徐懿，宋堃

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院1.眼科；2.普通外科，湖南長(zhǎng)沙410008）

胰腺癌作為消化道腫瘤中致死率極高的腫瘤之一，在癌癥人數(shù)中排名第四位［1］。胰腺癌的危險(xiǎn)因素很多；由于其起病隱蔽，患者在早期因無(wú)癥狀鮮少于醫(yī)院就診，使胰腺癌早期檢出率極低。雖然經(jīng)過(guò)多年的基礎(chǔ)與臨床研究，但晚期胰腺癌的預(yù)后仍然差強(qiáng)人意。

PLCε1 作為磷脂酶C（phospholipase C, PLC）蛋白家族中的不可忽視的部分，對(duì)于磷酸肌醇為基礎(chǔ)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有不可或缺的作用。研究證實(shí)PLCε1 參與磷酸肌醇信號(hào)通路的調(diào)控，水解磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate, PIP2）后生成三磷酸肌醇（inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3）和二酰甘油（diacyl glycerol,DAG），二者作為細(xì)胞信使參與信號(hào)通路和相關(guān)細(xì)胞機(jī)制的調(diào)節(jié)［2］。同時(shí)，PLCε1 可通過(guò)IP3活化鈣離子通路信號(hào)，并在生成DAG 后激活蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）從而進(jìn)一步參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、應(yīng)激和凋亡。凋亡機(jī)制在器官成熟、人體發(fā)育的過(guò)程中有非凡的意義［3］。凋亡是機(jī)體清除腫瘤的一種重要方式。凋亡機(jī)制受到眾多基因、蛋白、micRNA 的調(diào)控，該機(jī)制的平衡被打破，如促進(jìn)腫瘤凋亡可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，反之則誘發(fā)腫瘤產(chǎn)生。針對(duì)凋亡機(jī)制相關(guān)的調(diào)控基因，人們已經(jīng)展開(kāi)了對(duì)B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）家族基因的許多研究，而B(niǎo)cl-2 是抑制凋亡的重要蛋白［4］。Bcl-2 主要參與線(xiàn)粒體凋亡途徑（內(nèi)源性凋亡途徑）的調(diào)控，抑制凋亡［5］。凋亡的始動(dòng)分子BAK、BAX 是BH3 結(jié)構(gòu)域蛋白的效應(yīng)分子。BAK、BAX 引起線(xiàn)粒體外膜構(gòu)象變化，是啟動(dòng)凋亡的重要步驟，而B(niǎo)cl-2 可以有效地抑制二者的活性［6］。Bcl-2 從被發(fā)現(xiàn)起，在腫瘤中它的過(guò)表達(dá)都預(yù)示著不良的預(yù)后。PLCε1 對(duì)鈣離子信號(hào)-凋亡通路的調(diào)節(jié)有重要作用，可能與Bcl-2 在凋亡的調(diào)控上存在交集，相互影響。

近年的多項(xiàng)研究認(rèn)為PLCε1 與多種腫瘤有關(guān)，這讓PLCε1 逐漸成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注并感興趣的一個(gè)研究領(lǐng)域。這些研究發(fā)現(xiàn)PLCε1 通過(guò)多途徑、多通路在惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中扮演重要角色。PLCε1 在食管癌組織中的高表達(dá)可能與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤進(jìn)展有關(guān)聯(lián)［7］。ZHAI 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，使用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除PLCE1 基因，能降低胞質(zhì)中轉(zhuǎn)錄因子snail 的水平從而抑制細(xì)胞遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）發(fā)生。在對(duì)PLCε1 的不斷研究中，眾多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)，PLCε1 基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌、食管癌、胃癌多種惡性腫瘤罹患風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，并且影響其發(fā)生、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后［9-11］。ras 基因?qū)τ谝认侔┣橛歇?dú)鐘，有研究證明超過(guò)80%的這種惡性腫瘤存在K-ras 突變［12］。PLCε1 與ras 基因的關(guān)系十分密切，與ras 家族成員有雙向作用。PLCε1 含有特異性的RA 區(qū)（Ras-associating domains），可與ras 家族的多種蛋白相結(jié)合。PLCε1 又被認(rèn)為是ras 家族的直接下游效應(yīng)分子之一［13］。因此，PLCε1或許也參與對(duì)胰腺癌的調(diào)控。

