雷燕妮,張小斌

(1.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院,陜西 商洛 726000；2.商洛學(xué)院 健康管理學(xué)院、中國中醫(yī)科學(xué)院商洛中藥材GAP科研工程中心,陜西 商洛 726000)

伴隨著現(xiàn)代化生活的步伐，人們心腦血管疾病的發(fā)病急劇攀升。故預(yù)防及治療心腦血管疾病的藥品被廣泛關(guān)注，其中黃酮類化合物是治療該類疾病的代表藥物。蘆丁作為槐樹花蕾槐米的重要組成成分，其功能主要包括抗菌作用和止血作用[1]，其對紫外線的吸收功能，讓它作為天然防曬劑而被廣泛應(yīng)用[2，3]。

蘆丁的維生素P樣具備改善毛細(xì)血管的透通性，不僅擁有一定抗過敏和抗炎性，而且還可以防范血小板積聚等功能[4]。目前臨床上蘆丁廣泛應(yīng)用于高血壓病的防治，以及部分出血性疾病，并且對于糖尿病及并發(fā)病癥的預(yù)防和治療也有應(yīng)用[5]。總之，蘆丁開發(fā)潛力巨大，它被廣泛的用于預(yù)治心腦血管病和高血壓、糖尿病等疾病，蘆丁需求量每日劇增，原料供不應(yīng)求，原料短缺，而陜西商洛為槐花、槐米的主要生產(chǎn)區(qū)，面對緊張的供應(yīng)需求，本實驗的研究為進(jìn)一步發(fā)掘槐樹其它部位蘆丁的含量，擴(kuò)大蘆丁藥源，擴(kuò)大槐樹其他部位的利用率提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

采集地點：秦嶺南坡槐樹(國槐)；

采集時間：槐米：4.10-4.28；

槐花、花梗：4.29-5.15；

槐角：9.10-10.20。

1.2 實驗試劑

蘆丁對照品(石家莊啟迪科技有限公司，批號100080-201408,含量92.8%)，甲醇為分析純，色譜純甲醇，純凈水，硼酸，冰醋酸等。

1.3 實驗儀器

MS220電子天平(Radwag)；HH-M6電熱恒溫水浴鍋(上海赫田科學(xué)儀器有限公司)；高效液相色譜儀包括LC-20AT泵、SPD-20A檢測器 (日本島津制作所)；SHB-IIIG臺式循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城)；KQ2200系列臺式超聲波清洗器(上海精密儀器有限公司)；移液槍，移液管，吸液球，容量瓶等。

2 實驗方法

2.1 樣品制備

將采集的不同部位槐米、槐花、槐花花梗、槐角晾干；60℃恒溫箱保存6 h；稱取上述干燥原料各100 g，并將其進(jìn)行粉碎，過篩(3號50目)，編號備用。

2.2 提取方法考察

通過蘆丁性質(zhì)，對諸多提取方法綜合考察，結(jié)果表明超聲法效果顯著[6，7]。

超聲法主要是利用超聲波的空化作用[8]，它是通過固有頻率的超聲波使液體中大小尺寸合適的氣泡共振，將細(xì)胞壁振破，從而使有效成分分離。

2.3 線性關(guān)系考察

重在考察被測組分濃度與峰面積間的線性范圍。準(zhǔn)確稱取60攝氏度下干燥的蘆丁5.0 mg，并給其加入25 mL的70%甲醇，加水至50 mL，其濃度為100 ug·mL-1。準(zhǔn)確吸取1.0 、2.0、3.0、4.0、5.0 μL分別置于10 mL量瓶中，加入甲醇，使蘆丁含量分別為10、20、30、40、50 ug·mL-1；按上述色譜條件測定，縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)分別為峰面積、對照品濃度，進(jìn)行回歸，并計算出曲線方程和相關(guān)系數(shù)。

結(jié)果：曲線方程為y=4 981.2x+5 243.5，相關(guān)系數(shù)R=0.9989；表明蘆丁在(10 ～50 ug·mL-1)的濃度間與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度與峰面積

2.4 精密度考察

進(jìn)行重現(xiàn)性實驗。精密吸取濃度為30 μg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL進(jìn)行液相色譜測定，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄其峰面積，并計算RSD%(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差)。

