李林軒，梁瑩，秦雙雙，繆劍華，韋坤華

廣西藥用植物園/廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點實驗室，廣西 南寧 530023

廣豆根，又稱山豆根、南豆根，為豆科植物越南槐SophoratonkinensisGagnep.的干燥根及根莖，是著名的廣西道地藥材和常用中藥，為《中華人民共和國藥典》2015版所收載[1]。主要分布在廣西、云南，貴州亦有產(chǎn)，但產(chǎn)量較小[2]。廣豆根藥材味苦，寒，有毒，具有清熱解毒、消腫止痛等功效，可以治療喉癰、喉風(fēng)、喉痹、牙齦腫痛、喘滿熱咳、肝炎、便秘、黃疸、下痢、痔疾、禿瘡、疥癬及蚊、蟲、犬咬傷等[3-4]。由于使用量的增加及藥材使用與種植模式的改變，廣豆根野生資源急劇下降，在某些區(qū)域幾乎已經(jīng)絕跡，很難滿足市場需求[5]。在野生資源的壓力下，在過去的10年里，廣豆根的藥材價格增長了10倍左右，現(xiàn)在已經(jīng)達(dá)到了210元/kg。在自然條件下，廣豆根主要依靠種子進(jìn)行繁育，但在開花結(jié)莢期廣豆根的病蟲害嚴(yán)重，且種子成熟時自然脫落的特性常造成種子產(chǎn)量低，生產(chǎn)上難以實現(xiàn)大面積栽培[6]。

隨植物組織培養(yǎng)技術(shù)的迅猛發(fā)展，許多瀕危植物已經(jīng)在組織培養(yǎng)工廠化生產(chǎn)上取得了成功[7]，對廣豆根進(jìn)行組織培養(yǎng)工廠化生產(chǎn)是最為快速獲得廣豆根種苗的途徑，不僅可以解決市場需求不足的問題，對保護(hù)國家生態(tài)環(huán)境及藥用資源都具有深遠(yuǎn)的意義。本研究通過無菌播種獲取大量的基礎(chǔ)生產(chǎn)材料，并通過叢生芽快速繁殖建立廣豆根種苗的繁育體系，并應(yīng)用于組織培養(yǎng)工廠化生產(chǎn)中，可以大大縮短生產(chǎn)周期，減低生產(chǎn)成本，提高種苗質(zhì)量，從而提高種苗成活率及藥材產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

廣豆根野生植株引自靖西、那坡等地，種植于廣西藥用植物園廣豆根種植基地，取其優(yōu)良株系的果莢進(jìn)行實驗及生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 以MS或1/2MS為基本培養(yǎng)基，植物生長調(diào)節(jié)劑選用6-BA、KT、NAA、IAA、IBA，根據(jù)實驗?zāi)康暮筒牧系纳L情況添加不同的外源添加物(活性炭)，并附20 g·L-1蔗糖、0.5 g·L-1的活性炭(AC)及4.0 g·L-1的瓊脂粉，pH值為5.8。培養(yǎng)基配置分裝后于121 ℃、壓力為105 Pa的條件下滅菌15 min。冷卻后接入植物材料，在溫度(25±3)℃，光照時間12 h·d-1的條件下培養(yǎng)。

1.2.2 種子的滅菌消毒 采摘結(jié)莢后生長90～180 d的尚未開裂的果莢，用自來水洗去表面灰塵，并用刀片輕輕刮去表面的臟物，然后移至超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行無菌操作，先放入75%乙醇中浸泡2 min后，轉(zhuǎn)入0.1% HgCl2溶液中消毒10 min，期間不斷搖動，無菌水漂洗3遍，用無菌濾紙吸干材料表面水分后將果莢剖開，將里面的種子取出接種于培養(yǎng)基的表面。

1.2.3 種子成熟度對其萌發(fā)的影響 選取結(jié)莢后生長90、120、150、180 d尚未開裂的廣豆根果莢，滅菌消毒后轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 d后分別觀察種子的萌發(fā)情況并記錄。

1.2.4 叢生芽的繁殖復(fù)壯一體化培養(yǎng) 以MS+0.2 mg·L-1AC為基本培養(yǎng)基，添加不同的激素組合(6-BA 0.5～2.0 mg·L-1、KT 0～0.5 mg·L-1)及單切接入由種子萌發(fā)后的胚，在不同時間放入不同的光照強(qiáng)度(日光燈光照強(qiáng)度2000～4000 Lux)下培養(yǎng)。30 d后，觀測叢生芽生長的情況，篩選出叢生芽繁殖復(fù)壯一體化培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方。

