王 添， 于 佳， 郭卜瑜， 劉惠萍， 王姣姣， 王金城

(中國海洋大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島266100)

海洋浮游生物探測對于海洋生態(tài)研究和環(huán)境監(jiān)測具有重要意義[1-2]。數(shù)字全息顯微技術(shù)[3-5]作為一種光學(xué)測量方法，與傳統(tǒng)的探測技術(shù)相比，可以實現(xiàn)浮游生物原位、實時、無損壞、快速、大視場、大景深、三維立體探測，因此，被廣泛應(yīng)用于海洋浮游生物的探測與研究。

目前，各種數(shù)字全息或數(shù)字全息顯微系統(tǒng)已用于海洋浮游生物的原位探測，例如，英國阿伯丁大學(xué)的Watson等設(shè)計研制了水下全息照相系統(tǒng)HoloCAM[6]，該系統(tǒng)成功應(yīng)用于海洋浮游生物的實地探測，浮游生物的尺寸從幾十微米到幾十毫米不等，分辨率可達到50 μm。HoloCAM系統(tǒng)能夠同時記錄同軸和離軸全息圖，通過分層再現(xiàn)，可以精確確定生物個體的大小、輪廓和相對位置。美國MIT的Loomis等DHI(Digital Holographic Imaging)系統(tǒng)搭載深海探測設(shè)備，拍攝記錄了深海浮游生物的同軸全息圖，分辨率可達到2.2 μm[7-8]。中國海洋大學(xué)的于佳團隊[9]也成功將數(shù)字全息顯微系統(tǒng)用于海洋浮游生物探測，分辨率可達到7.8 μm。

然而，以上對海洋浮游生物的探測也只是得到其二維平面圖，在一定程度上很難反應(yīng)物體的三維形貌特征，而三維形貌特征作為浮游生物識別歸類和建立三維數(shù)據(jù)庫的重要依據(jù)，對海洋生態(tài)環(huán)境檢測和保護有著重要的意義。因此，本文通過對基于離軸菲涅爾數(shù)字全息顯微的探測實驗進行研究，記錄浮游生物的全息圖，全息圖再現(xiàn)，通過改進的相位恢復(fù)方法，對相位畸變預(yù)消除，直接得到正確的相位信息，避免了后期復(fù)雜的相位補償計算，從而對浮游生物三維形貌快速恢復(fù)。

1 相位畸變產(chǎn)生的原因及其矯正

數(shù)字全息顯微可分為無透鏡傅里葉變換和預(yù)防大離軸菲涅爾全息[10]，前者系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單、緊湊，再現(xiàn)算法簡單(只需要進行一次傅里葉變換)，但成像分辨率不高。后者很好的解決了前者分辨率不高的缺點，在顯微成像探測領(lǐng)域應(yīng)用更廣泛。因此本論文基于預(yù)防大離軸菲涅爾系統(tǒng)，對海洋浮游生物進行了表面形貌的三維重建研究。然而，在再現(xiàn)像的相位測量過程中，物體折射率不均勻以及系統(tǒng)景深對相位分布的影響，再現(xiàn)像產(chǎn)生相位畸變，相位畸變是指對全息圖進行數(shù)字再現(xiàn)得到的再現(xiàn)像的相位分布，與被測物體實際相位分布之間的差異，本論文中研究的相位畸變包括一次畸變和二次相位畸變[11-12]。

1.1 一次相位畸變及其矯正

在離軸菲涅爾數(shù)字全息圖記錄中，物光和參考光分別為O(x,y)、R(x,y)，夾角為θ，參考光豎直和水平方向的夾角分別為α、β，參考光表達式如下：

(1)

全息圖再現(xiàn)的過程中，若模擬原參考光再現(xiàn)，則需要在再現(xiàn)算法中非常準(zhǔn)確的設(shè)置參考光的偏置角，然而這個角度較小無法直接測量。一般的再現(xiàn)算法不考慮這個偏置角度，直接模擬垂直照射的平面波進行再現(xiàn)，這樣就出現(xiàn)了數(shù)值模擬的再現(xiàn)光不能準(zhǔn)確的還原傳統(tǒng)光學(xué)全息所用的再現(xiàn)光。因此，再現(xiàn)像的相位產(chǎn)生畸變，成為一次相位畸變。由具體的推算過程可以得到一次相位畸變因子離散化表達式如下：

(2)

其中：m和n(m≥-N/2,n≤N/2-1)為再現(xiàn)像面的像素坐標(biāo)；Δxi和Δyi為像平面的像素尺寸，其大小根據(jù)不同的再現(xiàn)算法而定。

一次相位畸變與參考光和物光夾角有關(guān)，實際實驗中這一角度無法直接測量，針對這一問題，本論文提出一種改進的卷積再現(xiàn)算法，能準(zhǔn)確設(shè)置再現(xiàn)光的偏置角度，達到矯正一次相位畸變的目的。具體的矯正步驟如下：

