鮑永毅，陳 曉，牛明福，李夢圓，付應(yīng)建，劉瑞文，鄭少亭

1河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，洛陽 471023；2國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，洛陽 471003

內(nèi)生菌(endophyte)是指生活在健康的植物組織或細(xì)胞內(nèi)且不會引起宿主植物明顯感染癥狀的一類微生物群[1]。植物內(nèi)生菌與宿主植物長期共存[2]，不會改變植物的表型特征和功能，可形成穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)[3]。內(nèi)生菌具有數(shù)量眾多、種群結(jié)構(gòu)多樣的特點，是潛力巨大的微生物新資源[4]，還可產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性成分[5]。內(nèi)生菌的研究對于保護(hù)野生與瀕危藥用植物、拓展藥用資源、新藥研發(fā)等均有重要意義。茵陳(Artemisiacapillaris)，也被稱為因塵、綿茵陳、白蒿等，其地上部分是傳統(tǒng)中藥[6]，具清熱利濕、利膽退黃之功效，為治黃疸要藥，且可預(yù)防流感，治中暑、感冒、水腫等癥。植物茵陳中含有多種化學(xué)成分，包括香豆素類、黃酮類、色原酮類、有機酸類、烯炔類、三萜類、甾體類和醛酮類等[7]。茵陳多為野生，其采收較麻煩且受季節(jié)限制，研究茵陳內(nèi)生菌并研究其活性產(chǎn)物與茵陳成分的相關(guān)性，對于拓展茵陳藥用范圍和新藥發(fā)現(xiàn)具有重要意義[8]。對一些內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中的一種或幾種成分具有抗菌作用(含細(xì)菌與真菌)，有研究表明， 80%的植物內(nèi)生真菌在抗真菌、抗藻類或抗雜草方面具有活性，而來自土壤的真菌中只有大約43%具有活性[9]。近些年來，已從各種中草藥中分離到了大量的內(nèi)生菌，但茵陳內(nèi)生菌的研究較少，且內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定還未見有報道。本研究為了解茵陳內(nèi)生細(xì)菌的組成和種類，并從中篩選產(chǎn)茵陳相同或相似抑菌活性物質(zhì)的內(nèi)生菌，為利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)藥物提供資源。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

1.1.1 實驗材料

新鮮完整植株茵陳采摘于河南省洛陽市南郊外龍門山，經(jīng)河南科技大學(xué)林學(xué)院許曉利老師鑒定。

1.1.2 培養(yǎng)基

因不同內(nèi)生細(xì)菌對營養(yǎng)的要求各異，本試驗選用以下7種培養(yǎng)基進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離，LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，瓊脂20，pH7.0。KMB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，無水氯化鎂1.4，無水硫酸鉀10，瓊脂15，甘油10，pH7.2。PDA培養(yǎng)基(g/L)：土豆 200，葡萄糖 20，瓊脂20，自然pH值。營養(yǎng)瓊脂(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂20，pH7.2。YPD培養(yǎng)基(g/L):酵母膏10，蛋白胨20，葡萄糖20，瓊脂20，pH7.2。TSA培養(yǎng)基(g/L)：酪蛋白胰酶消化物15，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5，NaCl 5，瓊脂20， pH7.2。BPA培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨5，葡萄糖 10，酵母粉1，瓊脂20，pH7.2。純化及菌種的保藏仍使用相應(yīng)的分離培養(yǎng)基。

1.1.3 測試菌

腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和產(chǎn)腸毒大腸埃希氏菌(enterotoxigenicEscherichiacoli)為本實驗室保存。

1.2 內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化

將采集到的茵陳根莖葉流水沖洗后，先于75%乙醇溶液中浸泡3 min，無菌水沖洗3次，然后在0.1% HgCl2溶液中漂洗3 min，無菌水沖洗4次。茵陳樣品置于無菌研缽中，加入適量無菌水研磨至漿狀，梯度稀釋，分別涂布于上述7種固體培養(yǎng)基上，最后一次沖洗后的無菌水也涂布平板作為對照，37 ℃培養(yǎng)3～4天，無菌水對照應(yīng)無菌長出，挑選梯度稀釋的平板上的不同單菌落平板劃線純化。

