崔 潔，王丹丹，王倩玉，陳彤垚，張福生*，秦雪梅*

1山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心；2山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院；3山西大學(xué)地產(chǎn)中藥功效物質(zhì)研究與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030006；4石家莊四藥有限公司，石家莊 050021

黃芪為傳統(tǒng)大宗中藥材之一，豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌之功效[1]，素有“十藥八芪”之稱(chēng)。黃芪為多基原植物，目前市場(chǎng)上的流通商品藥材主要為蒙古黃芪的栽培品，且栽培品主要來(lái)源于山西、甘肅、內(nèi)蒙古等地，其中，山西、內(nèi)蒙古主要為種子直播，多采取仿野生的生長(zhǎng)方式，而甘肅則為育苗移栽的生長(zhǎng)方式。目前，黃芪的栽培品存在以下幾個(gè)問(wèn)題：首先，黃芪的種子來(lái)源不一，人為過(guò)度干預(yù)造成種質(zhì)退化；其次，生長(zhǎng)方式不同使得黃芪的外觀(guān)性狀[2-4]與內(nèi)在化學(xué)成分含量發(fā)生了較明顯的變化[5-7]，而這些又可能會(huì)對(duì)臨床上的藥效強(qiáng)弱產(chǎn)生一定影響。因此，我們需要對(duì)黃芪的遺傳變異進(jìn)行分析，便于對(duì)黃芪的種質(zhì)進(jìn)行復(fù)壯，并對(duì)生長(zhǎng)方式進(jìn)行考察，以期達(dá)到規(guī)范栽培管理。本文以山西與內(nèi)蒙古的8批蒙古黃芪為例，優(yōu)化了蒙古黃芪ISSR反應(yīng)體系；同時(shí)對(duì)傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)的山西與內(nèi)蒙古產(chǎn)蒙古黃芪進(jìn)行了種質(zhì)遺傳多樣性與遺傳距離的分析，為黃芪種質(zhì)資源的保護(hù)及蒙古黃芪優(yōu)良品種的挖掘奠定基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增(inter-simple sequence repeat，ISSR)分子標(biāo)記是在1994年建立的一種分子標(biāo)記技術(shù)，可用于種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系、品種鑒定與品種選育等[8]，如Tang等[9]菊科的40份種質(zhì)進(jìn)行了ISSR遺傳多樣性研究；Wang等[10]運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記結(jié)合相關(guān)分析技術(shù)，設(shè)計(jì)了快速預(yù)測(cè)遠(yuǎn)志藥材樣品中tenuifoliside C含量高低的特異性引物；Yang等[11]根據(jù)psbA/trnH基因間區(qū)域的核酸序列與ISSR擴(kuò)增結(jié)果，設(shè)計(jì)了SCAR標(biāo)記的引物15F/15R，其可用于鑒別韓國(guó)黃芪以及從中國(guó)進(jìn)口的黃芪。

Zhang[12]優(yōu)化了影響黃芪ISSR體系的以下因素：DNA用量、dNTPs濃度、Taq酶用量、引物濃度。本實(shí)驗(yàn)不僅對(duì)以上因素進(jìn)行了優(yōu)化，還對(duì)激活Taq酶和影響退火溫度的Mg2+濃度，PCR擴(kuò)增的循環(huán)次數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)在此優(yōu)化的體系下，對(duì)8批蒙古黃芪進(jìn)行了遺傳多樣性分析。以期為蒙古黃芪種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持，促進(jìn)蒙古黃芪種質(zhì)保護(hù)及良種選育等工作的進(jìn)一步開(kāi)展。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

TC-XP-D基因擴(kuò)增儀(杭州博日科技有限公司)，DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠(chǎng))，ZF-258全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(上海嘉鵬科技有限公司)，TGL-16高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湘儀離心機(jī))，XW-80A旋渦混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)，NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)(Thermo公司)，移液器(Eppendorf)。

1.2 試劑

Biowest瓊脂糖、β-巰基乙醇均購(gòu)于太原灝洋生物科技有限公司；GoldView I型核酸染色劑，Solarbio公司；DL 2000 DNA Marker、6×Loading Buffer、PCR試劑盒，TaKaRa公司；CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒(貨號(hào)：DN14，50次)，北京艾德萊生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)所用到的引物根據(jù)大不列顛哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的100對(duì)ISSR引物序列進(jìn)行引物合成，由大連寶生物(TaKaRa)公司合成；三氯甲烷、異戊醇、無(wú)水乙醇、硼酸等試劑，國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 藥材樣本采集

