王 壇 趙金鑫 劉東來(lái) 孔 純 華雪銘,2,3 吳 釗 王 剛 馮 悅,2,3 楊景豐,2,3 劉 韜,2,3

飼用溶菌酶對(duì)吉富羅非魚消化道組織結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的影響*

王 壇1,4趙金鑫4劉東來(lái)5孔 純1華雪銘1,2,3①吳 釗1王 剛1馮 悅1,2,3楊景豐1,2,3劉 韜1,2,3

(1. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心 上海 201306；2. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201306；3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海 201306；4. 廣東海大集團(tuán)股份有限公司 廣州 511400；5. 安徽省巢湖市中旱鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心水產(chǎn)站 巢湖 238054)

為了解飼用溶菌酶對(duì)吉富羅非魚()消化道組織結(jié)構(gòu)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用的影響，本研究設(shè)計(jì)5種飼料溶菌酶添加水平：18 mg/kg (L18)、36 mg/kg (L36)、54 mg/kg (L54)、72 mg/kg (L72)和90 mg/kg (L90)，以不添加溶菌酶的飼料(L0)為對(duì)照，進(jìn)行為期60 d的飼養(yǎng)。結(jié)果顯示，飼料中添加溶菌酶對(duì)吉富羅非魚肝臟和胃腸道消化酶活性產(chǎn)生了不同程度的影響。L36、L54和L72組的胃、前腸和中腸蛋白酶活性顯著高于對(duì)照組(<0.05)，肝臟、前腸脂肪酶活性在L54和L72組均顯著高于對(duì)照組(<0.05)，淀粉酶活性在除前腸、中腸外的L72和L90組顯著高于對(duì)照組(<0.05)。L36、L54和L72組魚的腸道不同部位腸絨毛密度、高度和寬度較對(duì)照組顯著提高，在肌層厚度上，溶菌酶添加組在前腸和后腸部位有下降趨勢(shì)，L18、L36和L90組顯著低于對(duì)照組(<0.05)，而在中腸部位，肌層厚度隨添加水平升高而呈先升后降的變化趨勢(shì)，L36、L54和L72組在數(shù)值上高于對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異(>0.05)；杯狀細(xì)胞數(shù)量在L54和L72組均顯著高于對(duì)照組(<0.05)。肝臟切片圖顯示，L36和L54組肝細(xì)胞排列整齊、形狀飽滿，相較于對(duì)照組更致密，但高劑量添加組的肝臟健康程度有下降趨勢(shì)。消化吸收率方面，在飼養(yǎng)Ⅰ期和Ⅱ期，L36和L54組對(duì)粗蛋白的表觀消化率顯著高于對(duì)照組，到飼養(yǎng)Ⅲ期和Ⅳ期，L36~L90組對(duì)干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的消化吸收率均有顯著提高(<0.05)。研究表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，36、54 mg/kg溶菌酶添加水平具有最穩(wěn)定的作用效果，吉富羅非魚通過肝腸發(fā)育和消化酶活性的提高來(lái)促進(jìn)對(duì)飼料干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的消化吸收。

吉富羅非魚；溶菌酶；消化吸收率；消化酶；肝腸組織形態(tài)

近年來(lái)，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，由細(xì)菌、病毒引起的水產(chǎn)動(dòng)物病害也日益凸顯，持續(xù)制約著養(yǎng)殖動(dòng)物的生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)效益的提高?？股仉m是解決這一問題的有效方法，但藥物殘留、機(jī)體耐藥性、環(huán)境污染等弊端以及對(duì)人類健康構(gòu)成的潛在威脅，顯然已不能在養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)際中首選使用。溶菌酶是一類具有天然抗菌活性的蛋白多肽類物質(zhì)，對(duì)包括細(xì)菌、真菌等在內(nèi)的病原微生物具有廣譜抑菌作用，已作為一種新型綠色的飼用酶制劑而應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)中。在畜禽動(dòng)物上的研究發(fā)現(xiàn)(王軍等, 2013; 張世卿等, 2008; 顧維智等, 2008; 王曉可等, 2008)，日糧中添加溶菌酶對(duì)家畜家禽有不同程度的促生長(zhǎng)以及提高飼料利用率和自身抗病力的作用，可以完全或部分替代抗生素，但由于水產(chǎn)動(dòng)物特殊的生活環(huán)境和生理生化特點(diǎn)，加之溶菌酶活性易受水產(chǎn)飼料加工等因素的影響，飼用溶菌酶在水產(chǎn)動(dòng)物中的應(yīng)用研究還較少，且作用效果仍存在一定程度的差異(邢思華等, 2013; Chen, 2014)。研究表明，溶菌酶不僅是一種有活性的免疫調(diào)節(jié)因子，同時(shí)又是一種主要的消化酶，與動(dòng)物的消化系統(tǒng)密切相關(guān)(Nilsen, 1999)。此外，飼料中外源性酶制劑的添加能改變魚類內(nèi)源消化酶的活性，進(jìn)而對(duì)其消化能力產(chǎn)生影響(張璐等, 2007; 黎軍勝等, 2006; 葉元土等, 1993)。雖然魚的不同種類、不同食性和消化道結(jié)構(gòu)及不同生長(zhǎng)期和養(yǎng)殖環(huán)境均與機(jī)體的消化功能存在一定關(guān)系，但對(duì)于溶菌酶是否與其他酶制劑一樣影響?zhàn)B殖魚類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化利用和消化機(jī)能，尚未見報(bào)道。

