劉運超，陳玉梅，馮麗麗，汪 磊，王聚財，陸東峰，張改平

(1.河南省農業(yè)科學院 動物免疫學重點實驗室/農業(yè)部動物免疫學重點開放實驗室，河南 鄭州 450002；2.鄭州大學 生命科學學院，河南 鄭州 450001；3.河南省農業(yè)科學院 農業(yè)經濟與信息研究所，河南 鄭州 450002；4.河南花花牛實業(yè)總公司，河南 鄭州 450006)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一種接觸性、急性、高度致死性傳染病，該病在世界范圍內流行，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經濟損失[1]。CSFV是一種黃病毒科CSFV屬的單股正鏈RNA囊膜病毒，基因組共編碼12種蛋白質(Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)[2-3]。其中，C、Erns(gp44/48)、E1(gp33)、E2(gp55)蛋白為病毒的主要結構蛋白，其余8個為非結構蛋白。結構蛋白E2分子質量約55 ku，為糖基化的囊膜蛋白，主要位于病毒粒子表面，在病毒入侵細胞的過程中發(fā)揮重要作用[4-8]；同時E2蛋白也是CSFV主要保護性抗原，能夠誘導機體產生抗CSFV中和抗體，抵抗病毒的入侵[9-11]。采用桿狀病毒系統(tǒng)表達制備的CSFV E2蛋白，可有效刺激機體產生高滴度的抗CSFV特異性抗體和中和抗體，能夠有效抑制病毒感染[12-13]。重組腺病毒載體表達的E2蛋白也能夠有效保護機體免受CSFV攻擊[14-15]；相關疫苗和免疫學研究結果顯示，高滴度抗E2蛋白抗體可有效抑制病毒感染與復制[16-18]。

前人以CSFV E2蛋白為免疫原制備了一系列的單克隆抗體，廣泛應用于CSFV診斷方法的建立[19-20]。中性單克隆抗體能夠有效抑制病毒感染活性，在病毒與宿主的相互作用、病毒中和性抗原表位研究和免疫評價方法建立方面發(fā)揮重要作用。但是，具有中和活性的CSFV單克隆抗體報道較少，限制了CSFV的相關研究[21-24]。為此，分別以CSFV SM株和桿狀病毒表達的CSFV E2蛋白免疫BABL/c小鼠，用經典的雜交瘤技術篩選針對CSFV E2蛋白中和表位的特異性單克隆抗體，為進一步研究CSFV中和性抗原表位和免疫評價方法建立提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 毒株、E2蛋白及細胞

CSFV SM株、牛流行性腹瀉病毒(BVDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬圓環(huán)病毒(PCV2)均由本實驗室保存；大腸桿菌表達的CSFV E2蛋白及桿狀病毒表達CSFV E2蛋白由本實驗室構建、表達并純化；小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒和CSFV單克隆抗體WH303購自Proteintech公司；HRP標記的羊抗鼠IgG購自武漢三鷹生物公司PK15細胞、MBDK細胞、Marc145細胞均由本實驗室保存，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。PK15細胞用于CSFV和PCV2增殖、MBDK細胞用于BVDV增殖、Mac145細胞用于PRRSV病毒增殖；PRRSV單克隆抗體由本實驗室保存；骨髓瘤細胞NS0由本實驗室保存，以含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 供試動物

6～8 周齡SPF級BALB/c純系雌性小鼠購自鄭州大學醫(yī)學院實驗動物中心。

1.3 抗原制備

CSFV SM株接種PK-15細胞，擴繁后收集病毒，經Millipore Pellicon切向流超濾系統(tǒng)超濾濃縮后，采用Sepharose 4 Fast Flow層析柱純化獲得CSFV病毒。向純化病毒液中加入1∶2 000稀釋的β-丙內酯，4 ℃放置72 h滅活病毒。桿狀病毒表達的CSFV E2蛋白以及原核表達的CSFV E2蛋白均帶有組氨酸標簽，經Ni柱親和層析純化后備用。