本實(shí)驗(yàn)所用黃芪樣本，主要采集于山西省以及內(nèi)蒙古自治區(qū)，經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心的秦雪梅教授鑒定為蒙古黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao)，存放于山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心標(biāo)本室。詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 黃芪樣品信息表Table 1 Information of A.membranaceus sample source

續(xù)表1

編號(hào)No.采集地Collection place簡(jiǎn)稱(chēng)Abbreviation生長(zhǎng)方式Growth mode6山西省忻州市五寨縣丘陵坡地山西五寨丘陵坡地半野生7山西省忻州市五寨縣山西五寨栽培(平地移栽)8山西省大同市渾源縣官兒鄉(xiāng)木溝村麻黃溝山西渾源官兒鄉(xiāng)野生

2 方法

2.1 基因組DNA的提取與檢測(cè)

依據(jù)CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒的操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，提取所有黃芪樣本的DNA，并用1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的完整性，同時(shí)用NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度。

2.2 ISSR-PCR初始反應(yīng)條件及擴(kuò)增程序

參考相關(guān)文獻(xiàn)[12-17]，確定黃芪ISSR-PCR初始反應(yīng)條件為：總體積20 μL，包含10×PCR Buffer 2 μL、2.5 mmol/L MgCl2、0.4 mmol/L dNTPs、0.4 μmol/L引物、1.5 UTaqDNA聚合酶、DNA模板約20 ng，以ddH2O補(bǔ)齊體積至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃充分變性5 min，94 ℃變性45 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)后，最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液5 μL，加2 μL的6×Loading Buffer，在1.5 %瓊脂糖凝膠上電泳，電壓105 V，電泳30～40 min，在凝膠成像儀上觀(guān)察并照相記錄。

2.3 ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化設(shè)計(jì)

以2號(hào)黃芪的基因組DNA為模板，用ISSR-PCR初始反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序?qū)σ颱BC825進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果出現(xiàn)多態(tài)性條帶，但條帶不夠清晰，甚至出現(xiàn)拖尾及非特異性擴(kuò)增的條帶，因此，在此初始反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，依據(jù)①dNTP→②引物→③MgCl2→④Taq酶用量→⑤DNA用量→⑥退火溫度→⑦循環(huán)次數(shù)的順序?qū)τ绊扅S芪ISSR-PCR反應(yīng)的各個(gè)因素分別設(shè)置了不同水平的處理，具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下所示：(1)dNTPs：0.2、0.4、0.47、0.54、0.6 mmol/L；(2)引物：0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.6 μmol/L；(3)MgCl2：1.2、2.4、3.0、3.5、4.0 mmol/L；(4)Taq酶：1.0、1.5、2.0 U；(5)DNA：20、40、50、60、70、80 ng；(6)退火溫度：根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)確定該值，以該值為基礎(chǔ)上下浮動(dòng)6 ℃，確定出退火溫度的范圍，在PCR儀上進(jìn)行梯度退火篩選；(7)循環(huán)次數(shù)：25、28、30次。

2.4 ISSR-PCR引物的篩選

參照大不列顛哥倫比亞大學(xué)(University of British Columbia，UBC)所設(shè)計(jì)的ISSR引物序列，將8批樣品的DNA等質(zhì)量混合后進(jìn)行引物的篩選以及退火溫度的優(yōu)化，最終確定14條擴(kuò)增重復(fù)性好、條帶清晰的引物，用于全部樣本的擴(kuò)增。

2.5 8批黃芪樣品的遺傳一致度及遺傳距離分析

遺傳一致度(I)反映的是兩個(gè)樣品親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近程度，親緣關(guān)系越接近，種群在所有位點(diǎn)的等位基因就越多，遺傳一致度就越接近1，反之，遺傳一致度就越接近0。遺傳距離(D)反映的是兩個(gè)樣品的遺傳變異程度，遺傳變異越大，遺傳距離越接近1，反之，遺傳距離越接近0。當(dāng)I=1，D=0時(shí)，表示兩樣品的所有等位基因位點(diǎn)完全一致；當(dāng)I=0，D=∞時(shí)，表示兩樣品的等位基因位點(diǎn)完全不一致。本研究所采用的遺傳一致度I與遺傳距離D均由軟件POPGENE version 1.32采用Nei的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算方法而得。