吉富羅非魚()是經(jīng)遺傳性狀改良后的尼羅羅非魚。該品系羅非魚因其生長(zhǎng)速度快、出肉率高、肌肉必需氨基酸種類齊全且含量豐富，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值均較高的魚類，在我國(guó)南方有廣泛的養(yǎng)殖。然而，在實(shí)際生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)，該魚攝食量大而雜，尤其在集約化養(yǎng)殖模式中，更易聚積過多殘餌和糞便，對(duì)魚的消化機(jī)能和組織健康造成威脅。為此，本研究在吉富羅非魚基礎(chǔ)飼料中添加不同水平的溶菌酶制品，通過比較各組魚對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化能力、消化酶活性及消化道器官發(fā)育和健康程度三方面來(lái)綜合評(píng)估飼用溶菌酶對(duì)吉富羅非魚營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和消化道組織健康的影響，以期為溶菌酶在以羅非魚為代表的雜食性有胃魚類健康養(yǎng)殖中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼料

根據(jù)吉富羅非魚的營(yíng)養(yǎng)需求(NRC, 2011)，以魚粉、豆粕、花生粕和菜籽粕為主要蛋白源，以魚油和豆油為主要脂肪源，配制成粗蛋白、粗脂肪和總能水平分別為35.41%、5.77%和22.87 kJ/g的基礎(chǔ)飼料，在此基礎(chǔ)上，分別添加18、36、54、72和90 mg/kg，即9×104、1.8×105、2.7×105、3.6×105和4.5×105U/kg的溶菌酶制品(上海沈李科工貿(mào)公司；初始酶活性5×103U/mg)，分別記為L(zhǎng)0(對(duì)照組)、L18、L36、L54、L72和L90。飼料原料粉碎過40目篩，微量成分采用逐級(jí)擴(kuò)大的方法添加，與大宗原料混合均勻后用制粒機(jī)(SLP-45, 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機(jī)械儀器研究所)制成粒徑為2.0 mm的硬顆粒飼料，制粒溫度控制在(75±5)℃。自然風(fēng)干后于-20℃冰箱冷藏備用。實(shí)驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 吉富羅非魚基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(%, 風(fēng)干基礎(chǔ))

Tab.1 Composition and nutrient levels of the basal diet for GIFT tilapia (%, air-dry basis)

注: 1) 維生素預(yù)混料為每千克飼料提供 Vitamin premix provided the following per kg of the diet: 硫胺素thiamine 20.00 mg, 核黃素 riboflavin 20.00 mg, 吡哆醛 pyridoxine 10.00 mg, 尼克酸 nicotinic acid 10.00 mg, 泛酸鈣 calcium pantothenate 50.00 mg, 生物素 biotin 1.0 mg, 葉酸 folic acid 5.0 mg, 肌醇 inositol 500 mg, VC100 mg, VE50 mg, VA2 mg, VB120.02 mg, VK310 mg, VD30.05 mg

2)礦物質(zhì)預(yù)混料為每千克飼料提供Mineral premix provided the following per kg of the diet: ZnSO4·7H2O 525.5 mg, MnSO4·H2O 49.2 mg, KI 5.23 mg, FeSO4·7H2O 238.8 mg, MgSO4·7H2O 4.62 g, CuSO4·5H2O 11.8 mg, CoCl2·6H2O 0.2 mg, Na2SeO40.66 mg, KCl 600 mg, NaCl 107.1 mg

1.2 實(shí)驗(yàn)用魚與飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在上海海洋大學(xué)濱海養(yǎng)殖基地進(jìn)行。選用規(guī)格一致、平均體重為(11.35±0.08)g的吉富羅非魚960尾，隨機(jī)分配于24個(gè)等大尼龍網(wǎng)箱中(分為6組, 每組4個(gè)重復(fù))，每網(wǎng)箱40尾。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料，5個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別對(duì)應(yīng)飼喂L18~L90組的實(shí)驗(yàn)飼料。實(shí)驗(yàn)用魚飼養(yǎng)于室外水泥池中的24口等大尼龍網(wǎng)箱(1.2 m×1.8 m×1.2 m)中，水源為天然河水。用基礎(chǔ)飼料馴化7 d，待其攝食正常后開始正式實(shí)驗(yàn)。日投喂采取定量投喂方式，每天定點(diǎn)投喂3次(08:00、12:00和17:00)，日投餌率為魚體重的3%~8%，根據(jù)生長(zhǎng)階段、天氣、攝食狀況調(diào)整投喂量。實(shí)驗(yàn)期間24 h充氣，定期換水，水溫為26~34℃，溶氧>5 mg/L，氨氮含量<0.3 mg/L，養(yǎng)殖周期為60 d。

