD2B-R擴(kuò)增親本的ahFAD2B基因片段(表4)。利用Internal1和Internal2測(cè)序引物對(duì)基因擴(kuò)增片段進(jìn)行雙向測(cè)序，根據(jù)突變型ahFAD2A在448 bp處G>A堿基和突變型ahFAD2B在442 bp處insA的SNP信息，讀取該序列位置的測(cè)序峰圖，判斷親本基因型[49]。

表4 花生 ahFAD2A和 ahFAD2B的PCR 產(chǎn)物測(cè)序的引物信息

3.6 技術(shù)評(píng)價(jià)

由于ahFAD2A/ahFAD2a、ahFAD2B/ahFAD2b均只存在1個(gè)堿基的差別，應(yīng)用AS-PCR、熒光定量PCR和KASP技術(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，無(wú)法避免假陽(yáng)性結(jié)果[33]，且利用AS-PCR、CAPS以及熒光定量PCR等技術(shù)對(duì)每份花生樣品的檢測(cè)需要至少2次PCR反應(yīng)，檢測(cè)程序繁瑣。此外，CAPS檢測(cè)技術(shù)涉及酶切，對(duì)DNA質(zhì)量要求高[29]，且不能將純合野生型的AA和雜合基因型的Aa區(qū)分，只能用于檢測(cè)親本或種質(zhì)資源等純合基因型材料。熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用的特異性熒光探針成本高[31-32]，具有一定假陽(yáng)性率。與以上技術(shù)方法相比，KASP檢測(cè)方法具有高通量檢測(cè)特點(diǎn)，適用于檢測(cè)分離世代中的成百上千個(gè)單株，同時(shí)結(jié)合其他檢測(cè)方法剔除假陽(yáng)性單株。此外，利用F0.7/R3引物對(duì)進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增和測(cè)序就能夠準(zhǔn)確檢測(cè)ahFAD2A和ahFAD2B基因型，較以往報(bào)道的測(cè)序方法更加準(zhǔn)確、高效。

3.7 分子輔助選擇技術(shù)應(yīng)用

隨著花生高油酸性狀分子遺傳機(jī)制的解析，基因分型技術(shù)日趨成熟，在花生高油酸育種上得到了廣泛應(yīng)用[50-51]。NAWADE等[28]利用AS-PCR技術(shù)和CAPS技術(shù)檢測(cè)印度174份花生種質(zhì)的油酸基因型，80份花生種質(zhì)在ahFAD2A位點(diǎn)的448bp處發(fā)生G>A堿基替換。李麗等[52]利用單粒近紅外光譜技術(shù)(Near infrared reflectance spectroscopy，NIRS)和氣相色譜(Gas chromatographic，GC)對(duì)F2:3家系和F4種子進(jìn)行初步篩選，將篩選到的高油酸材料進(jìn)行AS-PCR鑒定，得到純合高油酸材料4個(gè)，其油酸含量介于81.1%～82.7%。JANILA等[53]利用標(biāo)記輔助回交和標(biāo)記輔助選擇方法將SunOleic 95R高油酸材料的ahFAD2突變位點(diǎn)滲入到ICGV06110、ICGV06142和ICGV06420中，利用AS-PCR技術(shù)篩選出469份油酸含量在62%～83%的后代材料，較輪回親本提高50%～110%，亞油酸含量降低40%～100%，棕櫚酸含量降低10%～60%。WANG等[54]以美國(guó)花生微核心種質(zhì)為研究材料，利用SNP功能標(biāo)記進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)ahFAD2A/ahFAD2B基因分型及分布情況，發(fā)現(xiàn)ahFAD2B基因未發(fā)生突變，所有的102份種質(zhì)均為野生型；ahFAD2A存在3種基因型，其中58份種質(zhì)為野生型，2份種質(zhì)為雜合突變型，42份種質(zhì)為純隱性突變型。可見(jiàn)，在花生高油酸育種工作中綜合利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)和高油酸鑒定方法，可準(zhǔn)確、高效地從育種后代群體中選擇出帶有高油酸性狀的目標(biāo)材料。

4 高油酸花生育種策略

培育高油酸花生新品種的常用技術(shù)方法是回交育種，一般以輪回親本作為母本，高油酸供體親本和BCnF1作為父本。該方法具有以下幾方面的優(yōu)點(diǎn)：一是采用回交法，2年可實(shí)現(xiàn)4～5次回交，育種后代的絕大部分細(xì)胞核遺傳物質(zhì)來(lái)自輪回親本，可在短時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定；二是在回交過(guò)程中，以輪回親本(AABB)做母本，如去雄不徹底則會(huì)產(chǎn)生單一基因型的假雜種(AABB)，易于與真雜種(AaBb)區(qū)分；三是輪回親本作母本有利于將受細(xì)胞質(zhì)遺傳控制的優(yōu)異性狀傳遞給育種后代，如花生的青枯病抗性；四是以BCnF1作父本提供花粉，同時(shí)對(duì)其自交產(chǎn)生的F2、BCnF2種子進(jìn)行系譜育種，從分離世代篩選高油酸單株。

通過(guò)連續(xù)雜交和回交，在此過(guò)程中利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)對(duì)F1和BCnF1進(jìn)行雜交種基因型鑒定，獲得基因型為AaBb的種子。在自交分離世代，利用近紅外線(xiàn)初步篩選出油酸含量達(dá)60%以上的F2和BCnF2的種子，縮小群體選擇的范圍后再利用KASP技術(shù)進(jìn)行基因型檢測(cè)，篩選出基因型為aabb的高油酸單株。下一季將收獲的高油酸單株種子種植成株行，此時(shí)aabb基因型的高油酸性狀能夠穩(wěn)定遺傳，只需從株行中篩選兼具株高、分枝數(shù)、種皮顏色、抗病性、產(chǎn)量以及含油量等其他育種目標(biāo)的單株，在下一季將每株行性狀相近的中選單株混收種成株系，并繼續(xù)選擇形成品系參加區(qū)域聯(lián)合鑒定試驗(yàn)。利用以上育種策略，每年開(kāi)展2～3次雜交、回交，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)和近紅外線(xiàn)分析技術(shù)進(jìn)行中間環(huán)節(jié)控制，可大大縮短育種進(jìn)程[14,55-56]。