白旭東 周兆梅 黃媛 谷巖

【摘要】 目的：建立頂空氣相色譜法測(cè)定大豆異黃酮提取物中有機(jī)溶劑殘留的檢測(cè)方法。方法：采用頂空毛細(xì)管氣相色譜法，DB-624毛細(xì)管氣相色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），氫火焰離子化檢測(cè)器，載氣為氮?dú)?，流速? mL/min;頂空進(jìn)樣，頂空平衡溫度為80 ℃，平衡時(shí)間為30 min，進(jìn)樣體積為1 mL。結(jié)果：測(cè)定的11種有機(jī)溶劑完全分離，線性關(guān)系良好，平均回收率在92.5%～101.2%;RSD均小于5%。結(jié)論：該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏，適合測(cè)定大豆異黃酮提取物中的有機(jī)溶劑殘留量。

【關(guān)鍵詞】 大豆異黃酮提取物;頂空氣相色譜法;有機(jī)溶劑殘留

【DOI編碼】 10.3969/j.issn.1674-4977.2020.05.020

Determination of Residual Organic Solvents in Soybean Isoflavone Extract by Headspace Gas Chromatography

BAI Xu-dong，ZHOU Zhao-mei，HUANG Yuan，GU Yan

（Liaoning Inspection，Examination & Certification Centre，Shenyang 110036，China）

Abstract： Objective Establish a headspace gas chromatography method for detecting the residual organic solvents in Soybean Isoflavone extract. Methods Headspace capillary gas chromatography，DB-624 capillary gas chromatography column （30 m×0.32 mm，0.25 μm），hydrogen flame ionization detector，carrier gas is nitrogen，flow rate is 2 mL/min;headspace sampling，headspace the equilibrium temperature is 80 ℃，the equilibrium time is 30 min，and the injection volume is 1 mL. Results The measured 11 kinds of organic solvents are completely separated，with a good linear relationship，the average recovery rate is 92.5%～101.2%;RSD is less than 5%. Conclusion The method is fast，accurate and sensitive，and is suitable for determining the residual amount of organic solvents in soybean isoflavone extract.

Key words： soybean isoflavone extract;headspace gas chromatography;residual organic solvent

大豆異黃酮是黃酮類(lèi)化合物的一種，是大豆生產(chǎn)過(guò)程中的次生代謝產(chǎn)物，包括大豆甙、黃豆黃素、染料木甙、大豆黃素、黃豆黃素甙元、染料木素等12種成分[1]。研究表明， 大豆異黃酮具有對(duì)血管的防護(hù)作用、類(lèi)似女性雌激素作用以及抗激素作用、抑菌活性和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥等多種生理功能， 最近還有研究證實(shí)它可能作為一種天然抗氧化劑， 而許多天然的抗氧化劑都具有抗腫瘤功效[2]。大豆異黃酮提取物的制備方法有機(jī)溶劑萃取法、加熱回流法、超聲波提取法、微波提取法和超臨界CO2萃取法等[3-6]。

隨著人們對(duì)保健食品的關(guān)注和青睞，以大豆異黃酮提取物為主要成分的保健食品越來(lái)越多，為了有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量和保證用藥安全，按照2020版《中國(guó)藥典》四部的要求和任用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）中藥品有機(jī)溶劑殘留量測(cè)定的指導(dǎo)原則，對(duì)大豆異黃酮提取物中殘留的有機(jī)溶劑進(jìn)行檢測(cè)。本文采用頂空毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、異丙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷、丙酮、苯及2-丁酮11種有機(jī)溶劑殘留。該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，為制定大豆異黃酮提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

GC-2010氣相色譜儀（日本島津公司，配有FID檢測(cè)器和頂空進(jìn)樣器）;SPB-3全自動(dòng)空氣源（北京中惠普分析技術(shù)研究所）;SGH-300高純氫氣發(fā)生器（北京東方精華苑科技有限公司）。

甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、異丙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷、丙酮、苯及2-丁酮均為色譜純;DMSO為分析純。

11批大豆異黃酮提取物分別為不同的廠家來(lái)源（浙江、陜西、廣州、河南等地）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：取甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、異丙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷、丙酮、苯及2-丁酮精密稱(chēng)定，用DMSO制備成質(zhì)量濃度為0.3，0.25，0.05，0.5，0.25，0.125，0.1，0.01，0.05，0.035 mg和0.05 mg的混合對(duì)照品溶液。精密吸取混合對(duì)照品溶液5.0m L，置于20m L頂空瓶中， 加蓋密封。

1.2.2 樣品前處理

取本品1 g，精確稱(chēng)定，置10 mL量瓶中，加DMSO稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5 ml置于10 mL頂空瓶中，加蓋密封。