1.3 消化實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)期間，按照基礎(chǔ)飼料配方以0.5%的Cr2O3作為指示劑進(jìn)行不同時(shí)期的消化率實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前預(yù)飼7 d。每天08:00投料30 min后收集糞便，取具包膜、結(jié)構(gòu)完整者風(fēng)干后65℃恒溫烘干，保存于干燥器中，連續(xù)收集4次(1~15 d/Ⅰ期; 16~30 d/Ⅱ期; 31~45 d/Ⅲ期; 46~60 d/Ⅳ期)。每網(wǎng)箱每一階段的魚糞混合均勻后稱重，作為分析樣品。測(cè)定實(shí)驗(yàn)飼料和糞便樣品中的干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪和Cr2O3含量，以計(jì)算飼料常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的表觀消化率(Apparent digestibility coefficients,ADCs)。其中，水分含量采用105℃烘箱干燥恒重法測(cè)定；粗蛋白含量采用凱氏定氮法(總氮×6.25)測(cè)定；粗脂肪含量采用氯仿–甲醇提取法測(cè)定；Cr2O3用高氯酸–硝酸濕式灰化后進(jìn)行定量測(cè)定。

飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪)ADCs的計(jì)算方法如下所述：

ADC(%)=100×[1–(×cr)/(×cr)]；

式中，為糞便中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量；為飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量；cr為飼料中Cr2O3的含量；cr為糞便中Cr2O3的含量。

1.4 肝臟和胃腸道消化酶測(cè)定

飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，用丁香酚溶液麻醉，解剖取樣。每網(wǎng)箱取6尾魚的肝臟和胃腸道組織，并根據(jù)Cataldi等(1987)和Garcia等(2001)的方法分離出前、中、后腸，各部分組織用0.86%的預(yù)冷魚用生理鹽水洗去內(nèi)容物，裝袋保存于–20℃冰箱。檢測(cè)前，將肝臟或胃腸道組織在4℃冰箱解凍，按照質(zhì)量∶體積=1 : 9的比例用上述生理鹽水勻漿，然后4℃、4000 r/min離心10 min，取上清液并稀釋不同倍數(shù)后進(jìn)行消化酶比活力的測(cè)定，并于24 h內(nèi)測(cè)完。其中，蛋白酶和淀粉酶比活力測(cè)定部位是肝臟、胃和前、中、后腸，脂肪酶僅測(cè)定其生理性發(fā)生和存量最多的肝臟和前腸部位。蛋白酶活力采用福林酚法測(cè)定，酶活力定義：每毫克蛋白40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位(U/mg prot) (施兆鴻等, 2016)。其中，胃蛋白酶在pH=2.4的酸性介質(zhì)條件下測(cè)定，腸道和肝臟蛋白酶在pH=7.5中性介質(zhì)條件下測(cè)定(劉愛君等, 2009)。淀粉酶(AMS)活力采用碘-淀粉比色法測(cè)定，酶活力定義(施兆鴻等, 2016)：每毫克蛋白在37℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個(gè)淀粉酶活力單位(U/mg prot)。

脂肪酶(LPS)活力使用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定，酶活力定義：37℃條件下，每克組織蛋白在本反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol的底物為1個(gè)酶活力單位(U/g prot) (施兆鴻等, 2016)，以下檢測(cè)結(jié)果中統(tǒng)一轉(zhuǎn)化為(U/mg prot)。

組織樣本中總蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。

上述組織淀粉酶、脂肪酶和總蛋白含量均使用南京建成生物工程研究所提供的專業(yè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)方法和酶活力定義均按照說明書進(jìn)行。

1.5 肝臟和腸道組織切片觀察

飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每網(wǎng)箱隨機(jī)取2尾魚，取約1 cm3肝臟和2~3 cm的前、中、后腸組織塊(根據(jù)1.4方法劃分腸道，并在各腸段和肝臟的中間處取材)，用0.86%魚用生理鹽水輕輕沖洗，濾干水分后，用Bouin氏液固定，24 h后，轉(zhuǎn)移至70%酒精中用于石蠟切片的制作。切片制作過程中，組織樣本經(jīng)過常規(guī)系列梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(5 μm)和H&E染色后，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察、拍攝并測(cè)量腸絨毛高度(HF)、寬度(HW)、密度(HD)和肌層厚度(tML)，統(tǒng)計(jì)杯狀細(xì)胞數(shù)量(dGC)，每個(gè)樣本取5張染色結(jié)果較好的切片進(jìn)行拍照。其中，HF和HW均選取一個(gè)腸道橫截面中的5根最高絨毛為測(cè)量對(duì)象；HD是以一個(gè)腸道橫截面的全部絨毛數(shù)量為測(cè)量值；dGC為橫切面上5根最高腸絨毛上皮層中的杯狀細(xì)胞數(shù)目；tML為橫切面上表征整個(gè)腸壁肌肉層的最大厚度(李志剛等, 2007; 黃玉章等, 2010; 于朝磊等, 2014)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，采用SPSS 17.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，若影響顯著，則采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼用溶菌酶對(duì)不同飼養(yǎng)時(shí)期吉富羅非魚飼料營(yíng)養(yǎng)成分表觀消化率的影響