3 結(jié)果與分析

3.1 ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的結(jié)果

3.1.1 dNTPs濃度的優(yōu)化結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)先對(duì)dNTPs設(shè)置了3個(gè)濃度，分別為0.2、0.4、0.6 mmol/L，見(jiàn)圖1A。dNTPs在低濃度(0.2 mmol/L)的情況下，擴(kuò)增產(chǎn)率低且條帶模糊；dNTPs濃度為0.4和0.6 mmol/L時(shí)條帶較清晰；所以在0.4-0.6 mmol/L之間設(shè)置了梯度進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)化，細(xì)化濃度分別為0.4、0.47、0.54、0.6 mmol/L，見(jiàn)圖1B。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0.54 mmol/L時(shí)條帶最為清晰，之后將其濃度設(shè)置為0.5 mmol/L時(shí)也能達(dá)到0.54 mmol/L相同的效果，本著節(jié)約的原則，所以dNTPs的濃度最終確定為0.5 mmol/L。

圖1 不同濃度dNTPs的ISSR-PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis of ISSR-PCR with different concentrations of dNTPs 注：1～3 dNTPs的濃度分別為0.2、0.4、0.6 mmol/L；4～7 dNTPs的濃度分別為0.4、0.47、0.54、0.6 mmol/L；M：DL 2000 DNA Marker。Note:The concentrations of 1-3 dNTPs were 0.2、0.4、0.6 mmol/L,respectively;the concentrations of 4-7 dNTPs were 0.4、 0.47、0.54、0.6 mmol/L,respectively.M：DL 2000 DNA marker.

3.1.2 引物濃度的篩選結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)對(duì)引物濃度先設(shè)置了3個(gè)梯度，分別為0.2、0.4、0.6 μmol/L，見(jiàn)圖2A。PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0.2、0.4 μmol/L時(shí)條帶差不多且清晰，高濃度(0.6 μmol/L)時(shí)條帶變模糊。所以在0.2、0.4 μmol/L之間設(shè)置了不同濃度進(jìn)行細(xì)化，細(xì)化濃度分別為0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 μmol/L，見(jiàn)圖2B。結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物濃度0.25 μmol/L時(shí)條帶清晰且擴(kuò)增穩(wěn)定。所以引物最終濃度為0.25 μmol/L。

圖2 引物(UBC825)不同濃度的ISSR-PCR電泳圖Fig.2 Electrophoresis of ISSR-PCR with different concentrations of primer UBC825 注：1～3 引物濃度分別為0.2、0.4、0.6 μmol/L；4～8 引物濃度分別為0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 μmol/L；M：DL 2000 DNA marker。Note:1-3 primer concentrations were 0.2、0.4、0.6 μmol/L;4-8 primer concentrations were 0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 μmol/L, respectively.M：DL 2000 DNA marker.

3.1.3 MgCl2濃度的優(yōu)化結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)對(duì)MgCl2設(shè)置了3個(gè)濃度，分別為1.2、2.4、3.6 mmol/L，見(jiàn)圖3A。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MgCl2濃度為低濃度(1.2 mmol/L)時(shí)PCR產(chǎn)物條帶少且模糊，當(dāng)濃度為2.4 mmol/L時(shí)條帶比1.2 mmol/L清晰；當(dāng)MgCl2濃度為3.6 mmol/L時(shí)PCR擴(kuò)增條帶多且較清晰。所以接下來(lái)在2.4-3.6 mmol/L之間分別設(shè)置了以下濃度：2.5、3.0、3.5、4.0 mmol/L，結(jié)果如圖3B。當(dāng)MgCl2濃度為高濃度(4.0 mmol/L)時(shí)，條帶變模糊；MgCl2濃度為2.5 mmol/L時(shí)條帶數(shù)少且不清晰；3.5 mmol/L時(shí)條帶清晰度比3.0 mmol/L時(shí)的好，所以選擇3.5 mmol/L作為MgCl2的終濃度。

圖3 不同MgCl2 濃度的ISSR-PCR 擴(kuò)增結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis map optimized for the concentration of different MgCl2 注：1～3 MgCl2濃度分別為1.2、2.4、3.6 mmol/L；4～7 MgCl2濃度分別為：2.5、3.0、3.5、4.0 mmol/L；M:DL 2000 DNA marker。Note:1-3 The concentrations of MgCl2 were 1.2、2.4、3.6 mmol/L,respectively;the concentrations of 4-7 MgCl2 were 2.5、3.0、3.5、4.0 mmol/L,respectively.M:DL 2000 DNA marker.