1.3 菌落觀察與鏡檢

觀察各種培養(yǎng)基分離到的菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

采用細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)提取純化菌株的基因組DNA。以16S rDNA通用引物27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和1492R：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′進(jìn)行PCR擴增，擴增體系(50 μL)為：2×Taq PCR Mix 25 μL，去離子水19 μL，引物27F 2 μL，引物1492R 2 μL，基因組DNA模版2 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工生物工程有限公司測序，序列結(jié)果提交GenBank，使用DNAStar中的Megalign進(jìn)行同源性分析，通過BLAST程序在GenBank上進(jìn)行相似性序列檢索分析，并利用DNAStar7.1軟件的MegAlign程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液的抑菌活性測定

將52株內(nèi)生細(xì)菌分別接種于不同培養(yǎng)基中，37 ℃搖床震蕩培養(yǎng)72 h，離心收集上清液，96孔板法測定對S.enteritidis、S.aureus和enterotoxigenicE.coli的抑菌活性，具體方法如下：在96孔板中分別加入發(fā)酵上清液100 μL，用PBS倍比稀釋三個梯度，每個梯度三個重復(fù)，然后每孔中加入活化的測試菌(106個/mL)各100 μL，同時用恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR)做陽性對照，培養(yǎng)基做陰性對照，37 ℃培養(yǎng)12 h，酶標(biāo)儀測定OD600。抑制率計算公式為(OD陰性對照-OD陽性對照或樣品)/OD陰性對照×100%，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：抑制率為75～100%判定為“++++”， 抑制率為50%～75%判定為“+++”， 抑制率為25%～50%判定為“++”， 抑制率為0～25%判定為“+”。

1.6 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液的成分初步分析

參照中藥茵陳的化學(xué)成分，分別以沒食子酸、蘆丁、咖啡酸和齊墩果酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，利用分光光度法測定抑菌活性較強的菌株發(fā)酵液成分，具體測定方法參照文獻(xiàn)[10-13]。

1.7 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液的成分初步測定

1.7.1 發(fā)酵液上清處理

發(fā)酵液上清處理方法參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行，具體方法如下：用無菌吸管吸取10 mL的發(fā)酵液12 000 rpm離心10 min，收集上清液。取上清液1 mL與9 mL色譜純甲醇混勻沉淀24 h，再12 000 rpm離心10 min，上清液0.22 μm濾膜過濾作為高效液相色譜的測試液。

1.7.2 HPLC 色譜條件及檢測方法

準(zhǔn)確稱取沒食子酸、蘆丁、咖啡酸和齊墩果酸各種標(biāo)品5 mg 置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，用抽濾器和微孔濾膜過濾，作為標(biāo)準(zhǔn)品母液。然后各取0.1 mL 標(biāo)準(zhǔn)品母液混合均勻后加入2.2 mL 甲醇配成20 g/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax ODS-C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)；流速為1.0 mL /min;柱溫為室溫(30 ℃) ；進(jìn)樣量10 μL。流動相和檢測波長分別為：沒食子酸流動相甲醇∶0.1%磷酸=10∶90；檢測波長為280 nm。蘆丁流動相甲醇∶0.1%磷酸=85∶15；檢測波長為390 nm?？Х人崃鲃酉嗉状肌?.1%磷酸=20∶80；檢測波長為323 nm。齊墩果酸流動相甲醇∶0.1%磷酸=85∶15；檢測波長為210 nm。