1.4 動物免疫

6～8周齡的BALB/c小鼠共6只，分為A、B 2組，每組3只，其中A組小鼠免疫CSFV，B組小鼠免疫經過純化的桿狀病毒表達E2蛋白。首次免疫每只200 μL免疫原(CSFV TCID50=106.5或25 μg E2蛋白)頸背部皮下多點注射，每隔21 d免疫1次，共免疫3次。首次免疫采用弗氏完全佐劑，第2、3次免疫用弗氏不完全佐劑，免疫方式與劑量同前。第3次免疫后14 d，采用間接ELISA測定免疫小鼠效價，同時采用IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒檢測免疫小鼠血清阻斷率，具體操作參照試劑盒說明書。分別選取A、B 2組阻斷價高的小鼠進行加強免疫，加強免疫分別選用不含佐劑的CSFV和桿狀病毒表達E2蛋白抗原，按50 μg/只的劑量進行腹腔注射。

1.5 細胞融合

加強免疫后3～5 d，脫頸處死小鼠，無菌取脾臟，制備脾細胞懸液，與生長狀態(tài)良好的NS0骨瘤細胞混合，按照文獻[19]所述方法進行細胞融合。以HAT培養(yǎng)基對融合后細胞進行選擇培養(yǎng)，將懸浮細胞均勻鋪至20塊96孔板，每孔300 μL，培養(yǎng)10 d后用免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)進行陽性克隆篩選，選擇強陽性孔進行3～5輪亞克隆篩選，獲得能穩(wěn)定分泌抗CSFV E2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

1.6 免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)

IPMA用于檢測單克隆抗體的特異性和敏感性。將PK15細胞鋪至96孔細胞培養(yǎng)板，長成單層時用CSFV感染細胞，同時設未感染細胞為空白對照，感染后24 h用含3% H2O2的甲醇固定液室溫固定15 min，棄去固定液，用含 5% 脫脂奶粉的PBST溶液37 ℃封閉1 h，每孔加入待檢細胞上清50 μL，同時以商品化CSFV單克隆抗體WH303為陽性對照，37 ℃孵育30 min，PBST洗6次，每孔加入50 μL(1∶1 000稀釋)的HRP標記的羊抗小鼠二抗，37 ℃孵育30 min，每孔加入50 μL的AEC顯色液5～10 min，顯微鏡下觀察，待陽性對照孔充分顯色后，用雙蒸水終止顯色，記錄試驗結果。用IPMA檢測抗體敏感性時，每孔加入50 μL梯度稀釋的單克隆抗體細胞上清或單克隆抗體腹水。

1.7 單克隆抗體腹水的制備及效價測定

將陽性雜交瘤細胞進行擴大培養(yǎng)，收集備用。取BALB/c小鼠，腹腔注射液體石蠟(0.5 mL/只)，10 d后腹腔注射5×105～5×106個雜交瘤細胞。8～12 d后采集小鼠腹水，37 ℃靜置1 h，4 500 r/min離心10 min，吸取上清-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用間接ELISA和IPMA檢測4株單克隆抗體腹水的效價，從1∶1 000開始進行2倍倍比稀釋，每孔加入50 μL倍比稀釋的單克隆抗體腹水進行IPMA檢測。

1.8 CSFV E2 蛋白單克隆抗體的鑒定

分別選用IPMA、ELISA、Western blot鑒定單克隆抗體特異性。分別用CSFV感染PK15細胞、BVDV感染MBDK細胞、PRRSV感染Marc145細胞、PCV2感染PK15細胞進行IPMA試驗，同時設未感染細胞作對照，具體方法參照1.6。Western blot鑒定：分別將經桿狀病毒表達純化獲得的CSFV E2蛋白以及原核表達的CSFV E2蛋白進行SDS-PAGE電泳，一塊膠用考馬斯亮藍染色液觀察。另一塊膠用半干法轉至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉1 h，PBST洗3遍，分別用雜交瘤細胞上清作為一抗，室溫輕輕振蕩孵育1 h，PBST洗滌6次。以1∶1 000稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG二抗室溫孵育30 min，PBST洗滌6次，AEC顯色，雙蒸水終止反應，觀察并記錄試驗結果。采用Proteintech公司生產的單克隆抗體亞型鑒定試劑盒，按照產品說明書操作，對單克隆抗體進行亞型鑒定。

