孫小草，張 強，章秀梅，劉叢彬，俞年軍,2，謝冬梅,2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源保護與開發(fā)研究所，安徽 合肥 230012)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是機體接觸變應(yīng)原后由免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性慢性炎癥性疾病，其典型癥狀為陣發(fā)性噴嚏、鼻癢和鼻塞、流涕等[1]。AR的發(fā)病機制復(fù)雜，現(xiàn)代研究認為其主要是免疫調(diào)節(jié)細胞Th1與Th2比例失衡引起的變應(yīng)性炎癥疾病。當Th1細胞釋放的干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等細胞因子不足時，Th2細胞會出現(xiàn)亢進現(xiàn)象，產(chǎn)生大量的白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)等細胞因子，從而引起IgE過量，引起AR[2-3]。目前臨床治療AR的藥物種類有糖皮質(zhì)激素類、抗組胺類、抗白三烯類等，其中抗組胺類藥物具有良好的安全性、較少的不良反應(yīng)等優(yōu)點而成為臨床常用藥，如氯雷他定、依巴斯汀[3-5]。

蒼耳子(Xanthii Fructus)為菊科植物蒼耳(XanthiumsibiricumPatr.)的干燥成熟帶總苞的果實，具有散風寒、通鼻竅、祛風濕的功效[6]。在治療鼻炎、鼻竇炎及AR的30種臨床常用中藥方劑中，含有蒼耳子的有23種，且均作為君藥或臣藥使用，如以蒼耳子為君藥的蒼耳子散對小兒AR具有治療作用[7]。由蒼耳子揮發(fā)油制備的蒼耳油滴鼻劑有明顯的降低AR豚鼠血清IgE水平，修復(fù)鼻黏膜結(jié)構(gòu)的作用[8]。此外，研究發(fā)現(xiàn)蒼耳子中含有的咖啡奎寧酸類化合物可能為抗炎鎮(zhèn)痛的主要活性成分之一，其水提取物有抗過敏活性[9]。本實驗通過復(fù)制AR豚鼠模型，觀察中藥蒼耳子水提取物對AR豚鼠鼻部行為學(xué)癥狀、鼻黏膜組織病理變化以及血清炎癥細胞因子水平的影響，為蒼耳子治療AR提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物及分組 SPF級豚鼠70只，體質(zhì)量200～240 g，購于南京市江寧區(qū)青龍動物繁殖場[生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2012-0008]。將豚鼠隨機分為正常組，模型組，氯雷他定組(2 mg/kg)，玉屏風散組(3 g/kg)，蒼耳子水提取物高劑量(4 g/kg，相當于成人臨床用量的6倍)、中劑量(2 g/kg)、低劑量(1 g/kg)組，每組10只，雌雄各半。

1.2 藥物與試劑 中藥蒼耳子于2017年10月采自北京市朝陽區(qū)長鄉(xiāng)店，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)方成武教授鑒定為菊科植物蒼耳(XanthiumsibiricumPatr.)成熟帶總苞的果實。采用水提取法[10]制備，濾液加熱濃縮至濃度為0.4 g/mL，備用；將氯雷他定片溶于蒸餾水，制成2 mg/mL的溶液；將玉屏風散溶于蒸餾水，制成3 g/mL的溶液。

卵蛋白(ovalbumin，OVA；批號 926A034)：北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鋁(批號 21645-51-2)：上海麥克林生化科技有限公司；氯雷他定(批號 180225073)：西安楊森制藥有限公司；玉屏風顆粒(批號 ZFB1704)：云南白藥集團股份有限公司；IgE、IL-4、IFN-γ ELISA檢測試劑盒(批號分別為20180516、20180522、201800426)：北京安迪華泰科技有限公司。

1.3 儀器 MSS全波長酶標儀(型號 RT-6000)：深圳雷杜公司；高速冷凍離心機(型號 JW3021HR)：安徽嘉文儀器公司；渦旋混合器(型號 GL-88B)：其林貝爾儀器制造公司；TS-12生物組織自動脫水機；BM-IX生物組織石蠟包埋機；LEICA 2016輪轉(zhuǎn)式切片機；Olympus BX51顯微鏡；JD-80ID形態(tài)學(xué)圖形分析系統(tǒng)。

