楊曉燕，廖桂周，馬銀枝

（1.廣東省汕頭市大峰醫(yī)院1.耳鼻喉科；2.檢驗科，廣東汕頭515154）

鼻息肉（nasal polyps,NP）與上頜竇后鼻孔息肉（antrochoanal polyps, ACP）在普通人群中的總患病率為1%～4%［1］。NP 和ACP 是由于過敏或慢性炎癥導致鼻腔和鼻竇發(fā)生息肉樣改變，又被統(tǒng)稱為炎癥性鼻息肉［2］。ACP 發(fā)病率較低，只占鼻息肉的3%～6%［3］。由于ACP 發(fā)病率低，到目前為止仍未有深入研究。

NP 多來源于中鼻道竇口、鼻道復合體和篩竇，高度水腫的鼻黏膜由中鼻道、竇口向鼻腔膨出下垂而形成息肉，持續(xù)性哮喘、阿司匹林加重呼吸疾病（aspirin-exacerbated respiratory disease,AERD）或囊腫性纖維化患者中NP 發(fā)病率較高，且大部分NP 患者有過敏史［4］。此外，NP 還與慢性鼻竇感染有關［5］。鼻息肉患者平均年齡為50 歲左右［6］。組織病理學研究顯示，NP 由基質、皮下水腫及多種炎癥細胞組成；炎癥細胞超過60%是嗜酸性粒細胞，此外，還包括中性粒細胞、肥大細胞和激活T 細胞；呼吸道上皮通常并未受損，但伴有杯狀細胞增生［7］。

ACP 是原發(fā)于上頜竇、具有細長莖蒂、向后突出于鼻孔的息肉。這種息肉有其自身病理和臨床特點，一般認為它可能是區(qū)別于一般鼻息肉的另一種息肉病變。本病多發(fā)于青少年，男女發(fā)病率無差異，患者平均年齡為27 歲左右。ACP 并無伴隨性疾病或其他危險因素，過敏性疾病對ACP發(fā)病并無顯著影響［8-9］。ACP 的病理特點是極度纖維化，并含有退化的內皮細胞和間質多核巨細胞構成的大量血管。

NP 和ACP 的病因至今仍不清楚，已有眾多研究探討了NP 和ACP 的致病因素，其中就包括人類乳頭瘤病毒（human papillomavirus, HPV）［10］。HPV 感染引起宮頸癌等多種人類良惡性腫瘤性疾病，越來越多的研究還表明，口咽癌的一種亞型與高危型HPV 持續(xù)感染密切相關。

Pubmed 檢索顯示，2000 年到2016 年間，有6 項研究探討了HPV 與鼻息肉鼻竇黏膜間的相關性，這些研究結果大多相互矛盾，鼻息肉HPVDNA 含量從0%至40%，而健康對照組未檢出含病毒DNA［11］，而筆者在知網、萬方及維普國內3 大文獻庫中檢索后發(fā)現，國內尚無研究探討HPV 與NP 和ACP 的相關性。因此，本研究擬通過HPV聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）檢測NP 和ACP 息肉組織中HPV 含量，探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 組織標本來源

166 例存檔的NP 新鮮冷凍標本和39 例存檔的ACP 石蠟包埋標本來自2010 年至2016 年在汕頭市大峰醫(yī)院就診的NP 和ACP 患者。此外，本研究還收集了16 例在汕頭市大峰醫(yī)院耳鼻喉科接受ACP 手術切除的新鮮冷凍標本，16 例新鮮冷凍和31 例石蠟包埋的ACP 標本中，有8 例重合。另收集52 例正常鼻甲（nasal turbinates,NT）標本作為對照。收集所有受試者性別、年齡、吸煙/飲酒和過敏性疾病情況，本研究經汕頭市衛(wèi)計委醫(yī)學倫理委員會批準同意，所有受試者知情同意。

1.2 DNA 提取

石蠟包埋標本基因組DNA 提取采用江蘇碧云天公司的基因組提取試劑盒（Cat No：DP331），新鮮冷凍標本中DNA 分離和純化采用德國QiagenDNA 提取試劑盒（Cat No：51304）。采用Nanodrop 2000 檢測DNA 濃度，并將DNA 濃度調整為50～200 ng/μl。

