王 成，代旭陽(yáng)，龔莉虹，余琳媛，胡乃華，李蕓霞

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 教育部中藥材標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都611137

近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，高脂血癥(hyperlipidemia,HLP)已逐漸成為危害人類(lèi)健康的“第一殺手”。在古代，雖沒(méi)有對(duì)“HLP”的明確記載，但早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中已有關(guān)于“脂”的描述，如“脂者”、“脂膜”、“油脂”等，甚至還用“膏人”、“肥人”等詞來(lái)形容血脂過(guò)高的人[1]。古代中醫(yī)認(rèn)為，HLP是臟腑的運(yùn)輸、疏泄、宣發(fā)等生理功能失調(diào)而引起的，致使體內(nèi)津液集聚，痰濕化生，流注經(jīng)脈，滲入血中[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，HLP是由于血液中血膽固醇(total cholesterol,TC)和/或甘油三酯(triglyceride,TG)水平異常升高而引起的一種的脂質(zhì)代謝紊亂[3]，主要分為高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥和混合性高脂血癥[4]。目前對(duì)于HLP的治療首選他汀類(lèi)藥物，但隨著長(zhǎng)時(shí)間的服用，其以轉(zhuǎn)氨酶升高為特征的肝損害和以肌酸激酶升高為特征的橫紋機(jī)溶解等副作用也逐漸凸顯出來(lái)。然而，一些天然產(chǎn)物，特別是我國(guó)具有高效低毒的傳統(tǒng)降脂中藥，因具有多靶點(diǎn)、多途徑和多環(huán)節(jié)的作用而受到了格外的關(guān)注。因此，本研究將探討其毒副作用很小的大黃素對(duì)脂質(zhì)代謝紊亂的改善作用。

大黃素(1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone,emodin)是一種天然的橙黃色長(zhǎng)針狀結(jié)晶的游離蒽醌衍生物，廣泛存在于何首烏、大黃、虎杖、蘆薈等中藥材中。目前，大黃素已被證明具有廣泛的藥理作用，如抗炎[5]、抗癌[6]、抗菌、保肝、抗糖尿病、抗骨質(zhì)疏松、抗血小板聚集以及神經(jīng)保護(hù)[7]等作用。近年來(lái)，隨著人們對(duì)大黃素的深入研究，越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道，大黃素還具有降脂、抗氧化應(yīng)激和抗AS等作用，并且大量研究已經(jīng)證實(shí)大黃素可作為治療HLP和AS的有效物質(zhì)基礎(chǔ)。Fan等[8]通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)金黃地鼠來(lái)研究大黃素對(duì)脂質(zhì)代謝紊亂的作用。結(jié)果表明，給予大黃素治療28天后，血中TC、TG、LDL-c水平顯著降低，通過(guò)繪制脂蛋白譜和核磁共振代謝組學(xué)研究，成功發(fā)現(xiàn)大黃素可調(diào)節(jié)血清脂蛋白亞型的分布、調(diào)節(jié)高密度脂蛋白脂質(zhì)運(yùn)載能力和改善血漿內(nèi)源性分子的代謝輪廓，提示大黃素具有改善高脂血癥金黃地鼠的脂代謝紊亂的作用。

圖2 喂養(yǎng)方案的實(shí)驗(yàn)大綱Fig.2 Experimental outline of the feeding protocol.

