洪艷，房磊，鄭義，*，陳安徽，張微，王琨

（1.徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇徐州221018；2.江蘇康能生物工程股份有限公司，江蘇南京210005）

PM2.5是特指空氣動(dòng)力學(xué)直徑小于2.5 μm 的顆粒物，其組成成分復(fù)雜，主要包括元素碳、有機(jī)碳、重金屬、多環(huán)芳烴和生物成分等[1]。PM2.5主要經(jīng)呼吸道進(jìn)入人體，易沉積在肺泡中從而造成肺部損傷，PM2.5暴露與肺炎、慢性阻塞性肺疾病等多種肺病的發(fā)生密切相關(guān)[2-3]。PM2.5對(duì)肺損傷的作用機(jī)制仍未完全闡明，但其引起的氧化應(yīng)激和炎癥損傷等是目前較為公認(rèn)的主要效應(yīng)機(jī)制[4]。研究表明，適當(dāng)補(bǔ)充具有抗氧化功效的膳食補(bǔ)充劑，可減輕PM2.5暴露對(duì)機(jī)體的損傷[5]。

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）是蟲(chóng)草屬真菌的模式種，分布廣泛于世界各地，其無(wú)性型為蛹草擬青霉，屬子囊菌綱（Ascomycetes）、肉座菌目（Hypocreales）、麥角菌科（Clavicipitaceae）、蟲(chóng)草屬（Cordyceps）[6]。蛹蟲(chóng)草與冬蟲(chóng)夏草Ophiocordyceps sinensis 為同一屬，許多藥用價(jià)值相通，并有希望替代昂貴的冬蟲(chóng)夏草[7]。據(jù)吳征鎰所著的《新華本草綱要》中記載，蛹蟲(chóng)草味甘性平，具有補(bǔ)肺益腎，補(bǔ)精髓，止血化痰的功效[8]。蛹蟲(chóng)草富含蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸、多糖、核苷、麥角甾醇、酶類(lèi)等多種生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、保護(hù)肝臟及肺臟等多種藥理作用[9]。有報(bào)道表明，人工培植的冬蟲(chóng)夏草和野生冬蟲(chóng)夏草均具有促進(jìn)PM2.5超細(xì)顆粒物從斑馬魚(yú)體內(nèi)排出進(jìn)入腸道排出的作用[10]。蛹蟲(chóng)草具有較好抗氧化活性，推測(cè)其可能對(duì)PM2.5所致肺損傷具有預(yù)防和保護(hù)作用，但有關(guān)蛹蟲(chóng)草拮抗PM2.5致肺損傷的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)觀(guān)察PM2.5染毒對(duì)小鼠的肺損傷作用及蛹蟲(chóng)草提取物的干預(yù)作用，探討蛹蟲(chóng)草提取物在PM2.5致小鼠肺損傷中的保護(hù)作用，旨在為防治環(huán)境污染所致的呼吸道疾病開(kāi)拓新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲(chóng)草提取物：江蘇康能生物工程股份有限公司，其中多糖、蟲(chóng)草素、腺苷含量分別為24.6 g/100 g、879 mg/100 g 和129 mg/100 g。昆明小鼠：許可證號(hào)SCXK 魯 20140007，（20±2）g，濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司；酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、免疫球蛋白 IgA、IgG、IgM、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、超氧化物歧化酶（superoxidase dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-18A 冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠(chǎng)有限公司；FA2104N 電子分析天平、723C 可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2F 超凈工作臺(tái)：上海博遜實(shí)業(yè)有限公司；5804 多功能臺(tái)式離心機(jī)：德國(guó)艾本德公司；TGL-16 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；iMark 酶標(biāo)儀：伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PM2.5 樣品采集和懸液制備

于徐州市非工業(yè)區(qū)使用大流量采樣器采用玻璃纖維濾膜采集大氣PM2.5（由徐州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心完成）。將采集到的PM2.5濾膜剪成1 cm×3 cm的細(xì)條狀，置于去離子水中，使用超聲波清洗器洗脫，3 000 r/min 離心20 min，取上清，冷凍干燥收集PM2.5粉末，用無(wú)菌生理鹽水配制成PM2.5混懸液，混勻，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

小鼠飼養(yǎng)溫度19℃～22℃，濕度45%～55%。經(jīng)過(guò)一周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，50 只小鼠隨機(jī)分為5 組，每組10 只小鼠，分別為正常組，PM2.5組，蛹蟲(chóng)草提取物低、中、高劑量組。低、中、高試驗(yàn)組分別灌胃50、100、200 mg/kg蛹蟲(chóng)草提取物，正常組和PM2.5組灌胃生理鹽水，每天1 次。每組分別灌胃14 d 后，乙醚麻醉小鼠，微量注射器吸取0.1 mL PM2.5混懸液，PM2.5組和蛹蟲(chóng)草提取物采用鼻腔滴注方式染毒PM2.（512 mg/kg），每組各染毒3 次，每次間隔24 h。正常組氣管滴注生理鹽水。