2 方法

2.1 模型復(fù)制 基礎(chǔ)致敏階段采用腹腔注射、局部刺激階段采用滴鼻的方法復(fù)制AR豚鼠模型[11]。①基礎(chǔ)致敏階段：OVA和氫氧化鋁以1∶100容積比溶于生理鹽水中，使OVA的濃度為0.3%，作為致敏劑。每只豚鼠腹腔注射1 mL，隔日1次，共致敏7次，用時14 d。②局部刺激階段：從第22—31天，對每只豚鼠采用滴鼻法，以5% OVA生理鹽水溶液每側(cè)5 μL滴于豚鼠雙側(cè)鼻孔，隔日1次。以上步驟正常組均以等容積生理鹽水代替。

每日滴鼻后，依據(jù)鼻癢、流涕、呼吸輕重程度及噴嚏次數(shù)多少為評分標準[12]。①鼻癢：輕擦鼻幾次，計1分；撓鼻不止，計2分；不斷撓鼻，計3分。②流涕：流至前孔，計1分；過鼻孔，計2分；流涕滿面，計3分。③呼吸：呼吸急促，計1分；明顯喘息，計2分；喘息致死，計3分。④噴嚏：滴鼻后30 min內(nèi)1～3個，計1分；4～10個，計2分；10個以上，計3分。于第22、26、30天滴鼻后30 min內(nèi)，觀察各組豚鼠的過敏性癥狀，并將各癥狀積分疊加，總分大于5分者為模型復(fù)制成功。

2.2 分組及給藥 最后一次滴鼻后，根據(jù)鼻部行為學(xué)癥狀評分結(jié)果重新隨機分為7組。正常組與模型組豚鼠灌胃給予等容量蒸餾水，其余各組豚鼠分別灌胃給予相應(yīng)藥物，連續(xù)14 d，每日1次。同時采用5% OVA生理鹽水溶液隔日滴鼻，以維持過敏性癥狀直至實驗結(jié)束。并于給藥后第7、13天滴鼻后30 min觀察過敏性癥狀并進行評分。

2.3 檢測指標及方法

2.3.1 鼻部行為學(xué)癥狀觀察 模型復(fù)制期間，于局部刺激階段觀察第22、26、30天各組豚鼠的過敏性癥狀并進行評分。給藥期間，于給藥第7、13天再次激發(fā)，觀察各組豚鼠的過敏性癥狀并記錄最后一次滴鼻評分。評分標準見“2.1項”。

2.3.2 鼻黏膜組織病理變化觀察 末次給藥1 h后，用10%水合氯醛麻醉處死豚鼠，打開鼻蓋骨，暴露鼻甲及骨性鼻中隔，剝離完整鼻黏膜后放入4%甲醛固定，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照、分析。

2.3.3 血清IL-4、IFN-γ及IgE水平檢測 末次給藥1 h后，用10%水合氯醛麻醉處死。腹主動脈取血，推入離心管靜置3 h后，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，收集血清。根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒說明書操作，依次檢測實驗豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、IgE水平。

3 結(jié)果

3.1 蒼耳子水提取物對AR豚鼠鼻部行為學(xué)癥狀的影響 模型復(fù)制期間，從第1次滴鼻開始，豚鼠30 min內(nèi)均出現(xiàn)不同程度撓鼻、噴嚏癥狀，但無明顯流涕、呼吸急促等癥狀；從第3次滴鼻開始，復(fù)制模型的豚鼠不僅出現(xiàn)撓鼻不止、噴嚏不斷，還出現(xiàn)流涕、呼吸急促等癥狀；隨著滴鼻次數(shù)的增加，模型豚鼠過敏性癥狀也越來越明顯。結(jié)果說明采用OVA和氫氧化鋁腹腔注射并局部刺激的豚鼠AR模型復(fù)制成功。

給藥后，與模型組相比，除玉屏風散組外，其他用藥組AR豚鼠鼻部行為學(xué)癥狀積分均有不同程度的降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果說明蒼耳子水提取物對AR豚鼠的過敏性癥狀有一定影響。見表1。

3.2 各組豚鼠鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)變化比較 HE染色結(jié)果顯示，正常組豚鼠鼻黏膜上皮組織結(jié)構(gòu)完整，無血管、腺體改變及炎癥細胞、嗜酸性粒細胞浸潤(圖1A)。模型組豚鼠鼻黏膜上皮組織出現(xiàn)明顯脫落，小血管、腺體出現(xiàn)明顯的增生擴張，組織水腫，大量炎癥細胞、嗜酸性粒細胞浸潤(圖1B)；氯雷他定組鼻黏膜上皮組織結(jié)構(gòu)較為完整，未見明顯小血管增生，少量炎癥細胞浸潤(圖1C)；玉屏風散組鼻黏膜上皮組織輕微脫落，腺體輕微擴張，有嗜酸性粒細胞浸潤(圖1D)；蒼耳子水提取物高劑量組鼻黏膜上皮組織較為完整，少量炎癥細胞浸潤(圖1E)；中劑量組上皮組織基本完整，組織輕微水腫，有炎癥細胞浸潤(圖1F)；低劑量組鼻黏膜上皮組織有輕微脫落，小血管、腺體增生擴張明顯，炎癥細胞、嗜酸性粒細胞浸潤明顯(圖1G)。