HLP的預(yù)防和治療已成為亟待解決的難題之一，而對(duì)于研發(fā)高效低毒的降脂中藥是需要一個(gè)合適的模型來(lái)進(jìn)行研究。目前國(guó)內(nèi)外常用于研究與脂質(zhì)代謝相關(guān)的動(dòng)物主要有大鼠、小鼠、家兔、豚鼠和金黃地鼠等[9]，但近年來(lái)，隨著一種新型模式生物—斑馬魚(yú)的興起，用它作為藥物篩選的模型被人們廣為接受。斑馬魚(yú)是一種原產(chǎn)于南亞地區(qū)的熱帶硬骨魚(yú)，因其基因組序列與人類(lèi)有著87%的高度相似性[10]，體積小，胚胎透明，易于大規(guī)模飼養(yǎng)，繁殖能力強(qiáng)和實(shí)驗(yàn)周期短，被廣泛作為高通量篩選藥物的經(jīng)典模型[11]。又因其血脂構(gòu)成、脂質(zhì)吸收、脂質(zhì)代謝、器官和組織與人類(lèi)基本一致，近年來(lái)被大量應(yīng)用在與脂質(zhì)代謝和脂質(zhì)異常相關(guān)的疾病研究中，如HLP、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)、脂肪肝(fatty liver disease,FLD)、糖尿病(diabetes mellitus,DM)等，是研究單體中藥降血脂作用的理想模式生物[12]。根據(jù)課題組前期對(duì)大黃素最大耐受濃度(maximum tolerated concentration,MTC)的摸索[13]，發(fā)現(xiàn)大黃素在斑馬魚(yú)幼魚(yú)上的MTC為0.73 μg/mL，隨后以0.1 μg/mL的等梯度濃度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大黃素濃度在0.1～0.5 μg/mL對(duì)斑馬魚(yú)脂代謝紊亂有改善作用，所以最終選擇了0.125、0.25、0.5 μg/mL的大黃素作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的低、中、高濃度。因此，本文通過(guò)復(fù)制HLP的斑馬魚(yú)為模型生物，研究大黃素對(duì)HLP斑馬魚(yú)脂質(zhì)代謝的作用，以期為HLP的相關(guān)機(jī)制研究和大黃素的開(kāi)發(fā)利用提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型AB品系斑馬魚(yú)由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)室提供，轉(zhuǎn)基因血管熒光斑馬魚(yú)Tg(fli1:eGFP)購(gòu)于國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心。所有成年斑馬魚(yú)在北京愛(ài)生公司斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)中養(yǎng)殖，水溫28 ℃，pH值7.4，電導(dǎo)率400～600 μs/cm。每日喂養(yǎng)兩次，日光燈照射14 h，黑暗環(huán)境10 h。其余飼養(yǎng)和繁殖條件參照Z(yǔ)ebrafish Book。斑馬魚(yú)的實(shí)驗(yàn)遵循成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)和使用委員會(huì)的要求。欲得實(shí)驗(yàn)所需的斑馬魚(yú)仔魚(yú)，于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1天下午，選用健康性成熟的雌雄斑馬魚(yú)，按照♀∶♂=1∶1～2的數(shù)量移入產(chǎn)卵盒，并用透明隔板將雌雄斑馬魚(yú)隔開(kāi)，于次日9時(shí)移去隔板，待雄魚(yú)追逐雌魚(yú)1 h后收集胚胎。收集到的胚胎用培養(yǎng)液清洗干凈后移入無(wú)菌培養(yǎng)皿，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每天更換清潔水。待受精卵孵育至5 dpf(days post fertilization)，挑選出健康的個(gè)體進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試藥

大黃素購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)為MUST-18110810，純度為98.73%。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

斑馬魚(yú)幼魚(yú)飼料(邰港科技股份有限公司，批號(hào)為20171115)；膽固醇(美國(guó)Amresco公司，批號(hào)為57-88-5)；Cholesteryl BODIPY?542/563 C11(美國(guó)Thermo scientific公司，批號(hào)為2000227)；TC、TG、LDL-c、HDL-c測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20190322、20190322、20190321、20190321)；無(wú)水乙醚(成都市科龍化工試劑廠(chǎng)，批號(hào)為20110117)；二甲基亞砜(廣州賽國(guó)生物科技公司，批號(hào)為EZ1609C224)；無(wú)水乙醇(四川西隴科學(xué)有限公司，批號(hào)為180904)等。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

Olympus激光共聚焦顯微鏡(FV-OSR型，日本奧林巴斯公司)；酶標(biāo)儀(Multiskan Mk3型，美國(guó)Thermo scientific公司)；電子分析托盤(pán)天平(Sartorius 11D型，德國(guó)Sartorius公司)；離心機(jī)(ALLEGER X-12型，美國(guó)BECKMAN Coulter公司)；渦旋震蕩器(BP-2 Vortex-Genie 2型，美國(guó)Scientific Industries公司)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 飼料配制

2.1.1 高膽固醇飼料的配制

將普通斑馬魚(yú)幼魚(yú)飼料浸沒(méi)于溶解有一定量膽固醇的無(wú)水乙醚中，充分?jǐn)嚢柚烈颐淹耆珦]發(fā)，使膽固醇附于普通飼料上，制備成含4%(w/w)的高膽固醇飼料[14]。