經(jīng)過60 d的飼養(yǎng)，各添加組魚在不同生長(zhǎng)期對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)成分的表觀消化率見表2。在飼養(yǎng)Ⅰ期，各組魚對(duì)干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的表現(xiàn)消化率分別為60.48%~69.03%、82.38%~87.62%和70.71%~76.20%，其中，L36和L54組魚對(duì)干物質(zhì)和粗蛋白的表觀消化率顯著高于對(duì)照組(<0.05)，在L54組達(dá)到最大值。各溶菌酶添加組魚對(duì)粗脂肪的表觀消化率均顯著低于對(duì)照組(<0.05)，L72組最低；在飼養(yǎng)Ⅱ期，各組魚對(duì)干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的表觀消化率分別為69.24%~74.30%、88.04%~92.00%和80.82%~88.24%，隨溶菌酶添加量的增加，實(shí)驗(yàn)魚對(duì)粗蛋白的表觀消化率整體呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，L54~L90組顯著高于對(duì)照組，此時(shí)3組魚對(duì)干物質(zhì)、粗脂肪的表觀消化率存在顯著下降(<0.05)；在飼養(yǎng)Ⅲ期，各組魚對(duì)干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的表觀消化率為63.32%~ 71.67%、84.32%~88.79%和81.44%~88.58%，L36~L90組的干物質(zhì)、粗蛋白表觀消化率均顯著高于對(duì)照組，且L90組顯著高于其他各組(<0.05)，同時(shí)，粗脂肪表觀消化率在組間也整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，顯著高于對(duì)照組(<0.05)；在飼養(yǎng)Ⅳ期，各組魚對(duì)飼料干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的表觀消化率分別為59.25%~66.06%、79.63%~87.46%和64.78%~75.09%，除L54組外，其他各溶菌酶添加組魚對(duì)飼料干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的表觀消化率均顯著高于對(duì)照組(<0.05)，在L90組呈現(xiàn)最大值。

2.2 飼用溶菌酶對(duì)消化酶活力的影響

由表3可見，飼用溶菌酶對(duì)吉富羅非魚肝臟和胃腸道消化酶活力產(chǎn)生了不同程度的影響。與對(duì)照組相比，溶菌酶的添加對(duì)羅非魚胃、前腸和中腸蛋白酶活力具有顯著促進(jìn)作用，在L36、L54和L72組呈現(xiàn)最大值(<0.05)，后腸蛋白酶活力在組間無(wú)顯著性差異(>0.05)；淀粉酶方面，在高劑量添加劑組(L72和L90)的肝臟、胃和后腸部位顯著高于對(duì)照組(<0.05)，前腸中L54組顯著高于對(duì)照組，但在L72和L90組顯著低于對(duì)照組(<0.05)，中腸部位在除L72組外的其余添加組均顯著高于對(duì)照組(<0.05)；脂肪酶方面，L54和L72組在肝臟和前腸部位的酶活力顯著高于對(duì)照組和其他各添加組(<0.05)。

2.3 肝臟組織結(jié)構(gòu)變化

經(jīng)過60 d養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后，各組魚肝臟組織切片結(jié)果見圖1A~F。對(duì)照組和L18組魚出現(xiàn)較多的肝細(xì)胞核偏移和個(gè)別細(xì)胞核消失現(xiàn)象(圖1箭頭所示)；L36和L54組魚肝細(xì)胞排列整齊，形狀飽滿，相較于L0和L18組更致密，大小均一；高劑量添加組(L72和L90)魚肝細(xì)胞排列相對(duì)稀疏，出現(xiàn)較多的核消失、移和濃縮現(xiàn)象，L90組伴有纖維化趨勢(shì)(圖1箭頭所示)。

表2 飼用溶菌酶對(duì)吉富羅非魚不同飼養(yǎng)時(shí)期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響(%)

Tab.2 Effects of dietary lysozyme supplementation on apparent digestibility coefficients (ADCs) of GIFT tilapia at different feeding stages (%)

注: 不同上標(biāo)字母表示顯著性差異。下同

Note: Different superscript letters represent significant difference. The same as below

表3 飼用溶菌酶對(duì)吉富羅非魚肝臟和胃腸道消化酶活力的影響(U/mg prot)

Tab.3 Effects of dietary lysozyme supplementation on digestive enzyme activities of GIFT tilapia in the liver and gastrointestine (U/mg prot)

圖1 飼用溶菌酶對(duì)吉富羅非魚肝臟形態(tài)、結(jié)構(gòu)的影響(×400)

A: L0組; B: L18組; C: L36組; D: L54組; E: L72組; F: L90組 C: 細(xì)胞質(zhì); N: 細(xì)胞核; NM: 核偏移; ND: 核消失; NE: 核濃縮; FT: 纖維化

