張晟銘，于慶生，彭 輝，劉舉達，周富海，經文善，余樹山，馮 輝

(1.安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院普外科，安徽 合肥 230031；3.安徽省中醫(yī)藥科學院中醫(yī)外科研究所，安徽 合肥 230031)

腸道是機體進行食物消化與各類營養(yǎng)物質吸收的重要場所，同時也是機體各種細菌與毒素富集之地，人體內雖有各種屏障保護，但腸上皮黏膜機械屏障是機體抵抗腸道病原微生物入侵的首要屏障，因為其可有效通過其內緊密連接阻斷大分子物質及各種微生物。研究發(fā)現，緊密連接主要由緊密連接蛋白(zonula occludin-1，ZO-1)、封閉蛋白、咬合蛋白構成[1-2]。

目前，通過多種方法干預腸黏膜上皮緊密連接及其分子結構的研究在國內外已有報道[3-4]，中醫(yī)藥對其影響的研究較少[5-6]，而有關健脾通里中藥對手術創(chuàng)傷后腸黏膜上皮緊密連接及其分子干預的研究更是空白。既往研究證實，健脾通里中藥芪黃煎劑在保護腸黏膜屏障功能上有顯著療效[7]，但其對緊密連接的作用尚未可知。

本研究擬觀察芪黃煎劑對胃切除模型大鼠腸黏膜上皮緊密連接形態(tài)、寬度的影響，并觀察其對小腸組織ZO-1、封閉蛋白、咬合蛋白mRNA表達的影響，以探討其可能的作用機制。

1 材料

1.1 動物 45只健康清潔級Wistar雄性大鼠，日齡(56±7)d，體質量(298±22)g。由安徽醫(yī)科大學動物實驗中心[動物生產許可證號：SCXK(皖)2017-001]提供。在恒溫(24±2)℃、光照12 h環(huán)境、相對濕度控制在45%～55%，自由飲水進食。

1.2 藥物及配制 按照筆者既往研究方法[8]，將中藥黃芪、大黃、白術、黨參、枳實、厚樸、丹參、黃芩按20∶10∶20∶20∶10∶10∶15∶12質量比混合，量取按此比例混合的生藥234 g，加水500 mL，煎30 min(其中大黃后下)，過濾濃縮至1.0 g/mL的生藥煎劑，4 ℃保存。中藥及整蛋白型腸內營養(yǎng)劑(德國milupa gub H生產，批準文號 H20030467)均購于安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥房。

1.3 試劑及儀器 Trizol試劑購自美國Thermo公司；逆轉錄試劑盒購自美國Thermo公司；LightCycler 480 SYBR Green I Master購自美國Roche公司，引物由上海生物工程股份有限公司合成；透射電鏡(JEM-1010)購于日本日立公司；RT-PAR儀(StepOne型)購于美國Agilent公司；逆轉錄儀購于德國Eppendorf公司。

2 方法

2.1 動物分組及胃切除模型制作 實驗前適應性喂養(yǎng)1周后，將大鼠按隨機數字表法分為假手術組、標準腸內營養(yǎng)組、中藥組，每組15只。采用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉所有大鼠，用75%乙醇無菌操作手術區(qū)，選擇腹部中腹切口，逐層進入腹腔，找到大鼠的胃，切斷胃的大小彎曲之間的胃前壁，用1-0絲線“8”字縫合?？p合后，在大鼠十二指腸懸韌帶(Treitz韌帶)遠端15 cm的空腸前壁處，用12號注射器針頭打孔，并將1.0 mm直徑的硅導膠管置于空腸中。在腹壁上戳出另一個小孔，由導管的另一端將導管從頸背的雙側肩胛區(qū)域的皮膚取出，并且縫合腹部和頸部后切口。假手術組：隨機選擇15只清潔型大鼠，僅縫合中腹部切口，未進行胃切除術。

2.2 干預方法 ①假手術組：手術后僅自由飲水進食。②標準腸內營養(yǎng)組：術后第1天起，進行腸內營養(yǎng)，滴注方法、熱量參照文獻[8]方法，腸內營養(yǎng)制劑選用瑞素160 g用溫開水溶解成500 mL的溶液，每100 mL含830 kJ熱量，每只大鼠按每日120 kJ/kg提供熱量，每日注入腸內營養(yǎng)液容積的計算公式：

V(營養(yǎng)液)=(120 kJ/kg×m(體質量)/(8.3 kJ/mL)。

式中體質量的計量單位為kg。每小時滴入營養(yǎng)液2 mL，分2次注入，持續(xù)1周。③中藥組：滴注的營養(yǎng)制劑、熱量、方法、療程均同標準腸內營養(yǎng)組。按照文獻[8]的方法，在滴注營養(yǎng)液前給予芪黃煎劑，每小時滴入營養(yǎng)液2 mL，每日2次，溫度保持25 ℃。持續(xù)1周。