2.1.2 熒光探針飼料的配制

將熒光探針(熒光標(biāo)記的膽固醇乙脂類(lèi)似物：Cholesteryl BODIPY?542/563 C11)溶解于無(wú)水乙醚中，按照10 μg/g的比例，分別添加到普通飼料和高膽固醇飼料中即可。由于熒光標(biāo)針對(duì)光比較敏感，所以此飼料的配制應(yīng)盡可能在黑暗的環(huán)境中操作。

2.2 斑馬魚(yú)分組及給藥方案

為了獲得斑馬魚(yú)幼魚(yú)的活體成像圖片，待胚胎發(fā)育至20 hpf時(shí)以及之后的整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期中，在飼養(yǎng)用水中添加0.03 g/L的1-苯基-2-硫脲(1-phenyl-2-thiourea,PTU)，以抑制斑馬魚(yú)胚胎中黑色素的生成。每日定時(shí)更換新鮮的PTU培養(yǎng)水，并及時(shí)將死卵和卵殼清除。待Tg(fli1:eGFP)受精卵孵育至5 dpf時(shí)，挑選出健康的個(gè)體，隨機(jī)分為普通飼料組(normal cholesterol diet,NCD)，高膽固醇飼料組(high cholesterol diet,HCD)，大黃素低、中、高劑量組(Emo-L、Emo-M、Emo-H組)，于6孔板中飼養(yǎng)，每孔50尾仔魚(yú)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。正常對(duì)照組飼喂添加有熒光探針的普通飼料，高膽固醇模型組飼喂添加有熒光探針的高膽固醇飼料，給藥組飼喂添加有熒光探針的高膽固醇飼料且在每天早上分別加入不同濃度的大黃素，即Emo-L、Emo-M和Emo-H組分別添加0.125、0.25、0.5 μg/mL的大黃素。各組斑馬魚(yú)每天定時(shí)定量投喂飼料2次，定時(shí)換水1次，連續(xù)喂養(yǎng)10天。

2.3 存活率觀(guān)測(cè)

分別于造模給藥后10天內(nèi)，觀(guān)察并記錄各組斑馬魚(yú)的存活尾數(shù)，計(jì)算其百分率。

2.4 體重、體長(zhǎng)和體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)測(cè)量

用三卡因溶液將幼魚(yú)麻醉，用吸水紙將幼魚(yú)表面水吸干，在分析天平中稱(chēng)量各組斑馬魚(yú)的體重并記錄。用游標(biāo)卡尺測(cè)量幼魚(yú)頭部最前端到魚(yú)尾最末端距離，這段長(zhǎng)度代表幼魚(yú)體長(zhǎng)，BMI為體質(zhì)量(mg)除以體長(zhǎng)(cm)的平方所得的數(shù)值。

2.5 斑馬魚(yú)幼魚(yú)血管膽固醇含量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從每組中隨機(jī)取8尾幼魚(yú)，置于激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察膽固醇在斑馬魚(yú)幼魚(yú)血管中的積累情況并拍照。為了保證斑馬魚(yú)在拍攝過(guò)程中是存活的，需要將斑馬魚(yú)幼魚(yú)麻醉并固定在含有0.02%三卡因的0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖中。顯微拍攝時(shí)，以斑馬魚(yú)幼魚(yú)血管處的的泄殖腔為左側(cè)邊界，放大100倍。拍攝的所有照片均設(shè)置相同的參數(shù)，以便后續(xù)對(duì)熒光的強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。

2.6 斑馬魚(yú)幼魚(yú)脂質(zhì)代謝生化指標(biāo)測(cè)定

在實(shí)驗(yàn)終止階段，將每組30尾斑馬魚(yú)長(zhǎng)時(shí)間暴露在高濃度的三卡因溶液中至安樂(lè)死，并將動(dòng)物腹中未消化的食物清除。將斑馬魚(yú)幼魚(yú)按體質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例，加入9倍量體積的無(wú)水乙醇，在冰水浴條件下機(jī)械勻漿，2 500 rpm，離心10 min，吸取上清液，按照TC、TG、LDL-c和HDL-c試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)量幼魚(yú)體內(nèi)總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇的濃度。

2.7 斑馬魚(yú)幼魚(yú)動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)的測(cè)定

根據(jù)每組計(jì)算出來(lái)的幼魚(yú)體內(nèi)的總膽固醇濃度和高密度脂蛋白膽固醇濃度，利用以下公式，計(jì)算出各組斑馬魚(yú)幼魚(yú)的動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)。