在PLCε1 被研究證實(shí)可能成為腫瘤預(yù)防治療潛在靶點(diǎn)的同時(shí)，眾多學(xué)者還發(fā)現(xiàn)PLCε1 可以通過(guò)上調(diào)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）、白細(xì)胞介素4（IL-4）等多種炎癥因子促進(jìn)炎癥風(fēng)暴。在缺血再灌注小鼠模型中檢測(cè)到PLCε1 表達(dá)增加，通過(guò)NF-κB 影響下游IL-6、TNF-α、IL-1 等多種炎癥因子的表達(dá)，加重再灌注時(shí)的心肌損害［14］。研究提示血管生成是癌變和腫瘤增殖等病理生理過(guò)程中不可或缺的部分，絕大多數(shù)新生血管病理過(guò)程與炎癥有關(guān)［15］。

由此看來(lái)，PLCε1 對(duì)ras、腫瘤有重要調(diào)節(jié)作用，與Bcl-2 在凋亡機(jī)制調(diào)節(jié)中可能有共同的通路或調(diào)節(jié)機(jī)制?？墒窃谝认侔┑难芯恐絮r有關(guān)于PLCε1 的報(bào)道，PLCε1 在胰腺癌中具體作用、相關(guān)機(jī)制都不明確，所以筆者嘗試從PLCε1 的表達(dá)入手，探索它和胰腺癌潛在的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器

可調(diào)溫烤箱DHP060 型（上海）；光學(xué)顯微鏡102 型（Olympus 公司）；冰箱（西門(mén)子公司）；可調(diào)微量移液器（Eppendorf 公司）。組化試劑盒（KIT-5020，羊抗鼠/兔，福州邁新公司）；一抗：兔抗人PLCε1 多克隆抗體（美國(guó)Abcam 公司，產(chǎn)品編號(hào)：ab121476），兔抗人Bcl-2 多克隆抗體（美國(guó)Abcam 公司，產(chǎn)品編號(hào)：ab7973）；DAB 試劑盒、EDTA 抗原修復(fù)液（博士德生物工程有限公司），本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)資料 收集中南大學(xué)湘雅醫(yī)院確診為胰腺癌患者（2013 年1 月至2016 年12 月）的腫瘤組織標(biāo)本69 例作為腫瘤組。另外收集特殊肝、腎移植手術(shù)供體的正常胰腺組織標(biāo)本11 例作為研究對(duì)照組。

1.2.2 免疫組化檢測(cè) 按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。PLCε1 一抗的稀釋濃度為1∶400，Bcl-2 一抗的稀釋濃度為1∶400。二抗稀釋濃度為1∶10。

收集整理患者信息、臨床病例資料。針對(duì)性選取所需組織蠟塊（胰腺癌腫瘤/正常胰腺組織），切片脫蠟切片水化、抗原修復(fù)、H2O2去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；PLCε1 和Bcl-2 免疫組化染色，血清封閉、滴加一抗過(guò)夜孵育、二抗孵育等步驟。

1.3 結(jié)果判讀

雙盲法閱讀玻片。PLCε1、Bcl-2 陽(yáng)性著色在胰腺癌細(xì)胞胞漿內(nèi)，呈棕黃色（PLCε1 和Bcl-2 分別圖1、圖3）。參考KOHLBERGER 的［16］免疫反應(yīng)評(píng)分（immunoreactivity score, IRS）法評(píng)分：記錄染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)得分，兩者相乘后獲得最終得分，根據(jù)得分情況分為陰性“-”、弱陽(yáng)性“+”、中強(qiáng)陽(yáng)性“++”、強(qiáng)陽(yáng)性“+++”。0 分表示（-），1 分表示（+），2～4 分表示（++），＞4 分表示（+++）。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%：0 分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%～30%：1 分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)31%～60%：2 分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞60%：3 分。陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度：淡黃色1 分，黃色2 分，棕黃色3 分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。腫瘤組與對(duì)照組中PLCε1 和Bcl-2 各自的表達(dá)差異以及不同臨床特征分組內(nèi)的分析采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法；二者各自表達(dá)強(qiáng)度在臨床及病理學(xué)特征組之間的分析使用非參數(shù)兩獨(dú)立樣本檢驗(yàn)；二者染色強(qiáng)度之間的關(guān)系使用雙因素相關(guān)分析法。