1.3 DNA 檢測和HPV 分型

分別采用3 種PCR 擴增方法檢測HPV：GP5+/6+擴增法（使用GP5+/6+通用引物對）主要用于新鮮冷凍和石蠟包埋標本HPV 檢測、短PCR片段（short PCR fragment,SPF）擴增法（使用擴增HPV L1 基因片段的通用引物對）特異性用于石蠟包埋標本HPV 檢測、巢式多重聚合酶鏈式反應（nested multiplex PCR, NMPCR） 擴增法（使用MY9/11 通用引物對）主要用于檢測從新鮮標本中提取的gDNA。GP5+/6+擴增法、SPF 擴增法及NMPCR 擴增法檢測陽性結果標本，進一步采用HPV11 和HPV16 特異性引物檢測HPV11 和HPV16。

1.4 免疫組化

鼠抗人HPV16 E6/18 E6（C1P5）抗體（產品編號：sc-460）和p16（JC8）（產品編號：sc-166760）購自美國Santa Cruz 公司；通用型SP 試劑盒和DAB 顯色試劑盒均由北京中杉生物科技有限公司提供。免疫組織化學采用SP 法，染色步驟按照試劑盒說明書進行。以PBS 代替一抗作陰性對照，DAB 顯色，光鏡下觀察陽性細胞。在清晰的背景上出現特異性棕黃色顆粒者為陽性，陰性對照無特異性著色。

1.5 蛋白質免疫印跡

采用江蘇碧云天公司生產的組織總蛋白抽提試劑盒抽提新鮮凍存的AP 和ACP 組織總蛋白，將上清液轉移入新的離心管中保存待用；BCA 蛋白定量方法檢測蛋白濃度；SDS-PAGE 電泳方法電泳分離；將蛋白分離產物轉移至PVDF 膜上，以高親合力一抗p16（JC8）孵育，再加入二抗；ECL 顯色；掃描儀掃描，用ImageJ 分析軟件將掃描圖片保存為電腦文件，以內參為對照。

1.6 統(tǒng)計學方法

所有數據用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件進行處理，采用Kruskal-Wallis 檢驗和事后多重比較、曼-惠特尼U 檢驗和χ2檢驗分析NP 和ACP 組間性別、吸煙、飲酒、過敏情況及HPV 狀態(tài)間的差異，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同鼻黏膜組織中HPV 的陽性率

提取257 例（166 例NP，39 例ACP 和52 例NT）組織樣本gDNA，并采用3 種GP5+/6+擴增法、SPF 擴增法及NMPCR 擴增法檢測組織中HPV分布情況，結果顯示，NP、ACP 和NT 中HPV 檢出率分別為15.1%、53.8% 及5.8%，ACP 組HPV檢出率均顯著高于NP 和NT 組（均P＜0.001），而NP 和NT 組檢出率差異無統(tǒng)計學意義（P=0.08），見表1。

NP 組中HPV 亞型分布情況為：高風險型HPV16 占76%、高風險型HPV56 占8%、低風險型HPV11 占8%、HPV11/16 共感染型占8%。ACP組中HPV 亞型分布情況為：高風險型HPV16 占61.9%、低風險型HPV11 占14.3%、HPV11/16 共感染型占23.8%。NT 組中HPV16、HPV11 和HPV11/16 共感染分布相當。

2.2 HPV 陽性NP 和ACP 標本中HPV 16 E6 蛋白表達情況

不連續(xù)細胞簇染色陽性的NP 和ACP 組織中，HPV 16 E6 蛋白局限表達于上皮細胞（圖1A）。ACP 組織中，HPV 16 E6 蛋白主要表達于上皮細胞胞核和胞漿，提示分層和纖毛退化等上皮細胞改變。而上皮細胞層中，HPV 16 E6 蛋白主要表達于中間和頂端細胞層，很少表達于基底細胞層?；准毎麑佑山Y構堅固的纖維組織構成，可見少量炎性細胞浸潤（圖1B 和1C）。NP 組織中，HPV 16 E6 蛋白陽性信號在所有細胞層的胞漿及胞核內均可檢測到，無明顯強表達區(qū)域，且未發(fā)現分層和纖毛退化等上皮細胞改變（圖1D 和1E）。