動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(AI)=(TC-HDL-c)/HDL-c

2.8 圖像分析

各組斑馬魚(yú)幼魚(yú)均在Olympus激光共聚焦顯微鏡下成像。紅色通道：559 nm，綠色通道：488 nm，并利用奧林巴斯自帶的圖像分析軟件對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)尾動(dòng)脈的平均熒光密度(mean fluorescence intensity,MFI)進(jìn)行分析。

2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 存活率觀(guān)測(cè)

對(duì)不同組別斑馬魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)和死亡情況進(jìn)行分析，可以看出NCD組生長(zhǎng)正常，體表色素正常，基本無(wú)死亡。HCD組，因連續(xù)飼喂10天高膽固醇飼料，致使該組死亡率上升。給藥組死亡率明顯低于HCD組，活動(dòng)度增強(qiáng)。各組存活率如圖3所示，與NCD組相比，HCD組幼魚(yú)存活率極顯著性降低(P<0.001)；與HCD組相比，Emo-L組幼魚(yú)存活率顯著性升高(P<0.01)；Emo-M組、Emo-H組幼魚(yú)存活率均極顯著性升高(P<0.001)。

圖3 不同濃度的大黃素對(duì)高膽固醇血癥斑馬 魚(yú)存活率的影響Fig.3 Effects of different concentrations of emodin on survival rate in hypercholesterolemic zebrafish 注：與NCD組比較，###P<0.001；與HCD組比較，**P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Note: Compared with the NCD group,###P<0.001; Compared with the HCD group,*P< 0.05,**P<0.01,***P<0.001.

3.2 體重、體長(zhǎng)和BMI測(cè)定

如表1所示，與NCD組相比，HCD組幼魚(yú)體重、體長(zhǎng)極顯著性增加(P<0.01)；與HCD組相比，Emo-L組、Emo-M組、Emo-H組幼魚(yú)的體重、體長(zhǎng)均極顯著性降低(P<0.01)，且Emo-H組幼魚(yú)的BMI與NCD組有極顯著性差異(P<0.01)。

表1 各組斑馬魚(yú)幼魚(yú)喂養(yǎng)10天后體重、體長(zhǎng)、BMI變化Table 1 Changes in body weight,body length and BMI of zebrafish larvae after 10 days of feeding in each

注：與NCD組比較，##P<0.01，###P<0.001；與HCD組比較，**P<0.01，***P<0.001。

Note: Compared with the NCD group,##P<0.01,###P<0.001; Compared with the HCD group,**P<0.01,***P<0.001.

3.3 大黃素對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)血管膽固醇積累的影響

如圖4、圖5和表2所示，利用高膽固醇-熒光探針飼料連續(xù)喂食斑馬魚(yú)幼魚(yú)10 d后，與NCD組相比，HCD組幼魚(yú)血管中膽固醇水平升高7.46倍(P<0.001)。結(jié)果表明可以利用高膽固醇-熒光探針飼料飼喂斑馬魚(yú)幼魚(yú)來(lái)進(jìn)一步研究體內(nèi)膽固醇的積累情況。不同濃度大黃素處理10天后，與HCD組相比，Emo-L組，Emo-M組和Emo-H組分別降低血管膽固醇18.57%(P<0.01)，49.21%(P<0.001)，73.53%(P<0.001)。結(jié)果表明大黃素對(duì)高膽固醇誘導(dǎo)的高膽固醇血癥斑馬魚(yú)幼魚(yú)血管膽固醇含量有一定的改善作用。

圖4 大黃素對(duì)高膽固醇血癥斑馬魚(yú)血管膽固醇累積的影響(×100)Fig.4 Effects of emodin on vascular cholesterol accumulation in hypercholesterolemic zebrafish(×100) 注：A：Fli1:eGFP斑馬魚(yú)幼魚(yú)熒光圖。箭頭：尾動(dòng)脈，三角：泄殖腔。熒光密度測(cè)量從泄殖腔開(kāi)始，也就是矩形所標(biāo)記的位置。綠色熒光為血管，紅色熒光為磷脂標(biāo)記的膽固醇，綠色通道：488 nm，紅色通道：559 nm。B：各組斑馬魚(yú)幼魚(yú)血管脂質(zhì)堆積情況。斑馬魚(yú)幼魚(yú)尾動(dòng)脈熒光密度圖，側(cè)面視圖，背部朝上。紅色熒光為磷脂標(biāo)記的膽固醇，紅色通道：559 nm。Note: A: Fluorescent image of Tg (fli1:eGFP) zebrafish larvae.Arrow: caudal artery; triangle: cloaca.Fluorescence intensity was measured from the cloacal,the position marked by the rectangle.Blood vessel is shown green fluorescence and while lipid (cholesterol) is in red.Green channel: 488 nm; Red: 559 nm.B: Lipid accumulation in blood vessels of zebrafish larvae in each group.Fluorescence images of the artery were shown from tested groups in zebrafish larvae.Lateral views,dorsal is up.The red fluorescence is the phospholipid labeled cholesterol.Red: 559 nm.