在末次染毒24 h 后，眼眶取血，頸椎脫臼處死小鼠并進(jìn)行解剖。每組小鼠5 只用于炎性細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)，5 只用于組織樣品采集。

1.3.3 肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)及炎性損傷檢測(cè)

小鼠處死后，用解剖剪刀從小鼠胸腔下剪開(kāi)將小鼠胸腔暴露，用止血鉗夾住小鼠左肺葉，將支氣管從血管和食道間剝離，剪開(kāi)一個(gè)小口，用灌肺針吸取預(yù)冷的生理鹽水溶液1 mL，將灌肺針插入小口后用手術(shù)線(xiàn)結(jié)扎防止生理鹽水從口鼻處流出，緩慢注入生理鹽水，輕輕按摩肺部后吸出，重復(fù)5 次后收集小鼠BALF。用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞數(shù)，取20 μL BALF 涂板，25 ℃下干燥后，瑞氏-姬姆薩法染色計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，計(jì)算其中嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量。按照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)BALF 中ACP、AKP 和LDH 活性。

1.3.4 血清細(xì)胞因子與免疫球蛋白檢測(cè)

眼眶取血，25 ℃放置 30 min 后，3 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液，按照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)免疫球蛋白IgA、IgG、IgM、TNF-α 和 IL-6 含量。

1.3.5 肺組織氧化指標(biāo)檢測(cè)

取小鼠右肺葉0.3 g，剪碎后加入9 倍體積預(yù)冷的生理鹽水，置于冰上充分研磨，3 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液，按照說(shuō)明書(shū)測(cè)定小鼠肺組織TAOC、SOD、CAT、GSH-Px 活性及 MDA 含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PM2.5 對(duì)小鼠肺組織的炎性損傷作用及蛹蟲(chóng)草提取物的干預(yù)作用

2.1.1 PM2.5對(duì)炎性細(xì)胞的影響及蛹蟲(chóng)草提取物的干預(yù)作用

炎癥反應(yīng)一般表現(xiàn)為組織周?chē)g質(zhì)中有許多炎性細(xì)胞的聚集，也被稱(chēng)為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。通過(guò)對(duì)小鼠BALF 中總炎性細(xì)胞及各種炎性細(xì)胞的計(jì)數(shù)可以觀(guān)測(cè)到PM2.5對(duì)小鼠肺組織造成的炎癥反應(yīng)以及不同濃度的蛹蟲(chóng)草對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制作用[11]。各組小鼠BALF中總細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠BALF 中總細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目Table 1 Counts of total cell，lymphocyte，neutrophil,and eosinophil in bronchoalveolar lavage fluid of mice

與正常組小鼠相比，PM2.5染毒組BALF 中總細(xì)胞密度、淋巴細(xì)胞密度、中性粒細(xì)胞密度、嗜酸性粒細(xì)胞密度均顯著升高（P＜0.05），表明PM2.5可增加小鼠炎性細(xì)胞數(shù)量。與PM2.5染毒組相比，蛹蟲(chóng)草提取物干預(yù)組BALF 中總細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞密度明顯降低（P＜0.05）且隨蛹蟲(chóng)草提取物濃度增加炎性細(xì)胞密度降低更明顯，結(jié)果提示蛹蟲(chóng)草提取物可以減輕PM2.5致肺損傷小鼠炎性損傷，減少炎性細(xì)胞募集。

2.1.2 PM2.5對(duì)小鼠 BALF 中 LDH、AKP 和 ACP 活性的影響及蛹蟲(chóng)草提取物的干預(yù)作用

LDH 是一種糖酵解酶，催化乳酸脫氫生成丙酮酸它在機(jī)體內(nèi)組織細(xì)胞內(nèi)含量十分豐富。ACP 主要在巨噬細(xì)胞在出現(xiàn)，是一種溶酶體酶。當(dāng)細(xì)胞膜受損后，細(xì)胞膜通透性降低，LDH 和ACP 會(huì)大量釋放到胞外，致使其活力增加，所以L(fǎng)DH 和ACP 含量可以作為細(xì)胞膜受損程度的指標(biāo)[12]。AKP 的活性增加主要是反映了肺泡Ⅱ型細(xì)胞的損傷程度[13]。表2 為各組小鼠BALF中LDH、AKP 和 ACP 活性。