2 結(jié)果

2.1 PLCε1 與Bcl-2 在腫瘤組和對(duì)照組中的表達(dá)

PLCε1 和Bcl-2 主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿內(nèi)。69例患者的腫瘤組織中有58 例PLCε1 表達(dá)陽(yáng)性（見(jiàn)圖1），占84.1%，11 例為陰性（見(jiàn)圖2），占15.9%；Bcl-2 在59 例腫瘤組織中為陽(yáng)性表達(dá)，占85.5% （見(jiàn)圖3），10 例為陰性（見(jiàn)圖4），占14.5%。在11 例對(duì)照組中，4 例PLCε1 表達(dá)為陽(yáng)性，7 例為陰性；Bcl-2 有 3 例是陽(yáng)性表達(dá)，其他8 例呈陰性。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤組與對(duì)照組之間的 PLCε1 表達(dá)和 Bcl-2 表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P1＜0.05,P2＜0.05）（見(jiàn)表1）。提示在胰腺癌組織中 PLCε1 和 Bcl-2 的表達(dá)強(qiáng)于正常胰腺組織。

2.2 腫瘤組中 PLCε1 與 Bcl-2 與臨床病理特征的關(guān)系

在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組內(nèi)，PLCε1 和 Bcl-2 各自表達(dá)明顯不同（P=0.016 和P=0.029）。對(duì)于其他分組而言差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示 PLCε1和 Bcl-2 可能與細(xì)胞遷移、轉(zhuǎn)移有關(guān)（見(jiàn)表2）。

2.3 腫瘤組中 PLCε1 和 Bcl-2 的染色強(qiáng)弱與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 （Mann-Whitney 檢驗(yàn)） 發(fā)現(xiàn)，腫瘤大小組間和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間的 PLCε1 和 Bcl-2的表達(dá)強(qiáng)弱程度有差異，其余分組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （見(jiàn)表3）。結(jié)果提示，對(duì)于腫瘤＞5 cm 并存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，其 PLCε1 和 Bcl-2會(huì)有更多的陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

表1 腫瘤組與對(duì)照組PLCε1 和Bcl-2 表達(dá)

表2 腫瘤組PLCε1 和Bcl-2 的表達(dá)情況 例

2.4 腫瘤組PLCε1 和Bcl-2 染色程度的關(guān)系

將PLCε1 和Bcl-2 在腫瘤組織中的染色得分賦值，陰性為0；弱陽(yáng)性為1；陽(yáng)性為2；強(qiáng)陽(yáng)性為3。腫瘤組中PLCε1 與Bcl-2 的染色強(qiáng)度相關(guān)性分析顯示，二者強(qiáng)度呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r=0.639,P=0.000）。

圖1 胰腺癌組織中的PLCε1 的陽(yáng)性染色圖

圖2 正常胰腺組織PLCε1 陰性染色圖（×400）

圖3 胰腺癌組織中Bcl-2 的陽(yáng)性染色圖

3 討論

圖4 正常胰腺組織Bcl-2 陰性染色圖（×400）

PLCε1 是重要的信號(hào)調(diào)節(jié)分子，涉及到多種細(xì)胞機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)PKC 對(duì)胰腺癌有促進(jìn)作用［17］。PLCε1 能通過(guò)NF-κB 和VEGF-C/Bcl-2 兩條信號(hào)通路，促進(jìn)食管癌新生血管生成和細(xì)胞增殖［18］。還有microRNA 研究顯示，MiR-34a 能特異性降低PLCε1 mRNA 水平，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移［19］。Snail、PKCα/NF-κB 通路也可以受PLCε1 調(diào)控，增加腫瘤細(xì)胞分裂，促進(jìn)轉(zhuǎn)移發(fā)生［8，20］。這些研究顯示PLCε1 能夠通過(guò)下游信使發(fā)揮促瘤作用。不僅如此，PLCε1 還對(duì)ras 家族具有雙向調(diào)節(jié)作用，可以被其激活，也可以作為其下游效應(yīng)分子。眾所周知，ras 家族成員對(duì)腫瘤有重要促進(jìn)作用。隨著對(duì)ras 基因家族研究的逐步深入，研究者發(fā)現(xiàn)近30%的腫瘤內(nèi)存在ras 基因的突變，且在胰腺癌中更為突出（超過(guò)80%），并涉及到其發(fā)展的各個(gè)時(shí)期進(jìn)行研究［21-22］。Bcl-2 家族非常龐大，根據(jù)對(duì)凋亡調(diào)控的正負(fù)不同作用可將其分為兩個(gè)集團(tuán)。BAK、BAX 與單BH3 結(jié)構(gòu)域的分子合集對(duì)凋亡進(jìn)行正向調(diào)控，這其中包含了BAD、BIK、BMF 等。而B(niǎo)cl-2 及其衍生分子在細(xì)胞凋亡研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)凋亡有負(fù)向調(diào)控作用。多種分子蛋白相互之間有激活或抑制的作用，使的復(fù)雜的凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中正、負(fù)效應(yīng)之間達(dá)到平衡。而某種或多種作用導(dǎo)致平衡被打破，Bcl-2 過(guò)表達(dá)，細(xì)胞凋亡抑制，是腫瘤發(fā)生的始動(dòng)因素以及促進(jìn)因素中十分重要的部分［3，6，23］。

從筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，PLCε1 在腫瘤組中的表達(dá)顯著強(qiáng)于對(duì)照組，筆者推測(cè)它可能有促進(jìn)胰腺癌的作用。這與其他學(xué)者研究中PLCε1扮演著促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的角色相符合。根據(jù)腫瘤組的結(jié)果，僅針對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，PLCε1 和Bcl-2 的染色情況存在差異，這意味著PLCε1 可能直接或間接參與某些促進(jìn)胰腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制。對(duì)于腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組，PLCε1 和Bcl-2 的表達(dá)程度均存在顯著差異。這意味著如果腫瘤超過(guò)5 cm或者存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，腫瘤組織中會(huì)有更多的PLCε1 和Bcl-2。這可能是因?yàn)镻LCε1 和Bcl-2 與胰腺癌的轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)相關(guān)。LAD 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，H-ras 可通過(guò)PLCE 抑制整合素產(chǎn)生，增加細(xì)胞的不穩(wěn)定性，使其易于移動(dòng)、擴(kuò)散。OU 等［10］研究中發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌中降低PLCε1 表達(dá)后，膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力會(huì)受到抑制。

除了DAG，PLCε1 產(chǎn)生的另一個(gè)信使—IP3，可調(diào)節(jié)鈣離子信號(hào)通路［25］。IP3可以對(duì)IP3R 進(jìn)行激活，并活化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣離子通道，從而達(dá)到提高細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的效果。此時(shí)線(xiàn)粒體得到響應(yīng)，外膜上的鈣離子通道被激活，攝入胞質(zhì)內(nèi)過(guò)載的鈣離子，從而增加細(xì)胞質(zhì)與線(xiàn)粒體內(nèi)兩個(gè)部位的鈣離子濃度［26］，并活化多種與鈣離子相關(guān)的酶，如Calpain、NOS 等。這些酶活化后可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)凋亡［27］。研究表明細(xì)胞凋亡需要IP3調(diào)節(jié)的鈣離子通路參與，而PLCε1 可以影響IP3調(diào)節(jié)，從而影響細(xì)胞凋亡。但是，這似乎與PLCε1 被發(fā)現(xiàn)的促瘤作用有些相矛盾。在胸腺瘤相關(guān)的報(bào)道中［28］表示，IP3對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上IP3R 的激活作用可以被Bcl-2 阻斷。XU［29］等在乳腺癌的研究中證明，Bcl-2 通過(guò)與IP3R 競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合，抑制鈣離子釋放，進(jìn)而抑制線(xiàn)粒體凋亡途徑。還有研究提示Bcl-2 能通過(guò)BH4 片段阻斷IP3R 受體［30］。對(duì)腫瘤組織中PLCε1 與Bcl-2 染色進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩個(gè)蛋白染色呈正相關(guān)。所以筆者推測(cè)，Bcl-2 在胰腺癌組織中高表達(dá)，然后通過(guò)多種機(jī)制，干擾PLCε1 對(duì)鈣離子通路的調(diào)節(jié)，兩者協(xié)同地促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

綜上，對(duì)于胰腺癌患者，其胰腺組織中PLCε1和Bcl-2 的表達(dá)高于正常胰腺組織，兩者可能與胰腺癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。而PLCε1 和Bcl-2 在胰腺癌表達(dá)中密切相關(guān)，提示兩者可能共同參與胰腺癌內(nèi)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。