表2 大黃素對(duì)高膽固醇血癥斑馬魚(yú)血管膽固醇累積的影響Table 2 Effects of emodin on vascular cholesterol accumulation in hypercholesterolemic zebrafish(n=

注：與NCD組比較，###P<0.001；與HCD組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

Note: Compared with the NCD group,###P<0.001; Compared with the HCD group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

3.4 大黃素對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)TC、TG、LDL-c和HDL-c的影響

如表3所示，與NCD組相比，HCD組幼魚(yú)TC、TG、LDL-c和HDL-c水平均極顯著性升高(P<0.01)；與HCD組相比，Emo-L組幼魚(yú)的TC和LDL-c水平分別下調(diào)24.28%(P<0.001)，44.89%(P<0.01)，HDL-c水平上升188.46%(P<0.05)，TG水平變化不顯著；Emo-M組幼魚(yú)的TC和LDL-c水平分別下調(diào)30.76%(P<0.001)，51.39%(P<0.01)，HDL-c水平上升334.62%(P<0.001)，TG水平變化不顯著；Emo-H組幼魚(yú)的TC、TG和LDL-c水平分別下調(diào)39.90%(P<0.001)，56.23%(P<0.01)，51.39%(P<0.01)，HDL-c水平上升403.85%(P<0.001)。結(jié)果表明大黃素具有一定的降血脂和降膽固醇作用。

圖5 大黃素對(duì)高膽固醇血癥斑馬魚(yú)血管 膽固醇累積的影響(n= 8)Fig.5 Effects of emodin on vascular cholesterol accumulation in hypercholesterolemic zebrafish(n= 8) 注：與NCD組比較， ###P<0.001；與HCD組比較，**P<0.01，***P<0.001。Note: Compared with the NCD group,###P< 0.001; Compared with the HCD group,**P<0.01,***P<0.001.

3.5 動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)

如圖4所示，與NCD組相比，HCD組幼魚(yú)AI極顯著性升高(P<0.001)；與HCD組相比，Emo-L組，Emo-M組和Emo-H組幼魚(yú)的AI均極顯著性降低(P<0.001)。結(jié)果表明，大黃素能降低高膽固醇血癥斑馬魚(yú)的動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)。

表3 大黃素對(duì)高膽固醇血癥斑馬魚(yú)TC、TG、LDL-c和HDL-c的影響Table 3 Effects of emodin on TC,TG,LDL-c and HDL-c in hypercholesterolemic 30)

注：與NCD組比較，##P<0.01，###P<0.001；與HCD組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

Note: Compared with the NCD group,##P<0.01,###P<0.001; Compared with the HCD group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

圖6 大黃素對(duì)高膽固醇血癥斑馬魚(yú)動(dòng)脈 粥樣硬化指數(shù)的影響(n = 30)Fig.6 Effect of emodin on atherosclerosis index in hypercholesterolemic zebrafish(n = 30) 注：與NCD組比較,###P<0.001；與HCD組比較,***P<0.001。Note: Compared with the NCD group,###P<0.001; Compared with the HCD group,***P<0.001.