表1 ACP、NP 和正常鼻甲組織中HPV 檢測率及亞型分布情況 例（%）

圖1 HPV 免疫組化染色（×200）

2.3 p16 在HPV 陽性ACP 組織中的表達

與HPV16 E6 蛋白主要表達于上皮細胞層不同的是，p16 主要表達于細胞核內（圖2），此外，只有5 例HPV-DNA 強陽性ACP 組織中p16 陽性表達，而在NP 和NT 組織中p16 陰性表達。

圖2 p16 免疫組化染色（×200）

2.4 蛋白質免疫印跡檢測ACP 和NP 組織中p16表達

蛋白質免疫印跡檢測結果顯示，HPV 陰性口咽癌組織中p16 陰性表達，而HPV 陽性ACP 組織中可見p16 弱表達，提示p16 在HPV 陽性ACP 組織中表達升高。NP 和NT 組織中無論HPV 表達與否p16 陰性表達（圖3）。

2.5 HPV 狀態(tài)與臨床參數的關系

NP 和ACP 患者性別比分別為2∶1 和1∶1，差異無統(tǒng)計學意義，兩組患者年齡分別差異有統(tǒng)計學意義（H=48.07,P=0.0001）。此外，NP 和ACP的年齡差異與NP 和NT 的年齡差異類似（圖4）。但是，HPV 陽性或HPV 陰性ACP 和NP 患者間年齡分布差異無統(tǒng)計學意義。NP 和ACP 患者吸煙和過敏史間差異均存在有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），同樣，HPV 陽性或HPV 陰性ACP 和NP 患者吸煙、飲酒和過敏史間差異均無統(tǒng)計學意義，見表2。

圖3 蛋白質免疫印跡檢測ACP 和NP 組織中p16 表達

圖4 ACP 和NP 年齡分布比較

表2 3 種組織類型HPV 狀態(tài)與臨床參數的關系

3 討論

本研究主要探討HPV 在NP 和ACP 中的分布情況及其臨床意義，本次研究包括166 例新鮮冷凍NP 標本、39 例ACP 標本和52 例正常鼻甲標本，在國內該領域研究中屬于較大樣本量研究。以往類似幾項研究包含的NP 樣本數20～48 例［12］，中國學者PEI 等［13］以204 例NP 石蠟標本為研究對象，分析了中國NP 人群中HPV 感染情況。大多數研究均以10～36 例正常黏膜作為對照，曾有一項研究以85 例肥大鼻甲作為研究對照。

總體來說，目前關于HPV 感染與NP 關系的研究結果并不一致，NP 中HPV 的感染率從0%到50%不等。兩項來自我國的研究分別顯示，NP 患者中HPV 感染率分別為0%和40%［14］。兩項來自德國的研究未能發(fā)現鼻息肉中HPV 感染，意大利研究小組發(fā)現20 例NP 樣本中HPV 感染率為50%，另一希臘研究小組的結果與本研究相似，即NP 中HPV 感染率為13%，相鄰鼻甲感染率為4%［15］。本研究還顯示ACP 中HPV 感染率為53.8%，這表明HPV 在ACP 中的感染率高于NP和NT。

近來一項研究顯示，感染NP 的HPV 既包括高危型，又包括低危型，其中75% 為單一感染。NP 中HPV 感染常見的亞型是低危HPV11 型，占45.28%；其次是高危HPV58 型，占16.04% 以及高危HPV52 型，占10.38。2009 年ZARAVINOS等檢測了NP 中HPV 6、11、16、18、33 亞型感染情況，結果均為陰性。因此，本研究發(fā)現ACP 和NP 中最主要的HPV 感染亞型是高危的HPV16 型，與以往其他研究不一致。

HPV 檢測的常用方法是MY09/11 PCR 法能夠用于檢測冷凍標本以及石蠟包埋標本，此外，GP5+/6+PCR 法、HPV 流式法和基因芯片法也可用于HPV 檢測。由于使用不同DNA 檢測方法時未適應不同的固定方法并提供最大確定性，筆者精心挑選了PCR 試驗法。例如，在口咽癌中經過長期檢驗的普通PCR 試驗GP5+6/+已被證明比MY09/11 PCR 試驗更靈敏，特別是對低病毒載量的樣品來說。在筆者的研究中對所有標本均應用了GP5+6/+PCR 試驗，針對L1 基因的140 個堿基對。與HPV 相關的口咽癌中發(fā)現的高病毒載量相比，HPV 陽性鼻息肉中只有低拷貝數。為了進一步提高靈敏度，尤其在檢測假定低病毒載量并確認第一個結果，通過NMPCR 得到了未測序時的同步HPV 類型識別優(yōu)勢。