圖1 9種茵陳內(nèi)生細(xì)菌的鏡檢形態(tài)圖(1 000×)Fig.1 Microscopic morphology of nine endophytic bacterial strains of Artemisia capillaris(1 000×) 注： A 枯草芽孢桿菌(NA-1)；B 簡單芽孢桿菌(NA-5)；C 短小芽孢桿菌(NA-6)；D蠟樣芽孢桿菌(LB-8)；E 巨大芽孢桿菌(TSA-18)；F 病研所芽孢桿菌(LB-11)；G 地衣芽孢桿菌(BPA-29)；H 屎腸球菌(LB-13)；I 醋酸鈣不動桿菌(KMB-32)。Note:A B.subtilis (NA-1);B B.simplex (NA-5);C B.pumilus (NA-6);D B.cereus (LB-8);E B.megaterium (TSA-18);F B.idriensis (LB-11);G B.licheniformis (BPA-29);H Enterococ- cus faecium (LB-13);I Acinetobacter calcoaceticus (KMB-32).

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌的分離純化

對初步分離到的細(xì)菌進(jìn)行劃線分離純化，經(jīng)菌落形態(tài)和鏡檢觀察后，共獲得85株內(nèi)生菌，其中從NA培養(yǎng)基中篩選到10株菌；從LB培養(yǎng)基中篩選到25株菌；從TSA培養(yǎng)基中篩選到5株菌；從BPA培養(yǎng)基中篩選到19株菌，從KMB培養(yǎng)基中篩選到16株菌；從YPM培養(yǎng)基中篩選到6株菌；從PDA培養(yǎng)基中篩選到4株菌。

對上述85株菌又進(jìn)行多次分離純化并進(jìn)行鏡檢分類，最終確定得到52株內(nèi)生細(xì)菌。其中NA培養(yǎng)基6株，LB培養(yǎng)基17株，TSA培養(yǎng)基6株，BPA培養(yǎng)基8株，KMB培養(yǎng)基8株，YPM培養(yǎng)基5株， PDA培養(yǎng)基2株，對這52株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行編號處理并進(jìn)行下一步的鑒定。

2.2 菌體形態(tài)觀察

52株內(nèi)生細(xì)菌革蘭氏染色觀察有51株為陽性菌，多為桿狀，只有LB13為球形；另1株KMB32革蘭氏染色為陰性，為長細(xì)桿狀，具體形態(tài)見圖1。

2.3 同源性分析

內(nèi)生細(xì)菌的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均在約1 500 bp處出現(xiàn)條帶，部分PCR條帶見圖2。

圖2 內(nèi)生細(xì)菌PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR amplification from the endophytic bacteria 注：M：DL2 000 DNA 分子量 ；1～10：茵陳內(nèi)生細(xì)菌菌株(部分)16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物。Note:M:DL2 000 DNA Marker;1～10:PCR amplification of 16S rDNA from the endophytic bacteria (partly).

將52株菌的16S rDNA序列上傳NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號見表2。根據(jù)16S rDNA 分類標(biāo)準(zhǔn)，對52株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行同源性分析，可分為6組，同源率在99%以上的有4組，同源率在95%～99%之間的有1組，同源性在95%以下的有1組，結(jié)果見表1。

表1 分離菌株序列分析統(tǒng)計結(jié)果Table 1 Results of sequence analysis of isolated strains

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)同源性分析結(jié)果，在同源率99%以上的4組分離菌中各選幾株代表(7株：NA-1、NA-2、KMB-31、KMB-34、LB-7、BPA-22和TSA-20)，同源率99%以下的分離菌(8株：LB-3、KMB-32、BPA-29、NA-5、LB-11、LB-12、LB-13、LB-16)與GenBank公布的序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。NA-1、NA-2、KMB-31和KMB-34與枯草芽孢桿菌親緣關(guān)系較近；LB-16、 BPA-29、LB-12和LB-3與地衣芽孢桿菌親緣關(guān)系較近；TSA-20與短小芽孢桿菌親緣關(guān)系較近；LB-11與病研所芽孢桿菌親緣關(guān)系較近；LB-2、LB-1和BPA-22與蠟狀芽孢桿菌親緣關(guān)系較近；LB-7與巨大芽孢桿菌親緣關(guān)系較近；NA-5與簡單芽孢桿菌親緣關(guān)系較近；LB-13與屎腸球菌親緣關(guān)系較近；KMB-32與醋酸鈣不動桿菌親緣關(guān)系較近。