1.2.3 儀器條件

色譜柱：安捷倫DB-624毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25μm）;程序升溫：起始溫度為40 ℃，保持10 min，以8 ℃/min升溫至130 ℃，保持10 min;載氣為高純氮?dú)猓魉贋? mL/min;檢測(cè)器為FID，檢測(cè)器溫度為250 ℃。

頂空進(jìn)樣器條件：頂空瓶平衡溫度為80 ℃，平衡時(shí)間為30 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇與頂空條件的選擇

試驗(yàn)中考察了DB-624、DB-5、DB-WAX三款毛細(xì)管色譜柱，并對(duì)程序升溫條件進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)色譜柱DM-624分離效果最好，峰型對(duì)稱(chēng)良好，所有溶劑均能有效檢出，最終選用色譜柱住DM-624。

考考察不同頂空平衡溫度（60，70，80，90 ℃）及不同平衡時(shí)間（20，30，40 min）對(duì)各待測(cè)溶劑色譜峰面積的影響，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，各主成分峰的峰面積逐漸變大，但在80 ℃之后基本不變，考慮到溫度越高，越易產(chǎn)生干擾峰，確定平衡溫度為80 ℃。在80 ℃下，通過(guò)平衡不同時(shí)間發(fā)現(xiàn)，在30 min時(shí)，所要研究的溶劑已全部檢出，且峰面積大，分離度較好，所以確定平衡時(shí)間為30 min。

理論板數(shù)以乙醇計(jì)應(yīng)不低于10000，11中化合物全部分離，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 溶劑的優(yōu)化

樣品經(jīng)過(guò)優(yōu)化的提取條件提取后，選用MCX固相萃取小柱對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行凈化，MCX柱填料克服傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)混合型固相萃取吸附劑的局限性，利用頂空進(jìn)樣方式進(jìn)行樣品殘留溶劑的檢測(cè)常用的溶劑主要為水、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜及其他適宜溶劑。由于大豆異黃酮提取物在水中不易溶解，易溶于DMSO，故以DMSO作為溶劑，結(jié)果顯示待測(cè)各成分的峰形好，分離度符合要求，對(duì)測(cè)定結(jié)果不產(chǎn)生干擾。

2.3 方法的線性范圍及檢出限

空白基質(zhì)的制備：按照“1.2.2”項(xiàng)下制備空白基質(zhì)。

精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用空白基質(zhì)稀釋成系列標(biāo)溶液，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得線性方程及相關(guān)系數(shù)，方法檢出限及重復(fù)性見(jiàn)表1。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取已測(cè)定各有機(jī)溶劑殘留量的大豆異黃酮提取物樣品9份，各約1 g，分別置于10 mL量瓶中，精密加入已知量混合對(duì)照品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度3份，加DMSO稀釋至刻度，搖勻，各精密量取5.0 mL，置于20 mL頂空瓶中，加蓋密封，按“1.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

取11批大豆異黃酮提取物樣品各1 g，精確稱(chēng)定，置10 mL量瓶中，加DMSO稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5.0 mL置20 mL頂空瓶中，加蓋密封，按“1.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定。11批購(gòu)自不同生產(chǎn)廠家的樣品檢出的溶劑殘留有甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、丙酮。其中有1批樣品的甲醇超標(biāo)，3批乙醇超限，其他各有機(jī)溶劑殘留量均在限度范圍內(nèi)，2020年版《中國(guó)藥典》四部規(guī)定的溶劑殘留限量見(jiàn)表3。

3 討論

1批樣品檢出甲醇，甲醇為二類(lèi)溶劑，主要原因可能為乙醇中的甲醇?xì)埩艋驗(yàn)榻档统杀局苯邮褂煤罅考状嫉墓I(yè)酒精提取甚至直接使用甲醇提取。乙醇由于是工藝中正常引入，為三類(lèi)溶劑，毒性較小，環(huán)境污染小。由于目前市場(chǎng)上大豆異黃酮沒(méi)有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，所以本實(shí)驗(yàn)分別同11個(gè)不同的生產(chǎn)廠家采購(gòu)樣品，以考察市場(chǎng)上大豆異黃酮提取物有機(jī)溶劑殘留的情況，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出大豆異黃酮甲醇和乙醇限量存在一定超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)，因此，制定大豆異黃酮提取物有機(jī)溶劑殘留的限量十分必要。

【參考文獻(xiàn)】

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[6] 彭游，余盛祿.大豆異黃酮提取研究最新進(jìn)展[J].大豆科學(xué)，2012（2）：320-323.

【作者簡(jiǎn)介】

白旭東（1973-），男，副主任中藥師，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称?，藥品和醫(yī)療器械的檢驗(yàn)與審評(píng)。

周兆梅（1965-），女，教授級(jí)高級(jí)工程師，學(xué)士，研究方向?yàn)楸＝∈称窓z驗(yàn)。

黃媛（1983-），女，碩士，研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)與食品安全。

通訊作者：谷巖（1975-），女，碩士，研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)與食品安全，E-mail：591131710@qq.com。