周雙，孫蘭英，楊光，段亞東，張鹍，宋鵬慧，李鵬舉

（黑龍江省農業(yè)科學院鄉(xiāng)村振興科技研究所，黑龍江哈爾濱150000）

樹莓（Rubus spp.）為薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus.L.）多年生灌木果樹。樹莓果實內富含豐富的生理活性物質，而被譽為“黃金水果”、“植物界的阿司匹林”。隨著不斷的研究和開發(fā)利用樹莓成為集營養(yǎng)、加工和保健為一體的多功能水果。樹莓含有多種營養(yǎng)活性成分，如：黃酮類、茶多酚、烯烴、花青素、鞣花酸、水楊酸、超氧化物歧化酶等[1-3]。黃酮類化合物廣泛分布于樹莓的植物體中，由于其含有較多的酚羥基團，使得樹莓具有清除自由基、預防心血管疾病、提高免疫力抗菌抗病毒活性等功能[4-6]。有研究表明，黃酮類化合物主要以黃酮苷和糖苷型黃酮存在，進入人體的黃酮類化合物，以黃酮糖苷形式存在時，大部分在小腸壁的阻擋下不能進入血液，需要在腸內益生菌分泌的水解酶作用下水解成苷元，再重新被吸收進入血液，只有以苷元形式存在的黃酮可以直接進入血液中，發(fā)揮各種生理作用，黃酮苷元在體內的生物利用率明顯高于糖苷型黃酮，并且黃酮苷抗氧化活性明顯優(yōu)于糖苷型黃酮[7-8]。利用高效液相色譜法-電噴霧離子源-離子阱多級質譜聯(lián)用儀分離鑒定出，樹莓葉片中含有14 個黃酮類化合物，樹莓黃酮苷主要是槲皮素（quercetin）和山奈酚（kaempferol）。有研究確定槲皮素和山奈酚在抗癌、抗氧化有突出功效，并能抗心肌肥厚、促進骨髓中成骨細胞的形成等藥理作用[6，9-12]。

目前關于秋果型樹莓槲皮素和山奈酚含量測定卻鮮有報道。本研究通過高效液相色譜法測定樹莓不同品種、不同部位的槲皮素和山奈酚的含量，以確定樹莓槲皮素和山奈酚的提取部位和品種資源，為進一步開發(fā)利用樹莓提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為3 份秋果型樹莓，均由黑龍江省農業(yè)科學院漿果研究所漿果育種室樹莓課題組保存，分別采集樹莓果實、葉片、種子。取材時間2018 年8 月31日，第一結果盛期。

槲皮素、山奈酚均為色譜純：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；甲醇、石油醚均為色譜純：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1100 高效液相色譜儀：安杰倫科技（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 混合標準品溶液制備

分別精密稱取槲皮素、山奈酚標準品適量，配制成混合標準品溶液，其中槲皮素和山奈酚質量濃度為0.11 mg/mL，放入冰箱中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 供試品溶液制備

稱取約0.5 g 樣本，放入研缽中磨碎，加入1 mL 預冷的80%的甲醇，4 ℃浸提過夜，8 000 g 離心10 min，殘渣用0.5 mL 預冷的80%的甲醇浸提2 h，離心后取出上清，合并兩次上清，40 ℃氮吹至不含有機相，加入0.5 mL 石油醚 60 ℃～90 ℃ 萃取脫色 3 次，棄去上層醚相，下層40 ℃氮吹至干，加入1.5 mL 流動相渦旋振蕩溶解，針頭式過濾器過濾后待測。

1.3.3 色譜條件

流動相的配制：量取600 mL 超純水，加入6 mL 乙酸混勻溶解，加入400 mL 甲醇，混勻。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）液相條件：安捷倫 18 反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），進樣量 10 μL，流速 1.000 mL/min，柱溫 30 ℃，走樣時間為45 min，紫外波長254 nm，設置完畢保存方法組。用流動相過柱子，待基線穩(wěn)定后，開始加樣。

1.3.4 標準曲線的繪制

精密吸取混合標準品溶液，分別置于10 mL 容量瓶中，用色譜純甲醇定容至刻度線，配成系列標準品溶液，其中槲皮素質量濃度依次為0.11、1.1、5.5、11、27.5 μg/mL，山奈酚質量濃度依次為 0.11、1.1、5.5、11、27.5 μg/mL。按 1.2.3 色譜條件依次進樣 10 μL，分別以槲皮素、山奈酚峰面積為橫坐標，以質量濃度（μg/mL）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.5 重復性試驗

稱取同一樹莓樣品5 份，按1.2.2 節(jié)制備供試品溶液，按照1.2.3 節(jié)分別進樣10 μL，進行槲皮素、山奈酚峰面積測定，并計算各自的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.6 儀器精密度試驗

吸取混合標準品溶液，按1.2.3 節(jié)色譜條件，連續(xù)進樣5 次，每次進樣10 μL，在相同條件下，測得槲皮素峰、山奈酚峰面積，并計算各自的RSD。吸取同一供試品溶液，按1.3.3 節(jié)色譜條件，連續(xù)進樣5 次，測得槲皮素、山奈酚峰面積，并計算各自的RSD。

1.3.7 加樣回收率試驗

精密稱取0.5 g 同一樣品槲皮素、山奈酚含量已知的樹莓提取物5 份，然后加入槲皮素和山奈酚混合標準品溶液各7.7 μg，按1.2.2 的方法制備供試品溶液，按1.2.3 節(jié)色譜條件，分別進樣10 μL，記錄槲皮素、山奈酚峰面積，計算回收率。