2.3 標本制作和指標檢測方法

2.3.1 緊密連接結構檢測 所有大鼠干預7 d后，1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后取材，2.5%戊二醛磷酸緩沖液固定，90%乙醇混合90%丙酮(1∶1)脫水，純丙酮+OTC包埋液(1∶2)室溫過夜包埋，45 ℃烘箱內烘烤12 h固化，超薄切片機對組織塊切片為50～60 nm，鈾鉛染液染色，透射電鏡下觀察腸黏膜上皮細胞緊密連接的超微結構并攝片保存，使用螺旋測微器測量照片中緊密連接寬度，對照放大倍數計算得出緊密連接寬度。

2.3.2 熒光定量PCR檢測ZO-1 取100 mg小腸組織，液氮中研成粉末，收集入2 mL Eppendorf管中，加入1 mL Trizol，按照說明書操作提取總RNA，在One drop超微量分光光度計上檢測260 nm和280 nm吸光度，分析RNA的純度和含量。使用MMLV Reverse Transcriptase試劑盒(大連寶生物公司)將總RNA轉錄成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq Kit (Takara Bio Inc.)進行qPCR檢測，PCR反應在ABI StepOne Plus系統上進行，95 ℃下預變性10 min；95 ℃下反應20 s，60 ℃下反應30 s，72 ℃下反應30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內參，2-ΔΔCT法計算mRNA的相對表達量。擴增使用的引物：

封閉蛋白：正向引物為5′-CCTGCCCCAATGGAAGATTT-3′，反向引物為5′-CCGATGACAGCCATCCACAT-3′；

咬合蛋白：正向引物為5′-TGCATGTTCGACCAATGC-3，反身引物為 5′-AAGCCACTTCCTCCATAAGG-3′；

ZO-1：正向引物為5′-CGCCTCTGTCCAACTCTTCTCT-3′，反向引物為5′-GTGTGAATCGGTTGTATGCTG-3′；

GAPDH：正向引物為5′- GGAAAGCTGTGGCGTGAT-3′，反向引物為5′- AAGGTGGAAGAATGGGAGTT-3′。

3 結果

3.1 3組大鼠腸黏膜上皮細胞緊密連接形態(tài)及寬度比較 透射電鏡下，3組大鼠腸黏膜緊密連接結構(箭頭所示)均清晰可見，緊密連接位于上皮細胞側面、近游離面的頂端，呈狹窄的帶狀(焊接線或嵴線)；緊密連接處可見細胞膜表面不連續(xù)的融合點或吻合點。見圖1。與假手術組比較，標準腸內營養(yǎng)組大鼠腸黏膜上皮細胞緊密連接寬度顯著減小(P<0.05)；與標準腸內營養(yǎng)組比較，中藥組大鼠腸黏膜上皮細胞緊密連接寬度顯著增加(P<0.05)。見表1。

3.2 3組大鼠小腸組織中ZO-1、封閉蛋白、咬合蛋白mRNA表達水平比較 與假手術組比較，標準腸內營養(yǎng)組大鼠小腸組織中ZO-1、封閉蛋白、咬合蛋白mRNA表達水平均顯著下調(P<0.05)；與標準腸內營養(yǎng)組比較，中藥組ZO-1、封閉蛋白、咬合蛋白mRNA表達水平均顯著上調(P<0.05)。見表2。

注:A.假手術組;B.標準腸內營養(yǎng)組;C.中藥組圖1 3組大鼠腸黏膜上皮細胞緊密連接的形態(tài)(鈾鉛染液染色,1×20 000倍)

表1 3組大鼠緊密連接寬度比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與標準腸內營養(yǎng)組比較，#P<0.05

表2 3組大鼠小腸組織緊密連接相關

注：與假手術組比較，*P<0.05；與標準腸內營養(yǎng)組比較，#P<0.05

4 討論

腸上皮作為腸腔與腸間質之間的界面，不僅調控機體水液以及各組營養(yǎng)物質的運輸，還為抵抗各類病原體及抗原提供了第一道屏障，這一作用的實現有賴于腸上皮細胞間的重要結構——緊密連接[9-10]。緊密連接結構主要由兩種ZO-1組成，一種是細胞膜上存在的跨膜結構蛋白；另一種是位于細胞質中的蛋白質，其與細胞的各種蛋白質結合，并且具有膜蛋白和細胞骨架橋梁的作用。它們呈帶狀廣泛分布于細胞中，前者主要由跨膜蛋白咬合蛋白與封閉蛋白構成，后者主要由胞內支架蛋白ZO蛋白家族組成[11]。它們連同細胞骨架一起，是緊密連接黏膜屏障功能的結構基礎，決定了腸道的選擇透過性[12]。