1.9 中和性單克隆抗體的篩選與鑒定

采用IPMA檢測單克隆抗體的中和活性，設PRRSV單克隆抗體腹水為陰性對照(NC)。將單克隆抗體腹水從1∶200開始，進行2倍倍比梯度稀釋，CSFV用無血清培養(yǎng)基稀釋至200 TCID50，然后將二者等比例混合，37 ℃孵育1 h；棄去PK15細胞板中的培養(yǎng)基，每孔加入100 μL的病毒和單克隆抗體腹水的孵育液，37 ℃孵育培養(yǎng)2 h，棄去細胞板中液體，加入含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)20 h。棄去培養(yǎng)上清，用含有3%H2O2的甲醇固定液室溫固定15 min。以1∶400稀釋的SCFV陽性血清為一抗，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，PBST洗6次；以1∶1 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，室溫孵育30 min，PBST洗6次。AEC顯色后用顯微鏡觀察并記錄結果，計算抗體中和滴度。

2 結果與分析

2.1 抗原純化與鑒定

采用切向流超濾濃縮法和離子交換層析法純化CSFV粒子，經IPMA檢測，結果如圖1A所示，純化后CSFV滴度為106.5TCID50，未感染病毒的PK15細胞陰性對照組成立(圖1B)。采用Ni柱親和層析法分別純化重組桿狀病毒和重組大腸桿菌表達的CSFV E2蛋白，經SDS-PAGE分析估算，其重組CSFV E2蛋白的純度均為95%左右(圖1C、1D)。

A.IPMA檢測純化的CSFV；B.IPMA陰性對照；C.SDS-PAGE檢測純化的CSFV E2(桿狀病毒來源)蛋白；D.SDS-PAGE檢測純化的CSFV E2蛋白(大腸桿菌來源)；M.蛋白質Marker；1.桿狀病毒來源CSFV E2蛋白；2.大腸桿菌來源CSFV E2蛋白

2.2 小鼠抗體效價測定

將第3次免疫后14 d(即免疫后第56 天)的小鼠血清倍比稀釋，間接ELISA檢測結果顯示，A、B 2組抗體效價最高均能達到5.12×104；商品化抗體檢測試劑盒(IDEXX公司)檢測結果顯示，免疫后56 d，6只小鼠產生的抗體阻斷率為72.6%～86.2%(表1)。由此可見，不同試驗組的小鼠都產生了較高效價的抗CSFV特異性抗體，且具有一定的中和活性。

2.3 抗CSFV E2蛋白單克隆抗體的篩選

通過有限稀釋法對雜交瘤細胞進行亞克隆，并結合IPMA方法篩選，共篩選到4株抗CSFV E2蛋白的單克隆抗體(5D1、8H7、9A1和13B2)，IPMA結果顯示，4株單克隆抗體均能與CSFV發(fā)生特異性反應(圖2)。

表1 ELISA檢測免疫小鼠血清效價及抗體阻斷率

A.5D1；B.8H7；C.9A1；D.13B2；E.WH303；F.陰性對照

2.4 單克隆抗體腹水效價測定

間接ELISA及IPMA方法檢測4株單克隆抗體腹水的效價，結果如表2示，間接ELISA檢測4株單克隆抗體的腹水效價在2.56×105～1.02×106；IPMA效價分別為：6.40×104、1.28×105、2.56×105、1.28×105。

