付 博，王家哲，張 鋒，李英梅，任 平,2

(1.陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所 有害生物監(jiān)測(cè)與防控研究中心，陜西 西安 710043；2.陜西省酶工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710600)

陜西省是我國(guó)的獼猴桃種植大省，隨著獼猴桃產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，獼猴桃病害也不斷加重。近年來(lái)獼猴桃細(xì)菌性葉枯病成為新興的獼猴桃主要病害，研究發(fā)現(xiàn)其病原菌為丁香假單胞菌丁香致病變種(Pseudomonassyringaepv.Syringae)，該病主要危害獼猴桃葉片，輕時(shí)個(gè)別葉片表現(xiàn)出局部枯死癥狀， 重時(shí)則大部分葉片干枯死亡，嚴(yán)重影響果樹(shù)的生長(zhǎng)及果實(shí)的品質(zhì)[1, 2]。

傳統(tǒng)的獼猴桃葉枯病防治主要采用化學(xué)藥物防治，但由于生產(chǎn)過(guò)程中長(zhǎng)期大量使用化肥、農(nóng)藥，果園生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重惡化，果樹(shù)營(yíng)養(yǎng)供給不足，果樹(shù)自身對(duì)各種病蟲(chóng)害的抗性能力減弱，產(chǎn)品農(nóng)藥殘留的污染日漸嚴(yán)重，并影響了獼猴桃的生產(chǎn)、產(chǎn)品外銷、威脅人的健康和產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外積極探索并采用以微生物為主要拮抗物質(zhì)進(jìn)行植物病害防治，通過(guò)菌體和植物病害之間的相互作用研究證明了應(yīng)用生物防治技術(shù)保護(hù)重要經(jīng)濟(jì)作物是十分可行的，此外生物防治采用微生物菌株作為拮抗物質(zhì)，具有可擴(kuò)大培養(yǎng)、節(jié)約經(jīng)濟(jì)和沒(méi)有副作用的優(yōu)點(diǎn)[4]。

用于植物病害防治的拮抗微生物種類較多，包括放線菌[5]、芽孢桿菌和假單胞菌等，而由于芽孢桿菌自身能夠產(chǎn)生耐高溫、耐酸堿，抗逆性極強(qiáng)的芽孢而受到廣泛關(guān)注并作為生防菌劑被大量投放到實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中[6, 7]。目前已分離鑒定出來(lái)的對(duì)獼猴桃葉枯病有拮抗作用的菌種仍十分有限，而且現(xiàn)有菌種的抗病能力良莠不齊，因此，本研究擬從獼猴桃根際土壤中篩選出對(duì)獼猴桃葉枯病具有廣譜拮抗作用并且抗性較強(qiáng)的芽孢桿菌并對(duì)其進(jìn)行鑒定。從而不斷豐富現(xiàn)有的拮抗菌株資源，積極促進(jìn)生物防治技術(shù)在提高獼猴桃樹(shù)防病、抗病能力方面發(fā)揮更大的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 按常規(guī)方法采集陜西眉縣、周至縣和西安臨潼區(qū)獼猴桃園果樹(shù)根際土壤。

1.1.2 供試病原菌 獼猴桃細(xì)菌性病原菌，丁香假單胞菌丁香致病變種(編號(hào)1336)(Pseudomonassyringaepv.Syringae)，獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病病原菌(編號(hào)2102)(Pseudomonassyringaepv.actinidae)，菌種來(lái)源：購(gòu)于中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所。植物常見(jiàn)真菌性病原菌，獼猴桃灰霉病病原菌F3(Botrytiscinerea)、黃瓜枯萎病病原菌F5(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、甜瓜枯萎病病原菌F7(Fusarimaxysporiumf.sp.melonis)、蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病病原菌F9(Alternariaalternataf.sp.Mali)、辣椒疫病病原菌F11(Phytophthoracapsici)菌種來(lái)源：由西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室友情饋贈(zèng)。

1.1.3 主要試劑和儀器 PCR所用Buffer、dNTP、Taq酶等購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司，限制性內(nèi)切酶EcoR I 購(gòu)自Takara公司，克隆載體pGEM-T Easy購(gòu)自Promega公司，氨芐青霉素(Amp)、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、瓊脂糖等購(gòu)自Wolsen公司，細(xì)菌基因組DNA提取、質(zhì)粒提取、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購(gòu)自Biotake公司，其他常規(guī)實(shí)際均為國(guó)產(chǎn)分析純。離心機(jī)Centrifuge5415D、Centrifuge5810R、pCR儀、微量可調(diào)移液器、電轉(zhuǎn)化儀 Eleetroporator2510均購(gòu)自Eppendorf公司，DNA mini購(gòu)自Heto-Holten公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自SYNGENE公司，電泳儀購(gòu)自Bio-RAD公司，恒溫?fù)u床、培養(yǎng)箱、水浴鍋等均為國(guó)產(chǎn)儀器。

