胡興旺，謝雅琳，龍娟，周磊，陳旺青，鄧智利

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 1.感染病科/病毒性肝炎湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.皮膚科/銀屑病湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

CD147（cluster of differentiation 147）又名細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN），是免疫球蛋白超家族的一種多重糖基化修飾的單次跨膜蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約50～60 kDa［1］。CD147 于心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和皮膚等器官中的多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)；也可以通過剪切從細(xì)胞膜脫落下來，或通過微囊泡分泌從而游離進(jìn)入組織液和血液［2］。作為1 型整合膜受體，可以與親環(huán)素、PfRh5、整連蛋白等結(jié)合，參與細(xì)胞間的識(shí)別、免疫調(diào)節(jié)、器官發(fā)育、病毒感染等多種生物學(xué)過程［3］。例如：CD147 可以通過核轉(zhuǎn)錄因子-kB（nuclear transcription factor kappa B, NF-kB）信號(hào)通路調(diào)節(jié)α4 整連素表達(dá)從而影響免疫細(xì)胞的黏附和識(shí)別［4-5］。通過調(diào)節(jié)下游基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）基因，在精子發(fā)生過程中影響生殖細(xì)胞的遷移、生存或凋亡［6］，通過調(diào)節(jié)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（monocarboxylate transporters,MCTs）影響乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)［7］。

在腫瘤中，CD147 與多種腫瘤包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌等的發(fā)生、發(fā)展、病理分級(jí)、治療預(yù)后密切相關(guān)。其機(jī)制主要涉及3 個(gè)方面，首先CD147 作為MMPs 上游強(qiáng)力誘導(dǎo)因子作用于整合素α3β1、絲裂原活化蛋白等，極大提高M(jìn)MPs 酶的水平和活性，提高基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)降解速率，大幅促進(jìn)腫瘤的增殖和侵襲［8］。其次，它可通過PI3K-AKT 等多種途徑誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）產(chǎn)生，促進(jìn)腫瘤血管生成［9］。最后可以通過調(diào)節(jié)糖酵解等代謝途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［10］

CD147 在皮膚細(xì)胞尤其是表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中高表達(dá)，CD147 在白細(xì)胞介素22（interleukin 22, IL22）誘導(dǎo)的皮膚銀屑病［11］、系統(tǒng)性紅斑狼瘡［12］中起關(guān)鍵作用。在皮膚腫瘤中，CD147 可通過調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，參與黑色素瘤細(xì)胞生存和增值［13］。抑制CD147 后可以降低胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白 2 （insulin-like growth factor binding protein 2,IGFBP2）表達(dá)從而誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞的凋亡［14］。細(xì)胞核定位的CD147 可以通過與RING1相互作用抑制其轉(zhuǎn)錄活性從而抑制黑色素瘤細(xì)胞的遷移能力［15］。TRAF6 可以通過抑制CD147 的泛素化，促進(jìn)其在細(xì)胞膜上的招募和定位［16］，從而參與表皮生長(zhǎng)因子受體（epithelial growth factor receptor,EGFR）信號(hào)通路激活［17］，促進(jìn)了黑色素瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。因此諸多證據(jù)都提示抑制 CD147 可以作為開發(fā)新的黑色素瘤治療策略的靶標(biāo)基因［18］。

最新研究表明 CD147 與干細(xì)胞存在密切聯(lián)系，如 CD147 可被人胚胎干細(xì)胞抗體識(shí)別，是干細(xì)胞的潛在標(biāo)志基因［19］。有證據(jù)證實(shí)，CD147 的表達(dá)水平與角質(zhì)形成細(xì)胞的分化程度呈負(fù)相關(guān)［20］。干擾 CD147 表達(dá)后，皮膚角質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)志基因角蛋白 keratin10 表達(dá)上調(diào)［21］。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)CD147 的表達(dá)與毛囊活動(dòng)相關(guān)，提示CD147 可能在皮膚毛發(fā)生成和皮膚干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中扮演重要角色，因此本研究構(gòu)建了 CD147 過表達(dá)小鼠，并對(duì)CD147過表達(dá)后的小鼠皮膚毛發(fā)生成和皮膚創(chuàng)傷修復(fù)能力進(jìn)行了觀察，研究結(jié)果顯示 CD147 改變毛發(fā)形成的模式，并削弱皮膚創(chuàng)傷修復(fù)能力。這一研究為更好地理解和闡明 CD147 在皮膚中的功能提供了現(xiàn)實(shí)依據(jù)，也為開發(fā)以 CD147 為靶標(biāo)的皮膚外用藥物提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