封閉蛋白是一種分子量約20 000的緊密連接跨膜蛋白，兩個細胞外環(huán)和一個短細胞內環(huán)由211個氨基酸殘基組成，相鄰細胞通過外環(huán)由“拉鏈”結構封閉，封閉蛋白的C-末端能與ZO-1相互作用來促進緊密連接的合成，促進傷口愈合[13]。咬合蛋白是一種分子量約為65 000的跨膜蛋白，其結構與封閉蛋白類似，差異在于其N-末端與C-末端顯著縮短。有研究結果表明，咬合蛋白可能參與協調細胞骨架的活動與各種信號通路，以維護上皮細胞表型，促進創(chuàng)傷的愈合[14-15]。ZO-1是一種分子量為2.2×105的支架蛋白，由1 475個氨基酸組成。研究發(fā)現，ZO-1可以感受到胞外對緊密連接的機械沖擊，進而協調細胞增殖分化，極化細胞，裝配連接細胞的過程，從而促進創(chuàng)傷的愈合[16]。本實驗結果表明，胃切除大鼠腸黏膜緊密連接連續(xù)性和完整性遭到破壞，緊密連接寬度明顯變窄；運用健脾通里中藥芪黃煎劑后，大鼠腸黏膜上皮受損的緊密連接得到修復。從分子生物學角度來分析，本實驗中胃切除大鼠模型的建立使ZO-1、封閉蛋白、咬合蛋白mRNA表達水平降低，提示創(chuàng)傷能夠使腸黏膜受到損傷；運用芪黃煎劑后，腸上皮內ZO-1、封閉蛋白、咬合蛋白mRNA水平顯著增加，說明中藥芪黃煎劑能夠修復受損的腸黏膜細胞。其作用機制可能是提升了腸黏膜上皮細胞ZO-1、封閉蛋白、咬合蛋白水平，加速腸黏膜中ZO-1的恢復，加速腸黏膜屏障的恢復，促進機體的恢復。

筆者根據長期的臨床實踐[17-19]觀察到，胃癌術后患者早期常出現氣短、乏力、舌淡、苔白、脈細弱，或是腹部脹痛、肛門未排氣排便的癥狀，屬于氣血虛弱與腑實氣滯并存的證候。依據李東垣《脾胃論》中補中益氣湯和張仲景《傷寒論》中大承氣湯的組方的啟示，取補中益氣湯中黃芪、白術和黨參以補其虛，取大承氣湯中大黃(后下)、枳實和厚樸以泄其實，再配伍黃芩、丹參并命名“芪黃煎劑”。方中大黃通里攻下、蕩滌腸胃，枳實行氣散結、消痞除滿，厚樸行氣消積、通腑行氣，此三藥配伍取大承氣湯之功用以推陳出新，促進胃切除術后胃腸之腑蠕動、傳化功能恢復。黃芪健脾補中、益氣養(yǎng)血，能夠加快全身各器官組織功能恢復及加快消化道功能恢復；白術補氣健脾，促進胃腸運動，抑制胃酸分泌；黨參補脾養(yǎng)胃，健運中氣，促進小腸對營養(yǎng)物質的吸收。此三藥配伍取補中益氣湯之功用以補脾益氣、行氣養(yǎng)血，促進胃切除術后氣血虧虛的恢復。再輔以黃芩清熱解毒，丹參活血化瘀，能夠改善微循環(huán)，增加吻合口周圍血流量，和具有清熱瀉下的大黃配伍能消除吻合口炎癥、水腫并促進其愈合。諸藥配伍互相協調，以達到健脾通理的功效。研究發(fā)現，健脾和通里中藥可以保護腸黏膜屏障[20-21]。既往的臨床及實驗研究證實芪黃煎劑具有類似的作用[7，17]。并且最近的動物實驗闡明其機制為芪黃煎劑調節(jié)ZO-1、封閉蛋白、咬合蛋白的表達，抑制ZO-1的磷酸化水平，恢復腸黏膜屏障的緊密連接連續(xù)性和完整性，從而達到保護腸黏膜屏障的作用[8]。

本實驗從腸黏膜細胞亞顯微結構和分子水平研究健脾通里中藥芪黃煎劑能否保護腸黏膜ZO-1結構及其可能的機制，為臨床上應用芪黃煎劑奠定了理論基礎。