1.2.5 生根煉苗同步化培養(yǎng) 將經(jīng)過壯苗培養(yǎng)的健壯叢芽分離成單芽，轉(zhuǎn)移到不同的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，實驗中選定1/2MS+0.2 mg·L-1AC為基本培養(yǎng)基，附加不同質(zhì)量濃度的NAA(0～1.5 mg·L-1)，生根培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計生根率[(生根苗數(shù)/外植體數(shù))×100%]和平均根數(shù)(根數(shù)/生根苗數(shù))等指標(biāo)，綜合苗的生長情況，確定最佳生根培養(yǎng)基。

1.2.6 苦參堿及氧化苦參堿含量測定 參照《中華人民共和國藥典》(2015)方法對廣豆根組培苗不同時期(0個月、移栽3個月、移栽6個月)的根部藥材進(jìn)行含量檢測，考察其有效成分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子的萌發(fā)培養(yǎng)

廣豆根種子經(jīng)消毒滅菌后播種到誘導(dǎo)萌發(fā)的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，比較發(fā)現(xiàn)，不同成熟度種子的萌發(fā)情況不同，見表1。結(jié)莢后生長90～120 d的種子，萌發(fā)需時較長(60 d以上)，生長緩慢，萌發(fā)率僅為42.5%，繁殖率低，大部分種子出現(xiàn)變黑、死亡的情況；結(jié)莢后120～150 d的種子，萌發(fā)時間短(25～40 d)，生長較快，萌發(fā)率82.8%，少量種子變黑并死亡；結(jié)莢150～180 d的種子，萌發(fā)時間最短(15 d左右)，30 d萌發(fā)率高達(dá)95.7%，且長出的芽健壯。因此，廣豆根無菌播種應(yīng)采用結(jié)莢后生長150～180 d未開裂的果莢為佳。

表1 不同成熟度種子的萌發(fā)情況

2.2 叢生芽的繁殖復(fù)壯一體化培養(yǎng)

將種子萌發(fā)獲得的叢生芽，單切轉(zhuǎn)接到不同的光照和不同配方的培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，結(jié)果表明，不同光照和不同激素組合對廣豆根的叢生芽繼代增殖和生長情況有較大的影響。從表2可以看出，叢生芽增殖主要受6-BA影響，當(dāng)激素組合為6-BA1.5 mg·L-1+IAA0.3 mg·L-1+KT0.3 mg·L-1、光照為2000 lux 15 d和4000 lux 15 d時，增殖速度快，增殖多，芽苗健壯，色較綠，展葉較好，見圖1，增殖倍數(shù)約7倍/30 d。當(dāng)激素濃度6-BA>1.5 mg·L-1、KT>0.3 mg·L-1時，叢生芽增殖速度快，但叢生芽逐漸出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，不利于下一步生根。

圖1 廣豆根叢生芽

2.3 生根煉苗同步化培養(yǎng)

將繁殖復(fù)壯一體化培養(yǎng)獲得的葉片展開、木質(zhì)化程度較高的健壯芽苗剪下，接種到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根煉苗同步培養(yǎng)，不同培養(yǎng)組合對廣豆根組培苗的生根和生長情況有較大的影響。從表3可以看出，叢生芽生根受NAA影響最大，當(dāng)NAA質(zhì)量濃度在0.5～1.0 mg·L-1時廣豆根組培苗生根率及平均生根數(shù)隨濃度的升高而提高，當(dāng)NAA質(zhì)量濃度>1.5 mg·L-1時，反而對廣豆根叢生芽生根產(chǎn)生抑制作用，添加少量IBA對廣豆根叢生芽生根有一定的促進(jìn)作用，但質(zhì)量濃度>0.5 mg·L-1時則產(chǎn)生了副作用，使芽苗生長偏細(xì)。因此，當(dāng)激素組合為NAA1.0 mg·L-1+IBA0.2 mg·L-1生根效果最好，綜合生產(chǎn)能耗及污染情況考慮，在培養(yǎng)室培養(yǎng)20 d移植煉苗大棚培養(yǎng)煉苗效果最好，廣豆根組培苗生根率高，根數(shù)多，生長良好，污染極少，見圖2。

表2 不同組合對廣豆根叢生芽繁殖的影響

表3 不同組合對廣豆根叢生芽生根煉苗的影響

注：a.培養(yǎng)室內(nèi)生根苗；b.煉苗棚內(nèi)生根苗。

圖2 廣豆根試管苗

2.4 馴化移栽

通過生根煉苗同步化培養(yǎng)，廣豆根試管苗已經(jīng)在大棚內(nèi)形成完整的植株，可直接將生根苗的瓶蓋打開，取出生根苗，洗凈根部殘留培養(yǎng)基(見圖3a)，移栽至泥炭土、碳化稻谷殼和珍珠巖的質(zhì)量比例為4∶4.5∶1.5混合后的基質(zhì)最佳。育苗要求相對濕度為75%～90%，溫度20～25 ℃，遮光度60%～75%，30 d后成活率能達(dá)到95%(見圖3b)。