CD147 抗體 （貨號(hào) sc-9757） 購(gòu)自 Santa Cruz,CD34+抗體（貨號(hào) 14-0349-82）購(gòu)買自 eBioscience,DAPI （貨號(hào) 28718-90-3）、BrdU （貨號(hào) 19-160）和抗 BrdU 抗體 （貨號(hào) B8434） 購(gòu)自 Sigma。熒光二 抗 Alexa Fluor?488 （貨 號(hào) A-10684）、 Alexa Fluor?555 （貨號(hào) A-21432）購(gòu)買自 Invitrogen。

CD147 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠委托上海南方模式動(dòng)物所構(gòu)建，采用受精卵注射隨機(jī)插入的技術(shù)方案將外源 CAG 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的鼠源 CD147 基因片段導(dǎo)入小鼠中，經(jīng)過鼠尾 DNA 提取和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR） 法鑒定篩選建系，獲得全身穩(wěn)定過表達(dá) CD147 小鼠品系。動(dòng)物繁殖與試驗(yàn)在中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行，所有操作均經(jīng)過中南大學(xué)湘雅醫(yī)院倫理委員會(huì)審批并遵從相關(guān)動(dòng)物倫理?xiàng)l例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體重、身長(zhǎng)測(cè)量 小鼠出生開始，每天使用托盤天平進(jìn)行稱重，并使用軟尺測(cè)量身長(zhǎng)增長(zhǎng)情況（鼻尖至尾尖）。16 d 測(cè)量完畢后，取鼠尾提取 DNA，進(jìn)行 PCR 基因型鑒定，并依照鑒定結(jié)果對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行分類和分析。

1.2.2 皮膚組織石蠟包埋和 HE 染色 取 0.5 cm2背部皮膚組織，4% 多聚甲醛固定 24 h，按照標(biāo)準(zhǔn)程序經(jīng)過梯度乙醇脫水、透蠟后石蠟包埋，組織切片機(jī)中0.8 m 厚度切片。組織薄片攤片機(jī)展開后吸附于陽(yáng)離子處理的載玻片上，晾干保存。HE 染色前，取出60℃烘烤2 h，二甲苯或松節(jié)油脫蠟2 次每次10 min，梯度乙醇復(fù)水后蘇木素溶液染色數(shù)分鐘，流水適當(dāng)沖洗后氨水反藍(lán)，隨后梯度酒精脫水伊紅染色1 min，無(wú)水乙醇清洗后二甲苯透明，最后中性樹脂封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 小鼠多輪脫毛 小鼠脫毛后干細(xì)胞激活，7 d后小鼠毛發(fā)完全進(jìn)入生長(zhǎng)期。21 d 后進(jìn)入靜息期。因此以28 d 為一個(gè)周期，對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行9 輪脫毛。小鼠經(jīng)麻醉后，使用毛刷按照小鼠背部毛發(fā)生長(zhǎng)方向?qū)⑷诨囊簯B(tài)石蠟均勻地刷布于整個(gè)背部。室溫冷卻約3 min 后石蠟?zāi)?，從尾部開始逆毛發(fā)生長(zhǎng)方向輕輕撕扯，背部毛發(fā)即可隨石蠟剝脫。如局部毛發(fā)脫不干凈，可重復(fù)以上操作一次。

1.2.4 創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn) 小鼠腹腔注射麻醉劑麻醉后，按照上述方法對(duì)背部皮膚進(jìn)行脫毛，隨后使用酒精和絡(luò)合碘清潔消毒裸露皮膚。使用6 mm 直徑孔徑打孔器進(jìn)行創(chuàng)傷造口。最后分別于創(chuàng)傷造口之后的1，3，5，7，9，11 d 使用游標(biāo)卡尺對(duì)皮膚傷口直徑進(jìn)行測(cè)量并統(tǒng)計(jì)分析，非圓形傷口直徑定義為（長(zhǎng)+寬）/2。