A: L0 group; B: L18 group; C: L36 group; D: L54 group; E: L72 group; F: L90 group C: Cytoplasm, N: Cell nucleus, NM: Nuclear migration, ND: Nuclear disappear, NE: Nuclear enrichment; FT: Fibrillation

2.4 腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.4.1 形態(tài)學(xué)指標(biāo) 由表4可見，經(jīng)過60 d的飼養(yǎng)，不同溶菌酶添加水平對(duì)吉富羅非魚的腸道各部位形態(tài)學(xué)指標(biāo)也產(chǎn)生了不同程度的影響。絨毛密度上，溶菌酶添加組較對(duì)照組要明顯增多(L18組除外，< 0.05)，但高劑量添加下(L90)存在顯著或數(shù)值上的下降趨勢(shì)。絨毛高度和寬度方面，L54和L72組在前腸和中腸部位均顯著高于對(duì)照組，后腸絨毛高度在L54和L90組較高，且各溶菌酶添加組的后腸絨毛寬度較對(duì)照組均顯著增加(<0.05)；在肌層厚度上，溶菌酶添加組在前腸和后腸部位有下降趨勢(shì)，L18、L36和L90顯著低于對(duì)照組(<0.05)，而在中腸部位，肌層厚度隨添加水平升高而呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，L36~L72組在數(shù)值上高于對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異(>0.05)。

表4 飼用溶菌酶對(duì)吉富羅非魚腸道形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響(μm)

Tab.4 Effects of dietary lysozyme supplementation on intestinal morphology of GIFT tilapia (μm)

2.4.2 腸道不同部位形態(tài)結(jié)構(gòu)的顯微觀察 圖2~圖4顯示了養(yǎng)殖60 d各組吉富羅非魚腸道不同部位的石蠟切片結(jié)構(gòu)。在顯微鏡下觀察，各組羅非魚腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)都較為完整、層次分明，腸黏膜上皮細(xì)胞密集且排列規(guī)則，高倍鏡下輪廓清晰，染色鮮明。但從發(fā)育程度上看，溶菌酶添加組魚的腸道各段較對(duì)照組有明顯優(yōu)勢(shì)。如圖2所示，對(duì)照組的前腸絨毛相對(duì)稀疏，質(zhì)地松軟，且絨毛高度較短，而L54~L90組魚的前腸絨毛明顯變得緊實(shí)高壯，與表4的測(cè)量結(jié)果相吻合。如圖3所示，與對(duì)照組相比，L36~L72組魚的中腸絨毛密度、高度和寬度有所增加，且絨毛排列整齊，但高劑量添加水平下(L90)的中腸絨毛發(fā)育出現(xiàn)下降趨勢(shì)，表現(xiàn)為絨毛變短、稀疏松弛，且肌層厚度變薄。如圖4所示，對(duì)照組的后腸絨毛有脫落現(xiàn)象，但肌層厚度仍較大，L36~L72組魚后腸絨毛密度有所增加，L54和L90組后腸絨毛高度也有增加趨勢(shì)。此外，添加溶菌酶也明顯提高了后腸絨毛寬度，這些均與表4的測(cè)量結(jié)果基本吻合。

2.5 腸粘膜杯狀細(xì)胞的變化情況

從表5可以看出，L54和L72組魚前腸腸黏膜上皮杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著高于其他各組(<0.05)；且與對(duì)照組相比，L36~L72組魚的中腸和后腸腸黏膜上皮杯狀細(xì)胞數(shù)量也有顯著增加(<0.05)。

3 討論

3.1 飼用溶菌酶對(duì)吉富羅非魚肝腸組織結(jié)構(gòu)發(fā)育的影響

早在Marshall(1998)提出的“腸-肝軸”理論中就已認(rèn)為，腸道和肝臟并不是2個(gè)完全獨(dú)立的器官，它們?cè)诠δ苌洗嬖谥鴱V泛的聯(lián)系。魚體生理性的“腸–肝軸”中，膽汁酸的“腸-肝循環(huán)”是其重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，構(gòu)造了二者之間天然的功能聯(lián)系(Cortes, 2013)。在水生動(dòng)物上常用腸道絨毛高度、絨毛密度以及杯狀細(xì)胞的數(shù)量等組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)來(lái)反映魚類腸道的發(fā)育和健康程度，并以此評(píng)估魚類腸道的消化吸收能力(聶國(guó)興等, 2007; Farhangi, 2001)。同時(shí)，肝臟的結(jié)構(gòu)形態(tài)和健康程度對(duì)于其本身消化功能和整個(gè)“腸–肝軸”系的正常運(yùn)轉(zhuǎn)也起到不可忽視的作用。本研究結(jié)果顯示，L36、L54和L72組魚在攝食含有溶菌酶飼料60 d后的腸道不同部位腸絨毛密度、高度和寬度長(zhǎng)勢(shì)較對(duì)照組顯著提高，說明適量溶菌酶的添加可以促進(jìn)吉富羅非魚腸道的生長(zhǎng)發(fā)育，這可能與溶菌酶進(jìn)入魚體后發(fā)揮的調(diào)控腸道菌群結(jié)構(gòu)平衡有關(guān)。對(duì)異育銀鯽()的研究表明，適量添加溶菌酶能夠促進(jìn)有益菌的增殖，同時(shí)，對(duì)諸如葡萄球菌科等有害菌群有抑制作用，這種對(duì)微生物結(jié)構(gòu)的正面調(diào)節(jié)作用能夠降低腸道維持，從而促進(jìn)腸絨毛發(fā)育(Chen, 2014)。然而，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加溶菌酶并沒有提高吉富羅非魚前腸、后腸的肌層厚度，甚至有下降趨勢(shì)，這可能與機(jī)體在確保腸道健康的前提下，減少腸道維持需求、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)有關(guān)。此外，溶菌酶的過量添加則可能破壞腸道微生物菌落結(jié)構(gòu)，使得機(jī)體腸絨毛發(fā)育減弱，此結(jié)論也在本研究有所體現(xiàn)。