(1)運行菲涅爾再現(xiàn)算法，設(shè)置不同的再現(xiàn)距離對全息圖進行再現(xiàn)，得到一系列不同再現(xiàn)距離下的再現(xiàn)像，將這些像中的聚焦像的再現(xiàn)距離代入卷積再現(xiàn)算法中，作為全息圖的再現(xiàn)距離。

(2)角度定標(biāo)。在卷積再現(xiàn)算法中引入帶有偏置角度的參考光如式(1)，α可通過圖像處理軟件(如Photoshop)的標(biāo)尺功能讀取圖干涉條紋的傾斜度數(shù)得出，β是算法中的待測參數(shù)，運行卷積算法得到不同β角度下的再現(xiàn)圖，當(dāng)?shù)玫骄劢乖佻F(xiàn)像時，α、β的值即為參考光準(zhǔn)確的偏置角度。

(3)得到準(zhǔn)確的偏置角度后，利用卷積算法對同樣實驗條件下拍攝的其它全息圖進行處理，提取再現(xiàn)像振幅圖和無畸變的相位圖。

該方法是在全息圖聚焦位置和參物角都未知的情況下，首先運行菲涅爾算法找到聚焦位置，然后再利用卷積算法確定參考光的偏置角度。定標(biāo)過程稍顯繁瑣，但是，參物角一旦確定，就可以在該條件下進行多次實驗。因此，只需要進行一次定標(biāo)實驗，即可對相位畸變實現(xiàn)預(yù)消除，這相對于在后期對已經(jīng)產(chǎn)生的相位畸變進行繁瑣的相位畸變補償計算，大大加快了相位恢復(fù)的速度。

1.2 二次相位畸變及其矯正

預(yù)放大離軸菲涅爾數(shù)字全息記錄光路中，物平面和CCD平面加入了顯微物鏡(MO)用來放大被測樣品的物光場。如圖1所示。

圖1 預(yù)放大離軸數(shù)字全息記錄光路示意圖Fig.1 Schematic of pre-magnificate off-axisl digital hologram recording system

被測物經(jīng)MO成像在CCD后面的像平面上，在CCD面接受的是放大的虛像，參考光在CCD面上發(fā)生干涉得到數(shù)字全息圖。在MO成像過程中造成了二次相位畸變。二次相位畸變因子的表達式為：

(3)

其中二次畸變因子只與MO的焦距和放大率有關(guān)，與參物夾角、記錄距離等條件無關(guān)。

物光光路的顯微物鏡發(fā)出的球面波引起了二次相位畸變，那么在參考光的光路中引入一個發(fā)出等曲率球面波的顯微物鏡，就可以對相位畸變進行補償。具體方法為：在物光光路不引入被測物的前提下，微調(diào)兩個顯微物鏡，使得兩束光的干涉條紋平行等間距分布。此時兩束光等曲率面彎曲，從而達到消除二次相位因子的目的。

通過參物角定標(biāo)和引入顯微物鏡，可以在相位畸變之前進行預(yù)消除，避免了后期繁瑣的相位畸變矯正算法研究。

2 實驗

2.1 實驗系統(tǒng)簡介

如圖2為實驗系統(tǒng)光路圖，激光經(jīng)過偏振分光棱鏡(PBS)被分為物光和參考光兩束，兩束光分別經(jīng)過擴束準(zhǔn)直。通過PBS前的λ/2玻片調(diào)節(jié)兩束光的光強比。物光和參考光分別被顯微物鏡1(MO1)和顯微物鏡2(MO2)放大經(jīng)消偏振棱鏡(BS)到達CCD，在CCD上發(fā)生干涉，記錄下干涉條紋，具體實驗設(shè)備參數(shù)見表1。

圖2 實驗系統(tǒng)光路示意圖Fig.2 Schematic of hologram recording system

2.2 基于分辨率板的相位畸變預(yù)矯正實驗

浮游生物分布探測和三維形貌重建之前，首先利用分辨率板對實驗系統(tǒng)定標(biāo)參數(shù)確定。

第一步：在參考光光路中引入相同參數(shù)的顯微物鏡，微調(diào)兩個顯微物鏡的距離，使得CCD接受到等間距平行的干涉條紋，加入分辨率板拍攝全息圖。

第二步：利用菲涅爾算法再現(xiàn)全息圖，找到再現(xiàn)距離，本實驗中分辨率板再現(xiàn)距離為d=12 cm時，再現(xiàn)圖清晰、聚焦。

第三步：將再現(xiàn)距離以及β=43°(在圖像處理軟件中讀取)代入卷積再現(xiàn)算法，設(shè)置不同的參物夾角α再現(xiàn)全息圖，由結(jié)果可知偏置角為α=7.8°,β=43°時，得到居中、清晰的再現(xiàn)像。