由表2 可知，與正常組相比，PM2.5染毒可引起小鼠 LDH、AKP 和 ACP 活力顯著升高（P＜0.05），結(jié)果提示PM2.5可導(dǎo)致肺泡細(xì)胞膜損壞，膜通透性改變，使肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷；相比于PM2.5染毒組，其各自的蛹蟲(chóng)草提取物干預(yù)組中LDH、AKP 和 ACP 活力顯著降低（P＜0.05）。由此說(shuō)明，蛹蟲(chóng)草提取物對(duì)PM2.5致小鼠肺損傷有減輕作用，能夠緩解PM2.5對(duì)肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞的損傷，維持細(xì)胞膜的通透性。

表2 各組小鼠BALF 中LDH、AKP 和ACP 活性Table 2 Activities of LDH，AKP，and ACP in bronchoalveolar lavage fluid of mice

2.2 PM2.5 對(duì)血清免疫球蛋白和細(xì)胞因子的影響及蛹蟲(chóng)草提取物的干預(yù)作用

2.2.1 PM2.5對(duì)TNF-α 的影響及蛹蟲(chóng)草提取物的干預(yù)作用

TNF-α 可以激活單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥因子大量釋放，造成炎性組織損傷，是炎癥反應(yīng)中最早出現(xiàn)的炎性因子，是反映細(xì)胞炎性作用程度的指標(biāo)[14]。PM2.5對(duì)小鼠血清TNF-α 水平的影響及蛹蟲(chóng)草提取物的干預(yù)作用見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠血清TNF-α 含量Fig.1 Levels of serum TNF-α in different groups mice

由圖1 可知，與正常組相比，PM2.5染毒組TNF-α含量顯著升高（P＜0.05）；與 PM2.5染毒組相比，蛹蟲(chóng)草提取物干預(yù)組肺組織中TNF-α 含量均顯著降低（P＜0.05）。表明蛹蟲(chóng)草提取物能夠減輕PM2.5誘導(dǎo)促炎性因子TNF-α 的釋放。

2.2.2 PM2.5 對(duì)IL-6 的影響及蛹蟲(chóng)草提取物的干預(yù)作用

IL-6 主要由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，具有炎癥放大作用，同時(shí)IL-6 可激活中性粒細(xì)胞[15]，小鼠血清中IL-6 水平可反映PM2.5對(duì)小鼠肺組織細(xì)胞的炎性損傷程度以及各劑量蛹蟲(chóng)草的保護(hù)作用。PM2.5對(duì)小鼠血清IL-6 水平的影響及蛹蟲(chóng)草提取物的干預(yù)作用見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠血清IL-6 含量Fig.2 Levels of serum IL-6 in different groups mice

由圖2 可知，與正常組比較，PM2.5染毒組IL-6 含量急劇升高（P＜0.05），表明 IL-6 是 PM2.5引發(fā)小鼠肺部炎性的敏感指標(biāo)。與PM2.5染毒組相比，蛹蟲(chóng)草提取物干預(yù)組血清中IL-6 含量顯著降低（P＜0.05），表明蛹蟲(chóng)草提取物在一定程度上能夠減弱PM2.5誘導(dǎo)的促炎因子IL-6 水平增加，對(duì)PM2.5致肺組織炎癥損傷有一定減輕作用。

2.2.3 PM2.5對(duì)免疫球蛋白的影響及蛹蟲(chóng)草提取物的干預(yù)作用

免疫球蛋白是具有抗體活性或與抗體分子相似的球蛋白。在血清中，免疫球蛋白中有3 類(lèi)較多，它們分別是IgA、IgG、IgM。IgA 在血清中多為單體，它可以促進(jìn)吞噬抗體依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)的毒性作用。IgG 是血清中含量最多的免疫球蛋白，大多數(shù)的抗病毒抗體都是IgG，它可以促進(jìn)單核細(xì)胞的調(diào)理作用還能中和細(xì)胞毒素及病毒[16]。IgM 是分子量最大的免疫球蛋白，它具有很強(qiáng)的抗原結(jié)合能力，在免疫反應(yīng)過(guò)程中是最先出現(xiàn)的。血清中免疫球蛋白越低，表明小鼠的免疫能力降低。通過(guò)測(cè)量不同組鼠血清中免疫球蛋白的含量可以觀(guān)測(cè)PM2.5對(duì)小鼠免疫能力的影響以及蛹蟲(chóng)草對(duì)其的干預(yù)作用。各組小組血清IgA、IgG 和IgM 水平見(jiàn)表3。

表3 各組小組血清IgA、IgG 和IgM 水平Table 3 Levels of serum IgA，IgG，and IgM in different groups mice