圖2 飼用溶菌酶對(duì)吉富羅非魚前腸形態(tài)、結(jié)構(gòu)的影響(×100)

A: L0組; B: L18組; C: L36組; D: L54組; E: L72組; F: L90組

HF: 絨毛高度; HW: 絨毛寬度; tML: 肌層厚度; GC: 杯狀細(xì)胞

A: L0 group; B: L18 group; C: L36 group; D: L54 group; E: L72 group; F: L90 group

HF: Height of fold; HW: Width of fold; tML: Thickness of muscular layer; GC: Goblet cells

圖3 飼用溶菌酶對(duì)吉富羅非魚中腸形態(tài)、結(jié)構(gòu)的影響(×100)

A: L0組; B: L18組; C: L36組; D: L54組; E: L72組; F: L90組

A: L0 group; B: L18 group; C: L36 group; D: L54 group; E: L72 group; F: L90 group

圖4 飼用溶菌酶對(duì)吉富羅非魚后腸形態(tài)、結(jié)構(gòu)的影響(×100)

A: L0組; B: L18組; C: L36組; D: L54組; E: L72組; F: L90組

A: L0 group; B: L18 group; C: L36 group; D: L54 group; E: L72 group; F: L90 group

表5 各組魚腸粘膜杯狀細(xì)胞的數(shù)量變化(個(gè))

Tab.5 Quantity changes of intestine goblet cells of GIFT tilapia in different groups (ind.)

本研究結(jié)果還顯示，L36、L54和L72組魚腸黏膜上皮層中的杯狀細(xì)胞數(shù)量也有顯著提高，這進(jìn)一步促進(jìn)了吉富羅非魚腸道健康水平，相似結(jié)論在異育銀鯽(Chen,2014)、斷奶仔豬(Cooper, 2011)中已有報(bào)道，同時(shí)與溶菌酶具有類似功能的抗菌肽在無(wú)菌雞(Wang, 2009)日糧中作用效果一致。其內(nèi)在機(jī)制可能在于溶菌酶的添加有利于魚腸上皮杯狀細(xì)胞發(fā)生，從而更多產(chǎn)生黏蛋白，于腸上皮形成致密粘液層，更好地保護(hù)腸上皮組織抵御外來(lái)有害微生物的侵犯，降低腸道疾病發(fā)生。關(guān)于溶菌酶能夠促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖分化和加快組織修復(fù)的功能已在小鼠(林成招等, 2005; 劉晉峰, 2007)和兔(梁彥, 2012)等畜禽動(dòng)物上有過報(bào)道，而和溶菌酶具有類似功能的抗菌肽也在斷奶仔豬腸道損傷修復(fù)方面起到了相似的作用(Tang, 2013)。

結(jié)合肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察，本研究發(fā)現(xiàn)，L36和L54組魚的肝臟組織細(xì)胞更加飽滿，較對(duì)照組和L18組，細(xì)胞核偏移和濃縮的現(xiàn)象減少，從而能在總體水平上提高肝臟的健康程度；然而，高劑量添加水平組并沒有顯示出這種優(yōu)勢(shì)，這種和腸道相似的變化結(jié)果很可能與“腸–肝軸”系的連帶運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制有關(guān)，關(guān)于溶菌酶在此方面的研究機(jī)制需要進(jìn)一步論證。

