黃建 包大偉 劉文杰 周武碧 吳涵 李秀芳 張千 張正衛(wèi)

原發(fā)性肝癌是最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤[1]，每年約有75萬新病例確診，近50萬患者死于肝癌[2]。因此，識別與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)標記物，可為肝癌的診治及改善預(yù)后提供新靶點。微管去穩(wěn)定化磷蛋白1(Stathmin-1，STMN1)是一種近年來研究廣泛的微管蛋白，可參與信號通路的調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，STMN1在多種腫瘤組織中表達上調(diào)，與癌癥的腫瘤惡性程度、侵襲和遷移有關(guān)[3]。小窩蛋白-1(Caveolin-1, Cav-1)是一種具有參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等細胞活動功能的支架蛋白[4]。經(jīng)研究證實，Cav-1的表達水平與癌癥轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[5]。本研究旨在探討STMN1和Cav-1在原發(fā)性肝癌組織中的表達水平，并進一步評估其臨床病理和預(yù)后價值。

資料與方法

一、一般資料

收集我院2015年1月至2017年9月手術(shù)切除的新鮮肝癌組織與癌旁組織標本107例。收集患者年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、TNM分期等臨床病理參數(shù)。所有組織標本立即采集，液氮冷凍保存，以備進一步研究。取部分組織用10%多聚甲醛固定、石蠟包埋。參與本臨床試驗和研究前，均已取得患者書面知情同意，研究方案經(jīng)我院倫理委員會批準。排除標準：1)臨床病理資料不完整；2)存在其他系統(tǒng)組織器官惡性腫瘤；3)接受過術(shù)前治療，如化療、放療或其他相關(guān)抗腫瘤治療。患者臨床病理特征見表1。對術(shù)后患者以電話、上門、門診或住院的方式進行定期隨訪，記錄患者預(yù)后情況(包括復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及死亡情況)。

二、研究方法

(一)免疫組化SP法 采用免疫組織化學(xué)SP染色法檢測肝癌和癌旁組織中TMN1和caveolin-1的表達水平。操作如下：(1) 石蠟包埋標本切片(4 μm)表面覆蓋APES(Sigma，美國)；(2) 染色前切片經(jīng)水沖洗，室溫48 h晾干；(3) 二甲苯切片脫蠟，經(jīng)梯度乙醇水化；(4) 3%過氧化氫溶液室溫處理15 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；(5) 95 ℃，0.1 mol/L檸檬酸緩沖浸泡20 min，后用PBS沖洗；(6) 分別用兔抗人多克隆抗體STMN1(1∶50，Cell Signaling，美國)和兔抗人多克隆抗體Cav-1(1∶50，Santa Cruz Biotechnology，美國)4℃孵育過夜；(7) 用生物素標記的山羊抗兔IgG(1∶2 000，Zsbio，中國)室溫孵育20 min；(8) 用過氧化酶標記的鏈霉菌素室溫孵育20 min；(9)切片用DAB顯色，蘇木精復(fù)染；(10) 切片沖洗、干燥、中性膠封片，顯微鏡下觀察。已知陽性反應(yīng)片為陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照。

(二)結(jié)果判斷 STMN1以細胞質(zhì)出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或棕色顆粒為陽性表達，Cav-1以細胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)黃褐色或褐色顆粒為陽性表達。每張切片隨機選取5個高倍視野，根據(jù)染色強度確定表達水平：與陰性對照相同為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；根據(jù)觀察細胞中陽性細胞的比例評分：著色細胞比例<5%為0分，5～25%為1分，>25%～50%為2分，>50～75%為3分，>75%為4分。最后通過染色強度分數(shù)乘以陽性細胞百分比計算最終得分，≥3分為陽性，<3分為陰性。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、肝癌組織和癌旁組織STMN1和Cav-1表達

肝癌組織STMN1蛋白陽性比68.22%、Cav-1蛋白陽性表達率為69.16%，顯著高于癌旁組織(P<0.05)，見表1。

表1 STMN1、Cav-1與臨床特征的關(guān)系比[例(%)]

續(xù)表1

注：a表示與未發(fā)生分化比較，P<0.05，b表示與無轉(zhuǎn)移比較，P<0.05，c表示與TNM0期比較，P<0.05，d表示與未累及肝被膜比較，P<0.05

二、STMN1、Cav-1的表達與肝癌臨床病理特征的關(guān)系

STMN1蛋白表達水平與患者肝癌腫瘤中分化、發(fā)生轉(zhuǎn)移及TNM的I-II期顯著相關(guān)(P<0.05)，但與其他變量如性別、年齡、HBsAg陽性表達等無明顯相關(guān)性(P>0.05)。Cav-1蛋白表達水平與患者肝癌腫瘤中低分化程度、發(fā)生轉(zhuǎn)移及癌組織累及肝被膜顯著相關(guān)(P<0.05)，但與其他變量無明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

三、STMN1與患者預(yù)后狀況相關(guān)性分析

STMN1蛋白在陽性患者生存時間中位數(shù)為28.30個月，陰性患者平均生存時間為34.50個月，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

五、Cav-1與患者預(yù)后狀況相關(guān)性分析

Cav-1蛋白在陽性患者中位生存時間為33.10個月，陰性患者平均生存時間為39.10個月，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

STMN1是一種不穩(wěn)定微管調(diào)節(jié)蛋白，在多種癌癥中高表達[6, 7]。Tan等在原發(fā)性結(jié)直腸腫瘤細胞中檢測到STMN1水平上調(diào)，且與腫瘤細胞的遷移、侵襲、黏附活動呈正相關(guān)[8]。本研究證實，STMN1蛋白在肝癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁組織，且與肝癌組織的分化程度、轉(zhuǎn)移及進展情況有關(guān)，這與Tan等的研究結(jié)果一致。本研究還證實，可通過檢測肝癌患者癌組織中的STMN-1表達水平預(yù)測肝癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后情況。

有研究發(fā)現(xiàn)Cav-1在一些腫瘤組織中的表達水平明顯高于正常組織。Tse等在肝癌及相關(guān)細胞系中發(fā)現(xiàn)Cav-1蛋白表達水平上調(diào)[9]。此外，Cav-1的高表達與腫瘤靜脈浸潤及轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示我們Cav-1蛋白的高表達水平可能促進了腫瘤的發(fā)生、進展、浸潤和轉(zhuǎn)移。本研究通過檢測肝癌組織中Cav-1表達，與多種病理學(xué)特征進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Cav-1與肝癌的分化、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。另外，術(shù)后隨訪證實患者的生存時間與Cav-1蛋白的表達情況顯著相關(guān)，這與Tse等的研究結(jié)果類似。提示STMN1和Cav-1對肝癌的治療和預(yù)后預(yù)測有一定指導(dǎo)意義。