表1 各組豚鼠鼻部行為學(xué)癥狀積分比較

注：與正常組比較，*P<0.05

注:A.正常組;B模型組;C.氯雷他定組;D.玉屏風散組;E.蒼耳子水提取物高劑量組;F.蒼耳子水提取物中劑量組;G.蒼耳子水提取物低劑量組圖1 各組豚鼠鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)變化比較(HE染色,10×20倍)

3.3 各組豚鼠血清IgE、IL-4、IFN-γ水平比較 與正常組比較，模型組豚鼠血清IgE、IL-4水平顯著升高(P<0.05)，IFN-γ水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各用藥組豚鼠血清IgE、IL-4水平顯著降低(P<0.05)，IFN-γ水平顯著升高(P<0.05)；蒼耳子水提取物各劑量組IgE、IL-4、IFN-γ水平多重比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。見表2。

4 討論

蒼耳子作為臨床治療鼻淵頭痛的常用藥，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗過敏、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用。在調(diào)節(jié)免疫功能方面，蒼耳子水煎液中琥珀酸被認為可能是蒼耳子調(diào)節(jié)免疫功能的活性成分之一[13]。王龍妹等[14]發(fā)現(xiàn)，蒼耳子水煎液對細胞免疫作用明顯。張芩等[15]發(fā)現(xiàn)，玉屏風散合蒼耳子散可調(diào)節(jié)機體免疫功能。

豚鼠具有易致敏的生物學(xué)特性，并且因血清中含有大量的補體，能產(chǎn)生穩(wěn)定的、高效價的特異性免疫球蛋白，常被選為AR的模型動物。因此，以O(shè)VA和氫氧化鋁的混懸液作為致敏劑，腹腔注射和滴鼻激發(fā)AR豚鼠模型。陣發(fā)性噴嚏、鼻癢、流涕等為AR患者的典型癥狀，滴鼻激發(fā)可使模型動物產(chǎn)生相同的過敏性癥狀，對過敏性癥狀進行評分可以初步判斷模型是否成功，是評價藥物治療AR療效的主要方法[11-12]。

Th1細胞主要介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答，通過釋放IFN-γ、IL-2等細胞因子來抑制Th2細胞活化；Th2細胞主要介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，通過產(chǎn)生IL-4、IL-5等細胞因子來抑制Th1細胞分化，當Th1細胞釋放的IFN-γ等細胞因子不足時，Th2細胞出現(xiàn)亢進現(xiàn)象，產(chǎn)生大量的IL-4，從而引起IgE過量[16-17]。因此，通過檢測豚鼠血清中IL-4和IFN-γ水平變化，可以評價蒼耳子水提取物對Th1/Th2細胞平衡的影響，同時檢測血清中IgE水平變化，可以反映AR豚鼠病理狀態(tài)的嚴重程度。

除IL-4外，Th2細胞還可以釋放其他細胞因子刺激肥大細胞釋放遞質(zhì)，從而引起鼻黏膜上皮組織病變，鼻黏膜上皮組織由柱狀纖毛細胞、柱狀細胞、杯狀細胞和基底細胞緊密相連于基底膜上形成上皮屏障。當接觸變應(yīng)原后，會出現(xiàn)基底膜病變，致使柱狀細胞脫落、炎癥細胞浸潤、小血管擴張等病變[18]。因此，通過HE染色觀察AR豚鼠鼻黏膜病理變化以評價蒼耳子水提取物對AR豚鼠鼻黏膜組織的影響。

表2 各組豚鼠血清IgE、IL-4、IFN-γ水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與氯雷他定組比較，△P<0.05；與玉屏風散組比較，◇P<0.05；與蒼耳子水提取物高劑量組比較，□P<0.05；與蒼耳子水提取物中劑量組比較，▲P<0.05

本研究結(jié)果表明，蒼耳子水提取物可以改善AR豚鼠的過敏性癥狀，減輕AR豚鼠鼻黏膜的病理改變，降低血清中IL-4水平，升高IFN-γ的水平，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞平衡，降低血清IgE水平，進而發(fā)揮其治療AR的作用。