3.2 飼用溶菌酶對(duì)吉富羅非魚消化酶活力的影響

一般來(lái)說，進(jìn)入腸道的食物會(huì)受到腸道運(yùn)動(dòng)帶來(lái)的機(jī)械性消化作用，同時(shí)，也會(huì)接觸消化酶而進(jìn)行化學(xué)性消化。消化酶活性的高低是評(píng)價(jià)養(yǎng)殖魚類對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化能力的重要指標(biāo)(劉襄河等, 2013)。邢思華等(2013)研究表明，在一定范圍內(nèi)添加溶菌酶能夠顯著提高草魚()肝胰臟的蛋白酶活性，但對(duì)腸道蛋白酶和淀粉酶活性沒有影響。本研究發(fā)現(xiàn)，隨飼料溶菌酶添加水平的提高，吉富羅非魚胃、前腸和中腸蛋白酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，在L36、L54和L72組呈現(xiàn)最大值，對(duì)后腸蛋白酶活性無(wú)顯著影響，同時(shí)，L54和L72組的肝臟和前腸的脂肪酶活性也有顯著提高，而對(duì)于淀粉酶，則在高劑量添加組(L72和L90組)表現(xiàn)出較高的酶活性(前腸和中腸不明顯)，這說明飼用溶菌酶能夠在一定程度上刺激吉富羅非魚肝臟和胃腸道消化酶的分泌，但存在添加劑量與所激發(fā)的消化酶種類不同的差異性變化。推測(cè)原因可能與溶菌酶作為蛋白酶類物質(zhì)進(jìn)入魚體后的排異反應(yīng)、魚體不同部位的適應(yīng)機(jī)制、消化酶自身特性等均有關(guān)系(Yokooji, 2013)，其內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。另一方面，溶菌酶對(duì)魚體消化道微生態(tài)的積極調(diào)控，使得機(jī)體內(nèi)環(huán)境處于一個(gè)最佳生理狀態(tài)，更有利于消化酶活性的發(fā)揮。

涂永鋒等(2004)研究表明，魚類腸黏膜柱狀上皮層中散落的杯狀細(xì)胞不僅是一類黏液細(xì)胞，又是一種典型的分泌型細(xì)胞，是儲(chǔ)存和分泌消化酶的重要場(chǎng)所，因而，杯狀細(xì)胞數(shù)目的提高會(huì)增加魚體消化酶的分泌量。本研究發(fā)現(xiàn)，L36、L54和L72組魚腸黏膜上皮層中的杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯高于其他組，這可能是這幾組魚消化酶分泌量提高的又一重要原因。

3.3 飼用溶菌酶對(duì)吉富羅非魚營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的影響

目前，關(guān)于溶菌酶對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收率的研究多見于畜禽動(dòng)物(張世卿等, 2008; 程時(shí)軍等, 2009; 丁亦男, 2012)，而在魚類上僅見于異育銀鯽(Chen, 2014)。這些研究表明，在飼糧中添加適量的溶菌酶能在一定程度上提高養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率，但作用不顯著。本研究通過跟蹤不同養(yǎng)殖周期內(nèi)吉富羅非魚對(duì)飼料干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的表觀消化率，發(fā)現(xiàn)在飼養(yǎng)Ⅰ期和Ⅱ期，L36和L54組魚對(duì)粗蛋白的表觀消化率顯著高于對(duì)照組，而高劑量添加水平下會(huì)存在顯著降低趨勢(shì)。隨著飼養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，到達(dá)飼養(yǎng)Ⅲ期和Ⅳ期，高劑量添加組魚對(duì)干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的表觀消化率也呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，甚至在L90組出現(xiàn)最大值，推測(cè)原因可能在飼養(yǎng)前期階段，魚體對(duì)中劑量添加水平下的溶菌酶飼料具有更快的適應(yīng)反應(yīng)，高劑量水平下反而存在較大排異行為，因此，在飼養(yǎng)前期，這2組魚先滿足生長(zhǎng)發(fā)育所需的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，而到養(yǎng)殖中后期，魚體對(duì)高劑量添加水平的溶菌酶飼料逐漸適應(yīng)，且隨水溫降低，對(duì)飼料干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的表觀消化率均有顯著提升，這與魚體的自我適應(yīng)機(jī)制、攝食水平、生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境變化均有很大關(guān)系。

Nilsen等(1999)研究表明，溶菌酶作為一種蛋白多肽類物質(zhì)，其在機(jī)體內(nèi)也可以一種潛在“蛋白酶”的形式存在，從而發(fā)揮類似消化酶的作用。在養(yǎng)殖Ⅰ期和Ⅱ期，L36和L54組魚的生理機(jī)能最優(yōu)，一方面通過刺激機(jī)體內(nèi)源性蛋白酶的分泌，另一方面在保證健康前提下，促使溶菌酶發(fā)揮抗菌、消化的雙重功能，使魚體消化機(jī)能進(jìn)一步提升(張娟娟等,2012)。關(guān)于消化酶活力的增強(qiáng)和分泌量的增加對(duì)魚類消化吸收過程的促進(jìn)作用已有大量報(bào)道(Das, 2014; Ray, 2012)，并在尼羅羅非魚() (Lara-Flores, 2003)、金頭鯛() (Suzer, 2008)、大西洋鮭()(S?rensen, 2011)等魚類上得到證實(shí)。另一方面，在該溶菌酶添加水平下，吉富羅非魚肝腸結(jié)構(gòu)的健康發(fā)育也促進(jìn)了魚體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率，相似結(jié)論已在肉雞、仔雞、斷奶仔豬等畜禽動(dòng)物有過報(bào)道(程時(shí)軍等, 2009; Humphrey, 2002; Nyachoti, 2012)。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)條件下，添加36、54 mg/kg的飼用溶菌酶可以促進(jìn)吉富羅非魚肝臟和腸道健康發(fā)育；添加水平在36~72 mg/kg范圍能夠激發(fā)吉富羅非魚胃、前腸、中腸蛋白酶及肝臟、前腸脂肪酶的分泌和活性提高；對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收方面，在飼養(yǎng)前期(Ⅰ期和Ⅱ期)，36、54 mg/kg添加水平主要促進(jìn)了魚體對(duì)粗蛋白的消化吸收率；中后期(Ⅲ期和Ⅳ期)，36~90 mg/kg添加水平下，干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的消化吸收率均有顯著提高?？傮w而言，36、54 mg/kg添加水平具有最穩(wěn)定的作用效果，其內(nèi)在機(jī)制與調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境微生態(tài)平衡、促進(jìn)魚體肝腸結(jié)構(gòu)發(fā)育和消化酶的分泌以及內(nèi)、外源性酶之間的互作機(jī)制均有關(guān)系。