3.1.4Taq酶用量的優(yōu)化結(jié)果

在確定了dNTPs，引物，MgCl2濃度的情況下，對(duì)Taq酶量進(jìn)行了考察，設(shè)置濃度為1.0、1.5、2.0 U，結(jié)果如圖4所示，1.0、1.5、2.0 UTaq酶條帶相似，但出于經(jīng)濟(jì)考慮最終確定Taq酶量為1.0 U。

圖4 不同用量Taq酶的 ISSR-PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig.4 Electrophoresis of ISSR-PCR with different amounts of Taq polymerase 注：1～3 Taq酶用量分別為1.0、1.5、2.0 U；M：DL 2000 DNA marker。Note:1-3 Taq enzyme amounts were 1.0、1.5、2.0 U, respective-ly.M:DL 2000 DNA marker.

3.1.5 DNA模板量的優(yōu)化結(jié)果

DNA加入量分別為20、40、60 ng，如圖5A所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNA用量在20 ng是擴(kuò)增條帶模糊；當(dāng)DNA用量為40和60 ng時(shí)條帶較清晰，所以在40、60 ng附近進(jìn)行DNA細(xì)化，設(shè)置濃度為40、50、60、70、80 ng，結(jié)果如圖5B。在20 μL體系中，50～80 ng擴(kuò)增出的條帶最為清晰，基于相同條件下模板量少原則，最終選擇DNA模板量為50 ng。

圖5 不同用量DNA模板的ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Electrophoresis of ISSR-PCR with different amounts of DNA template 注：1～3 DNA模板用量分別為20、40、60 ng；4～8 DNA模板用量分別為40、50、60、70、80 ng；M：DL 2000 DNA marker。Note:1-3 DNA template amounts is 20、40、60 ng;4-8 DNA template amounts is 40、50、60、70、80 ng.M:DL 2000 DNA marker.

3.1.6 ISSR-PCR退火溫度的篩選結(jié)果

以引物UBC825進(jìn)行梯度退火溫度篩選為例，其Tm=4(G+C)+2(A+T)，為50 ℃，設(shè)置中心溫度為51 ℃，梯度寬度為6 ℃，選擇47.6、50.5、53.2、55.8 ℃進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖6。由圖6可知，引物UBC825在47.6和50.5 ℃擴(kuò)增條帶模糊，53.2 ℃擴(kuò)增條帶清晰，55.8 ℃條帶變模糊，所以UBC825退火溫度最終選擇53.2 ℃。

圖6 UBC825引物不同退火溫度下的ISSR-PCR電泳圖Fig.6 Electrophoresis of ISSR-PCR with different concentrations of Primer UBC825 注：1～4退火溫度分別為47.6、50.5、53.2、55.8 ℃；M：DL 2000 DNA marker。Note:1-4 Annealing temperatures are 47.6、50.5、 53.2、55.8 °C.M:DL 2000 DNA marker.

3.1.7 ISSR-PCR循環(huán)次數(shù)的篩選結(jié)果

如圖7所示，本實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行了25、28、30次的PCR擴(kuò)增，結(jié)果循環(huán)次數(shù)為25次時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶模糊，28次，30次循環(huán)時(shí)，產(chǎn)物條帶基本相同，為節(jié)約時(shí)間，最終循環(huán)次數(shù)選擇28次。

圖7 不同循環(huán)次數(shù)下的ISSR-PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.7 Electrophoresis of ISSR-PCR with different cycles 注：1～3 ISSR-PCR循環(huán)次數(shù)分別為25、28、30次；M：DL 2000 DNA marker。Note:1-3 ISSR-PCR cycle times are 25、28、30 times； M:DL 2000 DNA marker.

最終確定反應(yīng)體系為：總體積20 μL，包含10×PCR Buffer 2 μL、0.5 mmol/L dNTPs、1.0 UTaq酶、3.5 mmol/L MgCl2、0.25 μmol/L引物、50 ng DNA，加ddH2O水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃充分變性5 min，94 ℃變性45 s，53 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，28個(gè)循環(huán)后，最后72 ℃延伸7 min。

3.2 優(yōu)化體系對(duì)樣本的擴(kuò)增結(jié)果

運(yùn)用優(yōu)化好的體系對(duì)8批蒙古黃芪樣本進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，圖8為部分引物在優(yōu)化好的體系下的擴(kuò)增結(jié)果。由此可以看出本實(shí)驗(yàn)建立的黃芪ISSR-PCR體系穩(wěn)定，可靠。