4 討論

隨著飲食結(jié)構(gòu)和交通方式的轉(zhuǎn)變，HLP的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。長(zhǎng)期高脂高膽固醇飲食會(huì)打破機(jī)體脂質(zhì)吸收和消化之間的平衡關(guān)系，導(dǎo)致脂肪和膽固醇在血管內(nèi)壁上過(guò)度沉積，形成粥樣斑塊，影響血流速度，進(jìn)而產(chǎn)生一系列更為嚴(yán)重的心血管疾病。有研究表明，HLP是導(dǎo)致FLD、AS、DM、冠心病、腦梗死等多種疾病的首要病因。因此，及早進(jìn)行預(yù)防和選用有效的降脂藥是降低患者心血管事件發(fā)生的有效控制手段。開(kāi)發(fā)和研究具有降脂作用的中藥需要建立可靠的脂質(zhì)代謝紊亂動(dòng)物模型，目前國(guó)內(nèi)外主要用豚鼠和金黃地鼠兩種動(dòng)物來(lái)建立HLP模型研究血脂代謝相關(guān)疾病[15]，因其具有成本低、造模時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。隨著新理論、新技術(shù)和新概念的出現(xiàn)，人們對(duì)高脂模型的要求隨之提高。研究人員在進(jìn)行研究時(shí)必須謹(jǐn)慎，因?yàn)槟承┠Ｐ偷闹|(zhì)代謝可能被證明與人類(lèi)完全不同，因此就可能不適合用于篩選降血脂中藥。目前，一種可以高通量篩選藥物的生物模型—斑馬魚(yú)，因其具有身體透明、器官清晰可見(jiàn)和能夠以高分辨率在體內(nèi)對(duì)器官和生物過(guò)程進(jìn)行非侵入性的可視化等優(yōu)點(diǎn)，被人們廣泛關(guān)注和使用。

Stoletov等[14]利用其上述特性，對(duì)活體高膽固醇血癥斑馬魚(yú)幼魚(yú)的血管脂質(zhì)堆積、脂蛋白氧化和脂肪條紋的形成情況進(jìn)行了實(shí)時(shí)的研究報(bào)道。因此，本研究通過(guò)飼喂斑馬魚(yú)幼魚(yú)高膽固醇-熒光探針飼料(添加Cholesteryl BODIPY?542/563 C11)來(lái)復(fù)制HLP模型，在共聚焦顯微鏡下觀(guān)察被標(biāo)記的膽固醇(顯微鏡下表現(xiàn)為紅色熒光)在斑馬魚(yú)幼魚(yú)血管處的累積，進(jìn)而研究大黃素對(duì)HLP斑馬魚(yú)脂質(zhì)代謝紊亂的改善作用。研究結(jié)果表明，斑馬魚(yú)給予高膽固醇飼料10天后，幼魚(yú)血管中膽固醇水平極顯著升高，且大量沉積在血管附近，用不同濃度的大黃素處理10天后，幼魚(yú)血管中膽固醇水平均極顯著降低，減輕了膽固醇在血管附近的堆積，提示大黃素對(duì)高膽固醇血癥斑馬魚(yú)幼魚(yú)血管膽固醇含量和沉積有一定的改善作用。

目前臨床上常用TC、TG、LDL-c和HDL-c作為檢測(cè)HLP基本的指標(biāo)。因此，本研究測(cè)定了這四種脂質(zhì)水平，結(jié)果顯示，斑馬魚(yú)給予高膽固醇飼料10天后，幼魚(yú)體內(nèi)的TC、TG和LDL-c水平均極顯著性升高，HDL-c水平極顯著性降低，表明通過(guò)給予高膽固醇飼料來(lái)復(fù)制HLP斑馬魚(yú)模型是可行的。用不同濃度的大黃素處理10天后，除TG水平變化不顯著外，其余指標(biāo)水平均有顯著性差異，且呈劑量依耐性，提示在一定濃度范圍內(nèi)的大黃素對(duì)脂質(zhì)代謝紊亂有較好的改善作用。脂質(zhì)、膽固醇和復(fù)合糖類(lèi)長(zhǎng)期大量的在血管處集聚、沉著，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈壁增厚變硬、血管腔變窄，致使動(dòng)脈內(nèi)膜出現(xiàn)黃色的粥樣，進(jìn)而演變成AS。血清TC和LDL-c水平升高是AS發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。目前，國(guó)際醫(yī)學(xué)界常用動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)來(lái)衡量動(dòng)脈硬化的程度，可以通過(guò)TC和HDL-c水平計(jì)算出動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)。雖然現(xiàn)在對(duì)正常斑馬魚(yú)還沒(méi)有確定的動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，但通過(guò)本研究可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予高膽固醇飼料10天后，AI較正常組極顯著的升高，用不同濃度的大黃素后，其AI均顯著性降低，表明大黃素在抗AS方面表現(xiàn)出極好的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)大黃素能顯著改善HLP斑馬魚(yú)的體脂水平，對(duì)HLP有較好的改善作用，以期為HLP的相關(guān)機(jī)制研究和大黃素的開(kāi)發(fā)利用提供新的思路，后續(xù)還應(yīng)對(duì)其發(fā)揮良好調(diào)脂作用的具體機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。