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Effects of Dietary Lysozyme on the Digestive Tract Structure and Nutrient Digestibility of GIFT Tilapia ()

WANG Tan1,4, ZHAO Jinxin4, LIU Donglai5, KONG Chun1, HUA Xueming1,2,3①, WU Zhao1, WANG Gang1, FENG Yue1,2,3, YANG Jingfeng1,2,3, LIU Tao1,2,3

(1. Centre for Research on Environmental Ecology and Fish Nutrition (CREEFN) of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 3. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 4.Guangdong Haid Group Co., Ltd, Guangzhou 511400; 5. Zhonghan Town Fishery Station of Agricultural Comprehensive Service Center of Chaohu Anhui Province, Chaohu 238054)

To investigate the effects of lysozyme as a green feed additive on the development of the digestive tract and digestive utilization of nutrients in GIFT tilapia, a 60-day feeding trial was conducted with graded levels of dietary lysozyme (0, 18, 36, 54, 72, and 90 mg/kg, marked as L0, L18, L36, L54, L72, and L90 respectively). The results were as follows: The fish had a different feedback response on the digestive enzyme activity in the liver and the gastrointestinal tract among groups; the protease activity in the stomach, and the anterior and middle intestine of L36~L72 groups was significantly higher than that of the control group (<0.05); the lipase activity in the liver and the anterior intestine of the L54 and L72 groups was significantly higher than that of the control group (<0.05); and the amylase activity in the digestive tracts (anterior and middle intestine excluded) of the L72 and L90 groups was significantly higher than that of the control group (<0.05). The intestinal morphology showed that the values of villus density, villus height, and villus width of different intestinal parts in L36~L72 groups were higher than those of the control group, while the muscular thickness of the anterior and distal intestine was reduced in dietary lysozyme groups. The thickness of the middle intestines of the L18, L36, and L90 groups was significantly lower than that of the control group (<0.05), and there was a firstly increased and then decrease tendency. The thickness of the middle intestines of L36~L72 groups were all higher than the control group with no significant difference (>0.05). The goblet cell numbers were more in the L54 and L72 groups than in the control group (<0.05). The liver morphology showed that the liver cells were more voluptuous and denser in the L36 and L54 groups than in the control group, while worse health condition was found in the L90 group. With regards to apparent nutrient digestibility, the crude protein digestibility was significantly higher in the L36 and L540 groups than in the control group in periods I and Ⅱ (<0.05), and in periods Ⅲ and Ⅳ. The digestibility of dry matter, crude protein, and crude lipid were significantly higher in L36~L90 groups than in the control group (<0.05). The results above indicated that 36 and 54 mg/kg dietary lysozyme had the most stable efficacy, which could improve GIFT tilapia dry matter, crude protein, and crude lipid digestibility by promoting liver and intestine development and digestive enzyme activity.

GIFT tilapia; Lysozyme; Nutrient digestibility; Digestive enzyme; Digestive tract morphology

S963

A

2095-9869(2019)06-0076-12

10.19663/j.issn2095-9869.20180918001

http://www.yykxjz.cn/

王壇, 趙金鑫, 劉東來(lái), 孔純, 華雪銘, 吳釗, 王剛, 馮悅, 楊景豐, 劉韜. 飼用溶菌酶對(duì)吉富羅非魚消化道組織結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2019, 40(6): 76–87

Wang T, Zhao JX, Liu DL, Kong C, Hua XM, Wu Z, Wang G, Feng Y, Yang JF, Liu T. Effects of dietary lysozyme on the digestive tract structure and nutrient digestibility of GIFT tilapia (). Progress in Fishery Sciences, 2019, 40(6): 76–87

* 廣東省教育廳產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2012B091100372)資助[This work was supported by the Department of Education of Guangdong Province University-Industry Cooperation Project (2012B091100372)]. 王 壇，E-mail: wangtan0818@163.com

華雪銘，教授，E-mail: xmhua@shou.edu.cn

2018-09-18,

2018-10-21

HUA Xueming, E-mail: xmhua@shou.edu.cn

(編輯 馮小花)