1.2.5 冷凍切片與免疫熒光染色 采集0.5 cm2小鼠皮膚組織，PBS 洗凈后浸入OCT 冰凍包埋劑中平衡5 min。轉(zhuǎn)移到0.2 mm 中性濾紙上展平，隨后在制作好的模具中OCT 冷凍包埋。Leica CM1520 冷凍切片機(jī)行10 μm 厚度切片，展片后陽(yáng)離子載玻片吸附，-80℃保存。免疫熒光染色時(shí)，取出冷凍切片，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，隨后0.2% TritonX-100 室溫通透20 min，PBS 浸洗，正常山羊血清室溫封閉、依次孵育目標(biāo)蛋白一抗和針對(duì)性熒光二抗，并中間洗滌。使用DAPI避光復(fù)染細(xì)胞核，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片后，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究所有數(shù)據(jù)均采用Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性差異采用Student's T-test 進(jìn)行校驗(yàn)，P＜0.05 為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD147 過表達(dá)對(duì)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育和皮膚結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響

為了從整體上觀察CD147 對(duì)小鼠有何影響，構(gòu)建 CD147 過表達(dá)小鼠后，對(duì)鑒定陽(yáng)性的小鼠基礎(chǔ)表型進(jìn)行了觀察。結(jié)果顯示 CD147 基因的過表達(dá)小鼠外觀、體型、行為模式與野生型（wild type,WT）小鼠無(wú)明顯差異。通過對(duì)出生后體重和身長(zhǎng)發(fā)育情況進(jìn)行逐天測(cè)量，測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸統(tǒng)計(jì)分析繪制時(shí)間曲線 （圖1A）。結(jié)果顯示，過表達(dá)小鼠在體重增長(zhǎng)和身高（身長(zhǎng)）增長(zhǎng)上與野生型小鼠無(wú)顯著差異。隨后取 8 周齡離乳小鼠皮膚，組織經(jīng)固定后，石蠟包埋并切片進(jìn)行 HE 染色（圖1B），結(jié)果顯示皮膚結(jié)構(gòu)上兩者亦無(wú)顯著差異。這一結(jié)果證明 CD147 基因的過表達(dá)并不影響動(dòng)物的早期發(fā)育和皮膚結(jié)構(gòu)形成。

2.2 CD147 過表達(dá)影響小鼠毛發(fā)類型分布

小鼠毛發(fā)的形態(tài)包括三類，分別為粗大直立型的剛直毛（Guard 型毛，以下簡(jiǎn)稱 G），形似括號(hào)的弧線形毛（Bow 型毛，以下簡(jiǎn)稱 B）和具有多個(gè)彎曲轉(zhuǎn)折的 Z 字型絨毛（Zigzag 型毛，以下簡(jiǎn)稱Z）。筆者對(duì)模型小鼠皮膚毛發(fā)進(jìn)行了取樣分析，取 1、5、8 個(gè)月齡小鼠，背部隨機(jī)拔取 3 撮毛發(fā)，在奧林巴斯體式顯微鏡和 DP80 成像分析系統(tǒng)下對(duì)毛發(fā)樣本進(jìn)行分類計(jì)數(shù)和長(zhǎng)度測(cè)量，結(jié)果如圖2所示，CD147 過表達(dá)小鼠與同窩野生型小鼠毛發(fā)相比，內(nèi)部環(huán)狀結(jié)構(gòu)排列偏混亂 （圖2A），但各類型毛發(fā)長(zhǎng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （圖2B），其長(zhǎng)度-年齡曲線（圖2C）顯示 CD147 過表達(dá)后毛發(fā)偏短，但是隨著年齡增大逐漸無(wú)差異，提示著CD147 可能對(duì)維持毛囊長(zhǎng)期穩(wěn)態(tài)有一定影響。毛發(fā)類型分類統(tǒng)計(jì)顯示各型毛比例變化，剛直毛數(shù)量減少，Z 型絨毛比例增多（圖2D），提示 CD147可能在毛發(fā)形成中具有作用。