表3 結(jié)果表明，與正常組相比，PM2.5染毒組血清中 IgA、IgG 和 IgM 顯著降低（P ＜ 0.05）。與染毒組相比，蛹蟲(chóng)草提取物干預(yù)組血清中IgA、IgG 和IgM 水平顯著提高（P ＜0.05）。表明蛹蟲(chóng)草提取物在一定程度上能夠減弱PM2.5導(dǎo)致的免疫球蛋白水平下降。

2.3 PM2.5 對(duì)小鼠肺組織的氧化損傷作用及蛹蟲(chóng)草提取物的干預(yù)作用

2.3.1 PM2.5對(duì)小鼠肺組織MDA 含量影響及蛹蟲(chóng)草提取物的干預(yù)作用

MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，MDA 含量可反映脂質(zhì)過(guò)氧化的程度[17]，通過(guò)測(cè)定MDA 可以了解到PM2.5暴露是否造成機(jī)體脂質(zhì)氧化損傷。PM2.5對(duì)小鼠肺組織MDA含量影響及蛹蟲(chóng)草提取物的干預(yù)作用如圖3 所示。

由圖可知，PM2.5染毒組的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量顯著高于正常組（P＜0.05），表明PM2.5暴露可導(dǎo)致脂質(zhì)氧化損傷；蛹蟲(chóng)草提取物各劑量組的MDA 含量均顯著低于PM2.5染毒組（P＜0.05）。由此可以得出蛹蟲(chóng)草提取物干預(yù)組劑量越高，MDA 下降的程度越高。表明蛹蟲(chóng)草提取物在一定程度上能夠減弱PM2.5導(dǎo)致的脂質(zhì)氧化損傷。

2.3.2 PM2.5對(duì)小鼠肺組織 T-AOC、SOD、CAT、GSHPX 活性影響及蛹蟲(chóng)草提取物的干預(yù)作用

圖3 各組小鼠肺組織MDA 含量Fig.3 Levels of MDA in in different groups mice

PM2.5可刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的活性氧和活性氮自由基，過(guò)量自由基使機(jī)體抗氧化酶耗竭或活性下降[18]，抗氧化酶活性的高低可反映機(jī)體受PM2.5氧化損傷的程度。T-AOC 可反映組織中的總抗氧化能力；SOD 能夠消除生物體內(nèi)的有害物質(zhì)達(dá)到清除作用；CAT 主要存在于動(dòng)植物體內(nèi)，它可以催化體內(nèi)過(guò)氧化氫分解從而防止細(xì)胞氧化；GSH-PX 可以清除脂質(zhì)過(guò)化物，是一種重要的過(guò)氧化物分解酶，可以保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和完整[19]。PM2.5對(duì)小鼠肺組織的 T-AOC、SOD、CAT、GSHPX 活性影響及蛹蟲(chóng)草提取物的干預(yù)作用如表4 所示。

表4 蛹蟲(chóng)草提取物對(duì)PM2.5 致小鼠肺組織T-AOC、SOD、CAT 和GSH-Px 活性Table 4 Activities of T-AOC，SOD，CAT，and GSH-Px in lung of mice

由表4 可知，PM2.5染毒組小鼠肺組織T-AOC、SOD、CAT、GSH-PX 活性均顯著低于正常組（P＜0.05），表明PM2.5對(duì)小鼠肺組織抗氧化防御系統(tǒng)造成了損傷。蛹蟲(chóng)草提取物各劑量組小鼠肺組織中T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px 活性顯著高于模型組（P＜0.05），結(jié)果提示蛹蟲(chóng)草提取物在一定程度上能夠緩解PM2.5對(duì)小鼠肺組織氧化損傷作用。

3 結(jié)論

蛹蟲(chóng)草提取物能夠減弱PM2.5染毒致小鼠體質(zhì)量的下降。PM2.5染毒能夠造成小鼠肺泡灌洗液中淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞密度增加，蛹蟲(chóng)草提取物可以抑制這種現(xiàn)象。PM2.5染毒后，肺泡灌洗液中ACP、AKP、LDH 活性升高，不同劑量蛹蟲(chóng)草提取物均可以抑制其增加，并隨濃度增加而效果愈加。不同劑量蛹蟲(chóng)草提取物可顯著減弱PM2.5染毒引起的血清中IL-6 和TNF-α 促炎因子水平的上升，減弱IgA、IgM 和IgG 等免疫球蛋白水平的下降。PM2.5染毒后，小鼠肺組織勻漿上清液 T-AOC、SOD、CAT、GSH-PX 活性降低，MDA 含量升高，蛹蟲(chóng)草提取物干預(yù)可以抑制上述改變。綜上所述，PM2.5可對(duì)小鼠肺組織造成顯著的炎性損傷和氧化損傷，蛹蟲(chóng)草提取物能夠減輕上述損傷作用，其保護(hù)機(jī)理與其抗氧化和抗炎活性相關(guān)。