圖8 部分引物的ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果圖Fig.8 ISSR-PCR amplification results of some primers

圖9 引物UBC825對(duì)8批蒙古黃芪ISSR-RCR擴(kuò)增結(jié)果圖Fig.9 Amplification results of primers UBC825 on 8 batches of A.membranaceus ISSR-RCR

3.3 引物篩選擴(kuò)增結(jié)果

將瓊脂糖凝膠電泳圖導(dǎo)入ZF-258全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)，對(duì)其進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，記錄擴(kuò)增條帶的多態(tài)性。根據(jù)DNA條帶的有無(wú)進(jìn)行區(qū)分標(biāo)記，對(duì)條帶清晰的記為“1”，對(duì)缺失或模糊不清的標(biāo)記為“0”，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)得到01矩陣。將統(tǒng)計(jì)結(jié)果01矩陣按照POPGENE 1.32 軟件的格式要求修改，導(dǎo)入數(shù)據(jù)，進(jìn)行多態(tài)性條帶百分率計(jì)算，以及遺傳一致性與遺傳距離分析。結(jié)果如表2。篩選的14條引物對(duì)8批蒙古黃芪樣本進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出126條帶，其中多態(tài)性條數(shù)118條，多態(tài)性位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)為93.65%，平均每個(gè)引物擴(kuò)出8.43個(gè)DNA片段，其多態(tài)性為93.6%，說(shuō)明黃芪遺傳多樣性豐富。

3.4 遺傳相似系數(shù)與聚類(lèi)結(jié)果分析

分別用14條引物對(duì)8批蒙古黃芪樣本進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果用軟件POPGENE version 1.32采用Nei的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算方法(Nei，1978)計(jì)算遺傳一致度I與遺傳距離D，所得結(jié)果見(jiàn)表3。遺傳一致度I與遺傳距離D均是對(duì)樣品間遺傳分化程度的描述。由表3可以看出，8批黃芪樣品的遺傳一致度在0.492 1～0.730 2之間，遺傳距離在0.314 5～0.709 1之間，說(shuō)明黃芪樣品的遺傳分化程度較大。其中，2號(hào)內(nèi)蒙古南洼村與6號(hào)山西五寨丘陵坡地樣品的親緣關(guān)系最近，遺傳一致度為0.730 2，遺傳距離為0.314 5；1號(hào)內(nèi)蒙古興和縣與4號(hào)山西渾源樣品的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳一致度均為0.492 1，遺傳距離均為0.709 1。山西不同產(chǎn)地的遺傳距離變幅為0.347 6～0.559 6，差異比較明顯。

表2 黃芪ISSR擴(kuò)增反應(yīng)的引物及擴(kuò)增的條帶數(shù)Table 2 Primers and amplified bands of ISSR amplification reaction

注：B=(T，C，G)； H=(A，T，C)； R=(A，G)； Y=(C，T)； V=(A，C，T)；D=(A，G，T)。

表3 8批黃芪樣品的遺傳一致度與遺傳距離Table 3 Genetic consistency and genetic distance of 8 samples of A.membranaceus

3.5 8批蒙古黃芪樣品的多態(tài)性條帶聚類(lèi)分析

利用NTSYS-pc 2.1軟件，通過(guò)非加權(quán)類(lèi)平均法(unweighted pair-group method arithmetic averages，UPGMA)，對(duì)8批蒙古黃芪樣品的多態(tài)性條帶進(jìn)行聚類(lèi)分析，并構(gòu)建樹(shù)狀聚類(lèi)圖(見(jiàn)圖10)。由圖可知，當(dāng)匹配系數(shù)為0.50時(shí)，黃芪樣品明顯分為三類(lèi)。其中，1號(hào)內(nèi)蒙古興和縣跟8號(hào)山西渾源官兒鄉(xiāng)樣品分別單獨(dú)聚為一類(lèi)，2號(hào)內(nèi)蒙古南洼村、6號(hào)山西五寨丘陵坡地、3號(hào)、4號(hào)山西渾源、5號(hào)山西五寨蘆芽山、7號(hào)山西五寨聚為一類(lèi)。2號(hào)內(nèi)蒙古南洼村與6號(hào)山西五寨丘陵坡地樣品間的遺傳距離最近，二者親緣關(guān)系最近。而1號(hào)內(nèi)蒙古興和縣與8號(hào)山西渾源官兒鄉(xiāng)的距離最遠(yuǎn)，說(shuō)明二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，UPGMA聚類(lèi)結(jié)果與遺傳一致度與遺傳距離的分析結(jié)果(表3)基本是一致的。