檢測HPV 感染誘發(fā)惡性轉化的標準方法是p16 免疫組織化學和人乳頭狀瘤病毒檢測。p16 高表達及E7 基因產物導致pRb 失活是惡性腫瘤中HPV 感染的標志性事件［16］。p16-IHC 在這里表現出的不確定結果非常輕微，主要細胞核內的信號在強HPV 陽性上頜竇后鼻孔息肉的上皮細胞內。隨后進行p16 蛋白質印跡，表明與鼻甲相對比，鼻息肉和上頜竇后鼻孔息肉上無表達p16 顯著升高。HPV 引起的惡性腫瘤中未出現致癌p16 負轉錄調控也被證實正受到積極控制，這與IHC 中的強p16 染色以及蛋白質印跡中的強條帶相一致。p16-IHC 陽性案例以及上頜竇后鼻孔息肉上蛋白質印跡上p16 數量略有升高更可能由于有同步炎癥而不是由于HPV 引起的失調。

V16-E6-IHC 還不算是一種標準方法，只能提示病毒轉錄活動［17］。HPV16 E6 蛋白質似乎需要建立基因組并在宿主細胞維持染色體外的核質粒［18］。結果展示了較弱的細胞核內信號和細胞質信號，指出病毒存在于轉錄活動水平低的細胞中。未假定高轉錄活性會導致致癌性轉換。但可能的上皮變化會隨著分層和纖毛退化被誘導。細胞集群的不連續(xù)染色可以被視為入侵區(qū)。也許上皮損傷會促進感染和病毒建立。被染色為HPV16 陽性的鼻息肉的基底膜附近的細胞可能是HPV 陽性上皮細胞轉移至基質或僅轉移至人工染色的牙齦炎癥細胞上。為了進一步調查，基底膜染色是證明其完整性的有力候選方法。

筆者的數據報告符合現有文獻中有關鼻息肉和上頜竇后鼻孔息肉上年齡和性別分布的發(fā)現［19］。對臨床病理數據的統(tǒng)計分析證實，無論是年齡和性別、吸煙或飲酒還是有過敏背景都與人乳頭瘤病毒狀態(tài)無關［20］。目前沒有證據表明HPV 在鼻息肉上感染及其過程存在因果關系，特別是通過PCR 和序列分析證明僅存在人乳頭瘤病毒（HPV DNA）。為了確定一個生物活性，必須驗證HPV感染病毒的轉錄活動。p16-IHC、蛋白質印跡以及HPV16-E6-IHC 的結果證明該感染具有活性，并可能誘發(fā)增殖，但仍難以確定并解釋。這可能是由于相較于頸或口咽癌，鼻息肉和上頜竇后鼻孔息肉上的低病毒載量?，F有的替代標志物p16 與鼻息肉無相關作用。HPV16-E6-IHC 結果也指出，鼻息肉上無相關HPV 轉錄活性。E6/7 致癌基因的RNA 檢測被認為是證明頸椎和口咽癌轉錄活性的高靈敏度方法。其中一個重要問題是，似乎只有高病毒載量的腫瘤表達E6/7 mRNA，意味著這是一個致病原因。這也與本研究中第一次的E6/7 mRNA qPCR 結果相一致。HPV 陽性鼻息肉和上頜竇后鼻孔息肉未表達可檢測的E6/7 mRNA，假定也未參與對其病情的發(fā)展。

總的來說很難比較不同研究中HPV 在鼻竇息肉病上的不同患病率，其原因是由于如品種、地理區(qū)域、實驗室技術、組織固定方法、樣本數量和控制等不同因素。本文給出的結果清楚地表明HPV 與鼻息肉存在關聯關系，雖然關聯程度不比與上頜竇后鼻孔息肉密切。在這兩種情況中，此類關聯似乎并沒有促進增殖或實際上促進致癌基因轉化，并且此關聯并不是鼻息肉和上頜竇后鼻孔息肉病情發(fā)展的誘發(fā)因素。