1.2 菌株分離和篩選

1.2.1 根際土壤中芽孢桿菌的分離篩選 土樣經(jīng)室溫干燥后稱取25 g放入225 mL含有少量玻璃珠的無(wú)菌水振蕩30 min，樣品懸液經(jīng)80 ℃水浴加熱20 min，取0.1 mL稀釋涂布牛肉膏蛋白胨平板，30 ℃倒置培養(yǎng)48 h，挑取單菌落劃線、編號(hào)保藏備用。

1.2.2 具有拮抗作用的菌種初篩 以獼猴桃葉枯病病原菌為拮抗對(duì)象，采用抑菌圈法[2]，每個(gè)待篩菌株4個(gè)重復(fù)，并利用SPSS軟件進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)分析[8]。

1.2.3 具有拮抗作用的菌種復(fù)篩 為進(jìn)一步確定無(wú)菌發(fā)酵液上清對(duì)獼猴桃葉枯病病原菌的拮抗作用，搖瓶發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min，取上清，采用細(xì)菌過(guò)濾器(0.22 μm)過(guò)濾除菌，制備無(wú)菌的發(fā)酵液上清，采用牛津杯法進(jìn)行復(fù)篩，每個(gè)待測(cè)菌株設(shè)置4組重復(fù)，測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值[2, 9]。

1.2.4 拮抗菌的抑菌譜檢測(cè) 以最常見(jiàn)的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病病原菌(Pseudomonassyringaepv.actinidae)為檢測(cè)對(duì)象，采用抑菌圈法檢測(cè)菌株拮抗效果；以獼猴桃灰霉病病原菌F3(Botrytiscinerea)、黃瓜枯萎病病原菌F5(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、甜瓜枯萎病病原菌F7(Fusarimaxysporiumf.sp.melonis)、蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病病原菌F9(Alternariaalternataf.sp.Mali)、辣椒疫病病原菌F11(Phytophthoracapsici)5種常見(jiàn)的植物真菌性病害為檢測(cè)對(duì)象，采用平板對(duì)峙法檢測(cè)菌株拮抗效果，30 ℃培養(yǎng)5 d，測(cè)量真菌圓形菌落邊緣為起止的直徑，以未接拮抗菌的真菌平板為對(duì)照，計(jì)算抑菌率[2, 10]。

抑制菌=

1.3 菌株鑒定

1.3.1 菌體形態(tài)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn) 篩選出對(duì)獼猴桃葉枯病具有廣譜拮抗作用的菌株并參照文獻(xiàn)[11]方法觀察菌體形態(tài)并測(cè)定生理生化特征。

1.3.2 16S rDNA序列測(cè)定 使用Biotake細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒抽提菌體基因組DNA，采用細(xì)菌鑒定通用引物27F(正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)/1492R(反向引物：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min、57.5 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用Biotake柱式DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行切膠純化。切膠純化產(chǎn)物連接pGEM-T Easy載體，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白篩選得到陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行EcoR I單酶切驗(yàn)證，將質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè)序，序列提交NCBI網(wǎng)站獲得GenBank登陸號(hào)[12-13]。

1.3.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 將菌株16S rDNA序列通過(guò)BLAST與NCBI網(wǎng)站GenBank中已知的序列進(jìn)行同源性分析，利用DNASTAR(MegAlign)將序列進(jìn)行對(duì)位排列，并手工適當(dāng)校正，MEGA3.1分析堿基組成，并以Kimura22參數(shù)計(jì)算遺傳距離，采用Nj鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)獼猴桃葉枯病有拮抗作用的芽孢桿菌初篩

按上述方法，從獼猴桃根際土壤中共分離出31株對(duì)獼猴桃葉枯病病原菌(編號(hào)1336)有拮抗作用的芽孢桿菌，其中抑菌圈直徑大于0.5 cm占總數(shù)的82%(圖1)。

圖1 菌株MX3-11對(duì)獼猴桃葉枯病病原菌的拮抗作用

2.2 對(duì)獼猴桃葉枯病有拮抗作用的芽孢桿菌的復(fù)篩

以初篩的對(duì)葉枯病病原菌(編號(hào)1336)有拮抗作用的31株芽孢桿菌為研究對(duì)象，檢測(cè)拮抗菌株的發(fā)酵液上清對(duì)致病菌的抑制作用。結(jié)果顯示，初篩的拮抗菌中有3株菌MX3-11、TJKB-24和NF2的無(wú)菌發(fā)酵液上清對(duì)葉枯病病原菌(編號(hào)1336)具有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑均>0.5 cm(表1)。

表1 發(fā)酵液上清對(duì)病原菌的抑制作用

2.3 菌株抑菌譜檢測(cè)