圖10 8批蒙古黃芪樣品的UPGMA聚類(lèi)圖Fig.10 UPGMA clustering map of 8 samples of A.membranaceus

4 討論

本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)影響蒙古黃芪的ISSR反應(yīng)體系的因素進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)山西與內(nèi)蒙古2個(gè)產(chǎn)地蒙古黃芪的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。而目前，植物基因多態(tài)性的研究多采用DNA分子標(biāo)記，DNA間的差異可以通過(guò)分子標(biāo)記呈現(xiàn)。DNA分子標(biāo)記技術(shù)有多種，其中ISSR技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、多態(tài)性和重復(fù)性好等特點(diǎn)，但是ISSR反應(yīng)受到PCR反應(yīng)中各因素的影響，不同的樣本需要建立不同的ISSR反應(yīng)體系[18]。因此，本研究對(duì)影響ISSR-PCR反應(yīng)的dNTPs、引物、MgCl2、Taq酶、DNA、退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化。其中dNTPs、MgCl2、Taq酶、引物濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增影響較大，另外，退火溫度會(huì)影響模板與引物的結(jié)合，退火溫度低容易發(fā)生錯(cuò)配，所以適當(dāng)提高退火溫度會(huì)降低錯(cuò)配率，但太高又會(huì)影響復(fù)性，所以選擇合適的退火溫度是必要的。

通過(guò)對(duì)蒙古黃芪的聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，雖然1號(hào)和2號(hào)蒙古黃芪樣本均來(lái)自?xún)?nèi)蒙古興和縣，且二者地理位置較近，但在聚類(lèi)圖上卻分為了2大類(lèi)，這可能與它們生長(zhǎng)的小環(huán)境有較大差異有關(guān)，使得它們逐漸適應(yīng)了當(dāng)?shù)氐臍鉁?、海拔高度、降水等，這與Wang等[19]對(duì)長(zhǎng)白山地區(qū)安圖與和龍的聚類(lèi)分析是相似的。2號(hào)內(nèi)蒙古南洼村與山西產(chǎn)地的3-7號(hào)蒙古黃芪樣本雖然地理位置較遠(yuǎn)，但是聚為了一類(lèi)，可能是產(chǎn)地之間相互引種造成了基因交流，使得遺傳背景一致，這與Zhang[20]對(duì)不同產(chǎn)地蒙古黃芪聚類(lèi)分析一致。聚類(lèi)分析中2號(hào)內(nèi)蒙古南洼村野生品、6號(hào)山西五寨丘陵地半野生品與4號(hào)山西渾源野生品先聚在了一起，而后與山西其他產(chǎn)地栽培品聚為一類(lèi)，這說(shuō)明栽培品與野生品之間存在較高的遺傳相似度，體現(xiàn)出它們親緣關(guān)系更為接近，這可能與它們生長(zhǎng)氣候、降水、光照等有關(guān)，這與Zhang[12]對(duì)6個(gè)蒙古黃芪居群的聚類(lèi)結(jié)果“先以生存方式野生、栽培聚類(lèi)”分析一致；如果后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)軐?duì)不同生長(zhǎng)方式蒙古黃芪的化學(xué)成分含量進(jìn)行分析和生長(zhǎng)物候條件對(duì)蒙古黃芪的影響，以及建立化學(xué)成分與分子標(biāo)記間的聯(lián)系，這將對(duì)蒙古黃芪種植資源的挖掘與保護(hù)提供幫助。

本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)山西與內(nèi)蒙古的8批蒙古黃芪進(jìn)行了遺傳多樣性分析，后續(xù)會(huì)采用本實(shí)驗(yàn)建立的ISSR-PCR體系對(duì)大規(guī)模不同產(chǎn)地蒙古黃芪進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，收集更多數(shù)據(jù)，同時(shí)結(jié)合樣本表型數(shù)據(jù)對(duì)蒙古黃芪進(jìn)行種質(zhì)評(píng)價(jià)；其次，對(duì)本次收集樣本進(jìn)行化學(xué)成分含量測(cè)定，將此次的PCR結(jié)果與黃芪化學(xué)成分含量建立聯(lián)系，為蒙古黃芪的種質(zhì)復(fù)壯及挖掘品種潛力提供幫助。