1.3.8 樣品含量測定

按照1.2.2 節(jié)制備供試品溶液，在1.2.4 節(jié)色譜條件下，測定3 份樣品中槲皮素、山奈酚含量，計算槲皮素、山奈酚的平均含量。

2 結果與分析

2.1 保留時間的確定

將11.00 μg/mL 山奈酚、槲皮素混合對照品溶液按1.2.3 項色譜條件進樣分析，得到對照品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 樹莓樣品高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of diagram of raspberry sample

由圖1 可知，樹莓供試品出現與混合對照品中山奈酚（28.979 min）、槲皮素（27.485 min）保留時間一致的兩個峰。

2.2 標準曲線的制作

以峰面積為橫坐標，分別以槲皮素和山奈酚的質量濃度為縱坐標繪制槲皮素和山奈酚含量的標準曲線如圖1，槲皮素線性回歸方程為：y=0.109x-0.050 5，R2=0.999 8，由于27.5 μg/mL 超出樣品含量最高上限，不參與繪制標準曲線，表明在0.11 μg/mL～11 μg/mL內槲皮素峰面積值與濃度呈良好的線性關系；山奈酚線性回歸方程為：y=0.064 6x+0.052 6，R2=0.999 7，表明在 0.11 μg/mL～27.5 μg/mL 內山奈酚峰面積值與濃度呈良好的線性關系。

2.3 重復性試驗

在1.2.5 節(jié)條件下，槲皮素峰面積分別為1.313、1.307、1.301、1.324、1.299，平均峰面積為 1.308，RSD 為0.772 %；山奈酚峰面積分別為 6.850、6.872、6.793、6.889、6.923，平均峰面積為 6.865，RSD 為 0.706%。

2.4 儀器精密度試驗

在1.2.6 節(jié)條件下，測得混合標準品中槲皮素峰面積分別為 10.698、10.702、10.782、10.673、10.683，平均峰面積為10.708，RSD 為0.403%；測得混合標準品中山奈酚峰面積分別為 12.848、12.917、12.836、12.793、12.876，RSD 為 0.34%。

2.5 加樣回收率試驗

在1.2.8 節(jié)條件下，測得槲皮素的平均回收率為100.65 %（RSD 為0.76 %），山奈酚的平均回收率為99.45%（RSD 為0.91%），結果見表1。

2.6 樣品含量測定

樣品含量測定見表2。

由表2 可知不同品種、不同部位的槲皮素和山奈酚含量存在差異，槲皮素含量在 0.066 μg/g～46.47 μg/g，山奈酚含量在 0.58 μg/g～3.09 μg/g。哈瑞太茲葉片中槲皮素含量最高，波爾卡種子中槲皮素含量最低，前者是后者的663.9 倍。哈瑞太茲種子中山奈酚含量最高，哈瑞太茲果實和秋福的葉片中的山奈酚含量低于檢測限，可能含量極少低于機器的檢測范圍。槲皮素和山奈酚在同一樹莓品種不同部位含量均表現明顯差異。槲皮素在3 個樹莓品種果實中平均含量為0.79 μg/g，葉片中平均含量為 22.17 μg/g，種子中平均含量為5.47 μg/g，葉片是果實的28.1 倍；山奈酚在3 個樹莓品種果實中平均含量為0.49 μg/g，葉片中平均含量為 1.05 μg/g，種子中平均含量為 1.54 μg/g，種子是果實的3.1 倍。波爾卡、哈瑞太茲、秋福的槲皮素平均含量分別為5.13、20.66、2.64 μg/g，哈瑞太茲平均含量明顯高于其他品種；波爾卡、哈瑞太茲、秋福山奈酚平均含量分別為 0.89、2.34、1.94 μg/g，哈瑞太茲山奈酚平均含量最高。

表1 回收率測定Table 1 Results of recovery

表2 樣品含量測定Table 2 The results of sample

3 結論

用于測定樹莓黃酮類物質測定的方法有紫外分光光度法、雙波長分光光度法、熒光分光光度法，高效液相色譜法等，較其他方法高效液相色譜法具有靈敏度高、高效等特點[13-19]。影響黃酮化合物含量測定的因素很多，有研究表明，不同結果時期黃酮類化合物的含量受到影響，最佳采收時間為第一結果初期[20]，因此本試驗選擇秋果型樹莓第一結果期的果實、葉片、種子進行測定。

本研究利用高效液相色譜法首次測定了樹莓不同品種、不同部位中槲皮素和山奈酚含量。不同品種的槲皮素含量分別為哈瑞太茲＞波爾卡＞秋福，不同部位的槲皮素含量為葉片＞種子＞果實，其中哈瑞太茲葉片的槲皮素含量46.47 μg/g，可作為提取槲皮素的植物來源。不同品種的山奈酚含量分別為哈瑞太茲＞秋福＞波爾卡，不同部位的山奈酚含量為種子＞葉片＞果實，其中哈瑞太茲種子的山奈酚含量為3.09 μg/g。結果顯示同種樹莓的不同部位槲皮素和山奈酚的含量存在差異，相同部位不同品種對槲皮素和山奈酚含量也存在差異，本試驗結果將為樹莓槲皮素和山奈酚的提取部位和品種資源提供參考依據。