NCBI BLAST比對分析結(jié)果表明LB-13為屎腸球菌，KMB-32為醋酸鈣不動桿菌，其他50株菌為芽孢桿菌，與2.2的革蘭氏染色鏡檢結(jié)果相吻合，結(jié)果見表2。

圖3 茵陳內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建Fig.3 Phylogenetic tree construction of Artemisia capillaris endophytic bacteria

2.5 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液抑菌活性測定結(jié)果

52株內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液對3種指示菌的抑菌結(jié)果見表3，其中17株菌對這3種指示菌均有不同程度的抑菌效果，另35株菌對3種指示菌未檢測到抑菌活性。

表2 從茵陳中分離的52株內(nèi)生細(xì)菌菌株編號、GenBank登錄號及菌株分類Table 2 The strain numbers,GenBank numbers and classification of the 52 endophytic bacteria strains isolated from Artemisia capillaris

續(xù)表2(Continued Tab.2)

菌株編號No.GenBank登錄號GenBank acession No. 菌株名稱Strain nameBPA-28MH187618枯草芽孢桿菌B.subtilisBPA-29MH187617地衣芽孢桿菌B.licheniformisKMB-30MH187616枯草芽孢桿菌B.subtilisKMB-31MH187615枯草芽孢桿菌B.subtilisKMB-32MH187651醋酸鈣不動桿菌Acinetobacter calcoaceticusKMB-33MH187650枯草芽孢桿菌B.subtilisKMB-34MH187614枯草芽孢桿菌B.subtilisKMB-35MH187613枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisKMB-36MH187612枯草芽孢桿菌B.subtilisKMB-37MH187611枯草芽孢桿菌B.subtilisYPM-40MH187608枯草芽孢桿菌B.subtilisYPM-41MH187607巨大芽孢桿菌B.megateriumYPM-42MH187606枯草芽孢桿菌B.subtilisYPM-43MH187605枯草芽孢桿菌B.subtilisYPM-44MH187604枯草芽孢桿菌B.subtilisPDA-48MH187640巨大芽孢桿菌B.megateriumPDA-49MH187639枯草芽孢桿菌B.subtilis

表3 17株內(nèi)生細(xì)菌對3種指示菌的抑菌效果Table 3 The antibacterial activity of the 17 strains of endophytic bacteria against the 3 indicator bacteria

2.6 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液的成分初步測定

對抑菌活性為“+++”的菌株NA-3、BPA-24和KMB-32發(fā)酵液進(jìn)行分光光度法測定，結(jié)果見表4、表5。

表4 4 個化合物標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程及線性范圍(n=3)Table 4 4 Linear regression equations with linear ranges for 4 compounds (n=3)

表5 三個菌株發(fā)酵液中化合物含量Table 5 Compound contents in the fermented liquid of three strains

2.7 HPLC 色譜結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸、蘆丁、咖啡酸和齊墩果酸的出峰時間分別在8.406、5.794、26.724和23.084 min，相同條件下，3個菌株的發(fā)酵液在沒食子酸、蘆丁和咖啡酸相應(yīng)的出峰時間均未出現(xiàn)相應(yīng)的峰，齊墩果酸相同時間點有峰出現(xiàn)，色譜圖見圖4，從出峰時間可以推測3個菌株發(fā)酵液中可能含有齊墩果酸。