采用直接點(diǎn)樣法和平板對(duì)峙法檢測(cè)已篩選的菌株對(duì)獼猴桃潰瘍病病原菌和其他5種常見(jiàn)真菌性病原菌的拮抗作用，結(jié)果顯示，菌株MX3-11、TJKB-24和NF2對(duì)獼猴桃潰瘍病病原菌的抑菌圈直徑大于0.5 cm占總數(shù)的80%；對(duì)真菌性病原菌均表現(xiàn)出不同程度的拮抗能力(表2)，這3株菌對(duì)F5黃瓜枯萎病病原菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌率均大于60%，而對(duì)F9蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病病原菌的抑制作用較低，均小于33%。說(shuō)明菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的抗菌譜較廣，具有較大的應(yīng)用潛力。

表2 抑菌率的計(jì)算

圖2 菌體及芽孢顯微攝影(100倍)

2.4 菌株的鑒定

2.4.1 菌株形態(tài)和生理生化特征 菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的各項(xiàng)基本特征均表現(xiàn)出高度的一致性，菌株均為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，大小約0.87 μm ～1.18 μm×2.50 μm ～6.00 μm，好氧，周生鞭毛，產(chǎn)芽孢，菌落圓形、表面光滑、乳白色(圖2)。3株菌體的生理生化特征相同見(jiàn)表3。

表3 菌株生理生化特征

2.4.2 菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的16S rDNA序列分析及菌種鑒定 菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的16S rDNA序列長(zhǎng)度分別為1 449 bp、1 450 bp和1 452 bp。將序列提交NCBI基因庫(kù)，獲得GenBank登陸號(hào)分別為KC495121、KC495122和KC495120。以菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的16S rDNA 序列為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(Nj樹(shù))，結(jié)果顯示這3株菌與美麗短芽孢桿菌位于同一個(gè)進(jìn)化分枝，同源性100%。因此，鑒定菌株MX3-11、TJKB-24和NF2均為美麗短芽孢桿菌(Brevibacillusformosus)。[15-16]

圖3 以菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的16SrDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 結(jié)論與討論

隨著獼猴桃葉枯病的主要病原菌被確定，人們逐步開(kāi)展拮抗菌種選育工作以期能夠篩選出具有生物防治作用的生物菌劑，從而達(dá)到對(duì)獼猴桃病害的田間防治目的。李娟[2-3]從獼猴桃根際土壤分離篩選出2株對(duì)獼猴桃葉枯病病原菌具有拮抗作用的菌種，分別鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和巨大芽孢桿菌(Bacillusmegatherium)，通過(guò)田間小試試驗(yàn)研究證實(shí)了菌株的抗病作用十分有效。楊靈紅[17]將對(duì)獼猴桃葉枯病具有拮抗作用的巨大芽孢桿菌進(jìn)行了He-Ne激光誘變，將菌株的拮抗能力提高了26.61%。目前，國(guó)內(nèi)主要針對(duì)獼猴桃葉枯病的生防菌劑研究?jī)H限于這三篇報(bào)道，而國(guó)外暫未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

筆者研究從獼猴桃根際土壤中篩選出菌株MX3-11、TJKB-24和NF2，其對(duì)獼猴桃葉枯病病原菌具有明顯的拮抗作用，此外對(duì)獼猴桃潰瘍病病原菌、常見(jiàn)真菌性病原菌也具有較強(qiáng)抑菌效果，抗菌譜較廣。這3株菌能夠代謝產(chǎn)生胞外活性物質(zhì)，菌株的無(wú)菌發(fā)酵液上清對(duì)獼猴桃細(xì)菌性病原菌抑菌作用明顯，已有報(bào)道顯示短芽孢桿菌能夠產(chǎn)生廣譜且種類多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物[18]。因此，菌株MX3-11、TJKB-24和NF2具有良好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。

通過(guò)菌體形態(tài)、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析將菌株MX3-11、TJKB-24和NF2均鑒定為美麗短芽孢桿菌(Brevibacillusformosus)。這3株菌的篩選和鑒定極大的豐富了現(xiàn)有的對(duì)獼猴桃葉枯病具有拮抗作用的菌種研究，為開(kāi)發(fā)新型拮抗生物菌劑奠定了重要基礎(chǔ)。

1995年美麗短芽孢桿菌(Brevibacillusformosus)被鑒定為新種[15]，然而多年來(lái)尚未見(jiàn)該菌種的生防研究報(bào)道，但是近幾年國(guó)內(nèi)外研究人員正初步開(kāi)展短芽孢桿菌屬的抗病促生機(jī)制研究[19-21]，這些研究成果將為探索美麗短芽孢桿菌(Brevibacillusformosus)的生物拮抗機(jī)理提供重要的借鑒，從而積極促進(jìn)對(duì)該菌種的全面而深入的研究。