2.3 多輪脫毛后 CD147 過表達(dá)小鼠毛發(fā)相對(duì)野生型稀疏

為了進(jìn)一步觀察 CD147 過表達(dá)對(duì)毛囊和毛發(fā)的影響，筆者采取了多輪石蠟脫毛的方法 （圖3A）造成毛囊損傷，刺激毛囊激活，反復(fù)進(jìn)入生長(zhǎng)期。對(duì)脫毛后小鼠拍照，并取脫毛后 0、2、7 d小鼠皮膚組織，冷凍切片和 Ki67 免疫熒光染色觀察毛囊細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示從脫毛后2d開始毛囊中細(xì)胞增殖標(biāo)記基因 Ki67 表達(dá)開始激活，到7 d 達(dá)到高峰（圖3B）。經(jīng)過 9 輪脫毛刺激后，皮膚鏡掃描顯示 CD147 過表達(dá)小鼠相對(duì)于野生型對(duì)照毛發(fā)更稀疏（圖3C），提示 CD147 過表達(dá)降低皮膚毛發(fā)再生能力。

圖1 CD147 過表達(dá)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況和皮膚結(jié)構(gòu)觀察

圖2 CD147 過表達(dá)小鼠毛發(fā)分類觀察

圖3 多輪脫毛降低CD147 過表達(dá)小鼠毛發(fā)密度

2.4 多輪脫毛后CD147 過表達(dá)小鼠創(chuàng)傷愈合能力降低

接下來筆者觀察了野生型（WT） 小鼠和CD147 過表達(dá)小鼠多輪脫毛后皮膚創(chuàng)傷愈合能力的改變。使用6 mm 直徑創(chuàng)傷打孔器進(jìn)行創(chuàng)傷。并分別在創(chuàng)傷之后的第3，5，7，9，11 d 對(duì)小鼠背部傷口進(jìn)行觀察和測(cè)量（圖4A）。傷口直徑相對(duì)于初始直徑（6 mm）計(jì)算出修復(fù)百分比，并對(duì)各時(shí)期CD147過表達(dá)組和對(duì)應(yīng)對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4B所示，相對(duì)于野生型小鼠，多輪脫毛后的CD147過表達(dá)小鼠的皮膚創(chuàng)傷修復(fù)減慢。

圖4 多輪脫毛后 CD147 過表達(dá)小鼠創(chuàng)傷修復(fù)能力降低

2.5 CD147 過表達(dá)促進(jìn)皮膚干細(xì)胞激活和毛囊細(xì)胞增殖

為了從分子水平上更好地分析多輪脫毛對(duì)皮膚毛囊的影響，筆者收集多輪脫毛后的小鼠皮膚組織，進(jìn)行冷凍切片后皮膚干細(xì)胞的標(biāo)志基因CD34 免疫熒光染色。結(jié)果如圖5A 所示，經(jīng)過多輪脫毛后，相對(duì)于野生型WT 對(duì)照，CD147 過表達(dá)小鼠在皮膚局部毛囊中CD34 陽(yáng)性的細(xì)胞更多，提示皮膚干細(xì)胞被激活增殖，數(shù)量增加。同時(shí)通過腹腔注射小分子標(biāo)記物BrdU（5 mg/kg）后，1 h后收集皮膚，同樣冷凍切片并使用BrdU 抗體免疫熒光染色，結(jié)果顯示多輪脫毛后相對(duì)于野生型WT對(duì)照，CD147 過表達(dá)小鼠在皮膚局部單個(gè)毛囊中細(xì)胞增殖更加活躍（圖5B）。