3 討論

藥用植物是篩選天然藥用成分的主要原料之一，但從藥用植物中直接提取獲得藥用成分的工藝復(fù)雜，含量低，且藥用植物易受地理環(huán)境及時令的限制[15]。通過培養(yǎng)藥用植物內(nèi)生菌來生產(chǎn)藥用活性成分不僅可以突破植物生長周期長、產(chǎn)量低、不可再生等限制，同時也可以為內(nèi)生菌大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)藥用活性物質(zhì)開辟新途徑[16]。

茵陳素有“二月茵陳，五月蒿”的說法，茵陳一年只有春季和秋季兩個采收期，種植周期長，采摘麻煩，分離茵陳內(nèi)生菌進(jìn)行茵陳藥用成分的發(fā)酵生產(chǎn)不失為一種理想方法，而查閱文獻(xiàn)僅見左飛[17]進(jìn)行了茵陳放線菌的分離與抗楊樹褐斑病的活性研究，其他未見有相關(guān)報道。本研究對茵陳內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離純化，最終得到52株內(nèi)生細(xì)菌，有50株為不同種類的芽孢桿菌，1株醋酸鈣不動桿菌，1株屎腸球菌，可以看出茵陳內(nèi)生細(xì)菌中芽孢桿菌為優(yōu)勢菌，這與從其他藥用植物中分離出的內(nèi)生細(xì)菌多為芽孢桿菌是一致的[18-20]。但本實驗初步分離純化的85株內(nèi)生細(xì)菌中革蘭氏陰性菌有18株，革蘭氏陽性菌有67株，最終分離純化后僅剩下了1株革蘭氏陰性菌，考慮與分離純化過程中人為操作有關(guān)，也有文獻(xiàn)報道[21]有些內(nèi)生菌不適合體外多次傳代培養(yǎng)，推測在純化過程中丟失。

圖4 齊墩果酸的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC Chromatogram of oleanolic acid 注：A :齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品；B、C和D分別為菌株NA-3，BPA-24和KMB-32發(fā)酵液上清。Note:A:standard of Gallate;B，C and D are fermentation liquid supernatants of strains NA-3,BPA-24 and KMB- 32,respectively.

Chen等[22]報道植物內(nèi)生細(xì)菌中未培養(yǎng)微生物占很大比例，培養(yǎng)方法分析的細(xì)菌僅限于那些能夠在人工培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌，一些適合于分離培養(yǎng)基營養(yǎng)條件的菌株在分離過程中大量富集，而不適合于分離培養(yǎng)基營養(yǎng)條件的菌株在分離過程中逐漸衰退。許多研究已經(jīng)證實，通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法鑒定的微生物僅占環(huán)境微生物總數(shù)的0.1%～10%[23]，應(yīng)用高通量測序技術(shù)能更準(zhǔn)確反映植物內(nèi)生微生物的種類組成和真實比例，但微生物發(fā)酵生產(chǎn)活性物質(zhì)需要可持續(xù)培養(yǎng)的微生物，所以傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法仍是內(nèi)生菌分離的主要方法。

本研究對分離培養(yǎng)的內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液進(jìn)行初步抑菌活性測定，篩選到17株能產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的內(nèi)生細(xì)菌，為下一步內(nèi)生菌產(chǎn)生活性物質(zhì)的研究奠定了基礎(chǔ)。其中對抑菌活性較強的三個菌株發(fā)酵，發(fā)酵液進(jìn)行分光光度法和高效液相色譜分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中含有齊墩果酸，且菌株NA-3和KMB-32發(fā)酵液中齊墩果酸含量較高，為直接發(fā)酵生產(chǎn)齊墩果酸提供了素材。雖然分光光度法測定發(fā)酵液中含有酚類和黃酮類，但液相色譜未測到?jīng)]食子酸和蘆丁，推測可能是發(fā)酵液中含有其他的酚類和黃酮類物質(zhì)，下一步將進(jìn)一步對發(fā)酵液進(jìn)行分離分析，確定發(fā)酵液中的成分及發(fā)揮抑菌活性的具體成分。