通過偏置角度定標(biāo)和引入等曲率彎曲參考光，對再現(xiàn)像相位畸變進行預(yù)矯正，從而避免了后期繁瑣的后期算法研究。并且，將分辨率板換成其它被測物，進行同樣的處理過程，可以得到被測物無相位畸變的再現(xiàn)像。偏置角度等實驗參數(shù)不變的條件下，被測物更換為海洋浮游生物，進行三維形貌重建實驗。

表1 實驗系統(tǒng)設(shè)備參數(shù)

2.3 浮游生物三維形貌重建實驗

對浮游生物的三維形貌重建，基于其全息圖再現(xiàn)像相位的準(zhǔn)確恢復(fù)，需要進行相位畸變預(yù)矯正、相位提取和相位解包裹[13-15]三個步驟；進而對解包裹相位圖三維視覺化從而實現(xiàn)浮游生物的三維形貌重建[16]。文章以橈足類和夜光蟲為例(在山東省青島市沙子口碼頭海水取樣)，對其進行表面形貌三維重建。

系統(tǒng)放大率12.3×記錄單個橈足類浮游生物全息圖。圖3(a)、(b)分別為記錄全息圖、再現(xiàn)距離d=62 mm的振幅再現(xiàn)圖，由于橈足類有一定大小和厚度，整體無法同時聚焦在同一再現(xiàn)平面上，不同再現(xiàn)距離下橈足類的不同部位在焦，圖3(c)、(d)、(e)分為橈足類為：d=62 cm身體聚焦，d=56 cm觸角聚焦，d=84 cm觸須聚焦。

橈足類不同再現(xiàn)距離下聚焦部分不同，然而前后一定范圍內(nèi)，再現(xiàn)像清晰度變化不大，可認(rèn)為仍然在焦。因此，選取再現(xiàn)距離d=62 cm為橈足類聚焦距離。

圖3 放大率12.3×橈足類全息圖(左上)及其整體和不同部位的振幅再現(xiàn)圖Fig.3 Recording image and amplitude reconstruction image of the whole body and different parts of copecod with 12.3× magnification

圖4 浮游生物的再現(xiàn)包裹相位圖(左)和解包裹相位圖(右)Fig.4 Wrapped and Unwrapped phase reconstruction image of plankton

圖4(a)為聚焦距離d=62 cm處的相位包裹圖，利用基于離散余弦變換法對包裹相位圖進行相位解包裹，圖4(b)為解包裹相位圖。

解包裹相位圖為浮游生物的真實相位分布，相位圖中物體每一點與基準(zhǔn)面存在相位差，根據(jù)整體的相位分布可以得到物體的三維信息分布，在MATLAB中利用這些三維信息對橈足類進行三維重建，圖5為橈足類三維重建圖。

同理，夜光蟲的三維形貌重建結(jié)果如圖6所示。

圖5 橈足類浮游生物表面形貌三維重建圖 Fig.5 3D reconstruction image of copepods’ surface profile

3 分析討論

浮游生物的厚度、透明度、以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度等都會對相位解包裹的速度和準(zhǔn)確性造成影響，進而影響物體三維重建的效果，由圖5和6可知，透明度高、內(nèi)部結(jié)構(gòu)相對簡單的夜光蟲，在相位畸變預(yù)矯正的基礎(chǔ)上，三維重建圖視覺效果相對較好。

解包裹相位圖，如圖4(b)，反應(yīng)的是物體真實相位分布情況，物體上每一點與基準(zhǔn)面都存在相位差，根據(jù)整體的相位分布可以得到物體的三維信息分布，從而對物體進行三維形貌重建。然而，該三維分布并不是物體表面形貌的實際高度分布，而只是物體相位與基準(zhǔn)面的相對相位差分布，但該分布還是可以在一定程度上反映物體三維形貌信息的。

圖6 夜光蟲表面形貌三維重建圖Fig.6 3D reconstruction image of noctilucas

由圖3可知，系統(tǒng)放大率12.3×，橈足類身體線度約為191 μm×175 μm，觸須約為330 μm×19 μm，觸角約為106 μm×30 μm，最小線度均達到3.5 μm。即在放大率為12.3×，系統(tǒng)探測分辨率能達到3.5 μm。

4 結(jié)語

本論文將預(yù)放大離軸菲涅爾數(shù)字全息系統(tǒng)與顯微系統(tǒng)相結(jié)合，應(yīng)用于海洋浮游生物表面形貌三維探測實驗研究中。針對透射型浮游生物的細(xì)微結(jié)構(gòu)和表面形貌，對于尺寸不同的橈足類(0.5～1 mm)和海藻類(100～500 μm)都實現(xiàn)了較好的探測效果，得到了三維化圖像數(shù)據(jù)。由于采用改進的再現(xiàn)算法和全息圖記錄光路，對相位畸變進行預(yù)消除，簡化了后期需要對再現(xiàn)像相位畸變進行繁瑣的相位補償計算，這有利于對海洋浮游生物進行實時探測和快速重建。