結(jié)果：蘆丁峰面積平均積分值為：153 769.5，RSD為2.2%，表明精密度良好。

表2 精密度測試結(jié)果(n=5)

2.5 樣品中蘆丁含量測定

參考相關(guān)文獻(xiàn)資料[9，10]，筆者對槐樹上槐米、槐花、槐花花梗、槐角等不同部位的蘆丁用HLPC，并分別對其內(nèi)在含量進(jìn)行相應(yīng)的測定。

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-1%冰醋酸(32∶68)為流動相；檢測波長為257 nm；柱溫為室溫；流速：1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量：10 uL。

2.5.2 供試品溶液配制 精密稱取槐花、槐米、槐角、花梗各7.5 g(各6份)。

將硼酸0.08 g置于150 mL的三角瓶中，加入70%甲醇30 mL,并給予超聲波提取，得到濾液；將濾渣再次超聲提取兩次，將這三次的濾液定容至100 mL。精密量取1 mL于25 mL量瓶中，加水至刻度，得到0.3 mg·mL-1的供試品溶液，備用。

2.5.3 測定法 針對對照和供試品溶液各10 μl進(jìn)行吸取，并將其注入液相色譜儀進(jìn)行測定，對兩者在溶液中蘆丁的峰面積進(jìn)行詳細(xì)記錄，并根據(jù)以下公式對試品溶液中蘆丁的含量進(jìn)行計算：

式中：供試品峰面積為AX；

供試品深度為CX；

對照品的峰面積為AR為；

對照品的濃度為CR；

稀釋倍數(shù)為S；

稱樣量為W。

3 結(jié)果與分析

依據(jù)以上設(shè)置條件和方法，分別測試槐樹各個不同部位中蘆丁的含量，重復(fù)3次，分別計算平均值，結(jié)果見表1、圖1、圖2、圖3、圖4、圖5。

表1 不同部位蘆丁的濃度、峰面積、含量

圖1 蘆丁對照品色譜

圖2槐米中蘆丁含量色譜

圖3 槐花中蘆丁含量色譜

圖4 花梗中蘆丁含量色譜

圖5槐角中蘆丁含量色譜

通過對表1、圖1、圖2、圖3、圖4、圖5的結(jié)果進(jìn)行綜合分析可知在相同條件下，對采集不同時期槐樹不同部位的蘆丁進(jìn)行提取并測定含量，其含量從高到低依次為：槐米(16.48%)>槐花(13.06%)>槐花梗(7.83%)>槐角(1.99%)，其中槐米中蘆丁含量16.48%為最高。依據(jù)實驗結(jié)果分析槐樹四種不同部位的蘆丁含量的不同，可能與產(chǎn)地種植條件、存放時間、干燥方法，以及該品種類型、采集期等相關(guān)因素，有著密切聯(lián)系。

4 討論

蘆丁在我國主要以槐米的形式提取，需求量極大，約1 000 t·a-1，國際上則以法國、比利時為消費大國，需求量在500 t左右[11]，而槐米的資源仍不充分，很難滿足人類需要，故急需尋求更多增加蘆丁產(chǎn)量的方法，緩解供需緊張，可見，加大心血管藥物的來源就顯得尤為重要。

采用超聲波提取法對槐樹上槐米、槐花、槐花花梗、槐角等不同部位的蘆丁進(jìn)行提取，用HLPC對其含量分別進(jìn)行測定。結(jié)果表明其含量分別為：槐米16.48%，槐花13.06%，槐角1.99%，槐花梗7.83%。從各部位含量以及與生物總量的關(guān)系綜合考慮，以采集槐米提取蘆丁為好，如果采集時間已過，亦可采集槐花、花梗以擴(kuò)大藥源。過去藥農(nóng)采收槐米或槐花時，常用的方法是剪掉槐米或槐花的整個花序，干燥，它的花蕾就會脫落，花梗棄去不用，通過筆者試驗，測出花梗中蘆丁含量為7.8%，而且總重量可以達(dá)到槐米的3倍，因此今后槐花采集加工無需剪掉花梗直接采摘，工廠無特殊要求可直接帶花梗提取蘆丁，既節(jié)省人力又節(jié)約了資源，變廢為寶。