注：a.清洗干凈的試管苗；b.移栽基質(zhì)的試管苗。圖3 廣豆根試管苗移栽

2.5 苦參堿及氧化苦參堿的含量檢測

采用高效液相色譜法(2015年版《中華人民共和國藥典》)對廣豆根組培苗不同時期(0個月、移栽3個月、移栽6個月)的根進(jìn)行了含量測定，檢測結(jié)果見表4。

表4 不同時期廣豆根含量 %

注：St0廣豆根組培苗；St3組培苗大棚移栽生長3個月，t6移栽生長6個月。

通過含量檢測發(fā)現(xiàn)：在組培苗階段，廣豆根就含有少量的苦參堿和氧化苦參堿；隨著生長周期的延長，含量逐步升高，移栽3個月、6個月的廣豆根組培苗的有效成分含量均符合《中華人民共和國藥典》要求，與組培苗St0個月相比，移栽后3個月、6個月的廣豆根組培苗總生物堿、苦參堿和氧化苦參堿分別提高3.9倍、4.14倍。因此廣豆根組培苗適合作為藥材種苗進(jìn)行推廣種植。

3 討論與結(jié)論

在植物組織培養(yǎng)工廠化生產(chǎn)中無菌材料的快速獲取至關(guān)重要，此項工作的成敗直接決定了整個生產(chǎn)成功與否。廣豆根無性繁殖所用的外植體主要有種子和莖段，但以種子效果最好[8-11]。實驗主要通過考察結(jié)莢后生長不同時間的廣豆根種子作為外植體滅菌后的萌發(fā)情況，廣豆根結(jié)莢后生長90～180 d以內(nèi)的種子，均能作為外植體萌發(fā)。結(jié)莢150～180 d的種子，萌發(fā)時間最短(15 d左右)，30 d萌發(fā)率高達(dá)95.7%，且長出的芽健壯。因此，廣豆根無菌播種應(yīng)采用結(jié)莢后生長150～180 d未開裂的果莢為佳。

培養(yǎng)基中外源激素的種類與濃度對植物組織培養(yǎng)非常關(guān)鍵。在本研究中，我們使用6-BA、IAA、KT以及光照進(jìn)行繁殖篩選，NAA和IBA進(jìn)行生根篩選。6-BA是在植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域一種重要的激素，可以促進(jìn)植物細(xì)胞分裂、側(cè)芽生長等[12]。KT是第一個植物激動素，也具有促進(jìn)細(xì)胞分裂的作用[13-14]IAA在植物的生長與發(fā)育上起著非常關(guān)鍵的作用，可以通過調(diào)節(jié)或影響植物的多種反應(yīng)來發(fā)揮作用[15]。在研究中筆者發(fā)現(xiàn)，如果細(xì)胞分裂素的質(zhì)量濃度超過2.0 mg·L-1，芽的增殖就會出現(xiàn)異常，如玻璃化等。如果IAA質(zhì)量濃度低于0.3 mg·L-1，葉片又不能展開，過高又使芽苗纖細(xì)，同時激動素KT濃度也不易過高，過高會加劇叢生芽玻璃化，所以確定最佳的增殖培養(yǎng)基為MS+1.5 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1IAA 和0.3 mg·L-1KT。

植物的生長受到光合作用影響[16]。在研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)室中合適時間內(nèi)提高光照強(qiáng)度促使叢生芽展葉，這就意味植物葉表面積越大，能夠獲得的光合作用越強(qiáng)[17]，從而為生長提供更多的物質(zhì)與能量；所獲得的結(jié)果就是在叢生芽繁殖階段能使叢生芽其木質(zhì)化程度提高，展葉良好，利于下一步生根。同時，通過生根煉苗同步化培養(yǎng)能有效地提升生產(chǎn)空間并節(jié)約煉苗時間，促使試管苗更好適應(yīng)移植環(huán)境，加大了移栽后的質(zhì)量及成活率。

總之，通過組織培養(yǎng)技術(shù)，建立了一種快速、有效、便捷的廣豆根種苗繁育方法。在對廣豆根組培苗進(jìn)行綜合的質(zhì)量評價后，筆者發(fā)現(xiàn)山豆根組培苗的質(zhì)量符合《中華人民共和國藥典》2015版的質(zhì)量要求，由組培苗生產(chǎn)的廣豆根藥材可以替代種子苗藥材使用。