圖5 免疫熒光檢測(cè)脫毛后小鼠皮膚

3 討論

CD147 是一個(gè)多功能分子，在胚胎發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)功能、損傷修復(fù)、炎癥發(fā)生、腫瘤進(jìn)展等多種生理病理過程中均發(fā)揮重要作用。它作為一個(gè)細(xì)胞表面受體糖蛋白，在皮膚角質(zhì)細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)，并定位于細(xì)胞膜。然而它在皮膚毛囊中的作用目前仍然少見報(bào)道。有證據(jù)表明CD147 在皮膚毛囊根部毛球區(qū)和隆突區(qū)高表達(dá)［22］，與毛囊干細(xì)胞分布區(qū)域重疊。毛囊干細(xì)胞在皮膚毛發(fā)再生、創(chuàng)傷修復(fù)和皮膚穩(wěn)態(tài)維持中起重要作用，其分裂和增值分化形成新的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞，對(duì)于維持皮膚屏障功能至關(guān)重要。在毛發(fā)的生長(zhǎng)和消退周期中，皮膚干細(xì)胞也周期性地激活和短暫擴(kuò)增。筆者的研究數(shù)據(jù)證實(shí)CD147 過表達(dá)后，可促進(jìn)皮膚中干細(xì)胞的激活和細(xì)胞增殖，提示CD147 表達(dá)對(duì)于皮膚毛囊干細(xì)胞具有調(diào)控作用。它的過表達(dá)可以引起皮膚毛發(fā)形成的改變。然而為何CD147過表達(dá)后皮膚毛囊干細(xì)胞增殖增加，皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)能力反而降低呢？筆者推測(cè)多輪脫毛后，毛囊和其中的干細(xì)胞反復(fù)激活，在CD147 的作用下，這種長(zhǎng)期的增加增殖可能加速了皮膚干細(xì)胞的耗竭，最終導(dǎo)致毛囊數(shù)量的減少，毛發(fā)變稀疏。而干細(xì)胞的耗竭最終導(dǎo)致了皮膚修復(fù)功能的減弱。

然而CD147 通過什么途徑來調(diào)節(jié)和影響皮膚干細(xì)胞功能仍然有待進(jìn)一步挖掘，有線索表明，CD147 定位于線粒體內(nèi)膜，可能參與調(diào)解呼吸代謝作用。并且CD147 可以通過Glut1［13］、MCT4［10］等途徑調(diào)控細(xì)胞糖酵解。由于皮膚干細(xì)胞通過減少有氧呼吸來達(dá)到降低氧化水平、保護(hù)遺傳物質(zhì)、降低氧化損傷和維持細(xì)胞自我更新。因此筆者推測(cè)CD147 可能通過調(diào)節(jié)能量代謝的方式來影響皮膚干細(xì)胞的數(shù)量和功能。

當(dāng)然本研究也存在不少局限之處，首先，作為表型觀察研究，對(duì)于CD147 如何調(diào)節(jié)毛囊干細(xì)胞的潛在分子機(jī)制挖掘不夠深入；其次，統(tǒng)計(jì)標(biāo)本量和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量有限，可能存在一定抽樣偏差。最后，作為CD147 過表達(dá)小鼠模型，與人體真實(shí)生理狀況存在一定差異，因此CD147 與毛囊的關(guān)系及其過表達(dá)后在人體內(nèi)真實(shí)生理狀態(tài)變化仍需進(jìn)一步研究確認(rèn)。

CAG 啟動(dòng)子是一種由人工構(gòu)建的廣譜表達(dá)的組合啟動(dòng)子，由巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus,CMV）早期增強(qiáng)子和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子組成，其驅(qū)動(dòng)的外源基因可表達(dá)于小鼠各組織細(xì)胞。筆者構(gòu)建的CAG-CD147 過表達(dá)小鼠經(jīng)過驗(yàn)證，可在皮膚細(xì)胞中維持高水平CD147 表達(dá)。因此，綜上所述，通過觀察CD147 過表達(dá)后毛發(fā)的生成、多次脫毛后毛發(fā)的再生情況、創(chuàng)傷的愈合和皮膚毛囊干細(xì)胞的激活，筆者發(fā)現(xiàn)并證明CD147 過表達(dá)后，可能促進(jìn)皮膚中干細(xì)胞的激活和細(xì)胞增殖，這種長(zhǎng)期的激活可能加速了皮膚干細(xì)胞的耗竭，最終導(dǎo)致毛囊數(shù)量的減少，毛發(fā)變稀疏和皮膚修復(fù)功能的減弱。這一研究不僅為理解和闡明CD147 在皮膚中的功能提供了現(xiàn)實(shí)依據(jù)，也為開發(fā)以CD147 為靶標(biāo)的皮膚外用藥物提供理論指導(dǎo)。