表2 間接ELISA及IPMA測定單克隆抗體腹水效價

2.5 單克隆抗體的特異性鑒定

采用IPMA試驗分別檢測4株單克隆抗體與PCV2、BVDV和PRRSV的交叉反應情況，結果顯示，4株單克隆抗體均能與CSFV發(fā)生特異性反應，而與PCV2、BVDV和PRRSV均不發(fā)生反應(圖3)。Western blot鑒定結果顯示，4株單克隆抗體均能與桿狀病毒表達的CSFV E2蛋白發(fā)生特異性反應，在約46 ku處有1條明顯的特異性反應條帶(圖4A)；同時，也能夠與大腸桿菌表達的CSFV E2蛋白發(fā)生特異性反應(圖4B)。以上結果表明，4株單克隆抗體均能特異性識別CSFV E2蛋白的線性表位。用Proteintech公司的單克隆抗體亞型鑒定試劑盒檢測4株單克隆抗體的亞型，檢測結果表明，4株單克隆抗體輕鏈都屬于κ型，其中，5D1、8H7、13B2為IgG1亞型，9A1為IgG2c亞型。

圖3 IPMA測定4株單克隆抗體的特異性

2.6 中和性單克隆抗體的篩選與鑒定

將CSFV SM株病毒液稀釋至200 TCID50，分別與4株倍比稀釋的單克隆抗體孵育，進行病毒中和試驗。結果顯示，1∶200稀釋時，5D1、8H7、9A13株單克隆抗體有一定的中和活性，單克隆抗體13B2具有明顯的中和活性，其中和效價能達到1.28×104，而PRRSV單克隆抗體腹水的陰性對照則完全沒有中和作用(圖5)。

A.重組桿狀病毒表達的CSFV E2蛋白；B.重組大腸桿菌表達的CSFV E2蛋白；M.蛋白質Marker；1.CSFV E2蛋白的SDS-PAGE鑒定；2.5D1；3.8H7；4.9A1；5.13B2;

圖5 4株單克隆抗體的中和抗體效價

3 結論與討論

在CSFV 結構蛋白中，E2蛋白是主要的免疫抗原，可誘導機體產生特異性的中和抗體，是制備抗CSFV單克隆抗體的理想免疫原[9-11]，CSFV E2蛋白已在桿狀病毒表達系統(tǒng)中成功表達[12-13]。國內外學者針對 CSFV E2 蛋白制備了一系列單克隆抗體，王愛華等[20]、許保疆等[21]分別用純化后的CSFV作為免疫原，最終獲得抗CSFV的單克隆抗體，但并未發(fā)現(xiàn)篩選到的單克隆抗體具有中和活性；夏照和等[25]以純化的桿狀病毒表達的重組HCLV-E2蛋白為耐受原、CSFV石門株E2蛋白為免疫原，采用環(huán)磷酰胺免疫抑制法制備特異性識別CSFV野毒株的單克隆抗體，獲得了1株能穩(wěn)定分泌抗E2蛋白單克隆抗體并具有中和活性的雜交瘤細胞株，但是中和效價較低。由于CSFV浮密度小，細胞培養(yǎng)病毒滴度不高，難以純化，為CSFV單克隆抗體的制備帶來了諸多難題，本研究采用經切向流超濾系統(tǒng)超濾濃縮以獲得高滴度的CSFV，再經過Sepharose 4 Fast Flow過濾層析純化進而獲得純度較高的CSFV，有效解決了因粗病毒免疫小鼠后產生許多針對細胞成分的抗體這一難題。此外，本研究采用CSFV粒子和重組表達E2蛋白作為抗原的免疫方案，為CSFV中和性單克隆抗體的制備提供了一種新的思路。經過阻斷ELISA測定免疫小鼠效價，分別選擇CSFV E2蛋白及純化的CSFV免疫組中阻斷效價最高的小鼠進行細胞融合，通過IPMA等方法篩選，獲得了4株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，經鑒定，4株單克隆抗體與桿狀病毒表達系統(tǒng)及大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得的CSFV E2蛋白均能發(fā)生特異性反應，且與CSFV細胞毒具有良好的反應性和高度的特異性；其中1株單克隆抗體具有較高中和活性，中和效價為1.28×104。本研究成功獲得了1株針對CSFV中和表位的特異性單克隆抗體，為進一步研制CSFV抗原快速檢測產品提供技術支持，同時為CSFV中和表位鑒定以及病毒致病機制等方面的研究奠定基礎。