趙優(yōu)琴，黃鳴清，鐘曉琴，葉水國(guó)，蘇志偉

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建省中藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350122；2.國(guó)藥控股星鯊制藥<廈門>有限公司，福建 廈門361028)

功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是臨床常見的一種胃腸動(dòng)力障礙性疾病，其典型癥狀包括反酸、腹脹、腹瀉、早飽感等。胃腸動(dòng)力障礙、內(nèi)臟高敏性及心理因素等被認(rèn)為是FD的主要發(fā)病機(jī)制，同時(shí)胃腸動(dòng)力障礙也是FD發(fā)生的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)[1]。研究表明，廣泛分布于胃腸道的Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICCs)是腸胃活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)者，其數(shù)量或結(jié)構(gòu)的異常變化，可引起胃腸動(dòng)力障礙；而ICCs特異性標(biāo)志物c-kit受體與其天然配體干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(stem cell factor,SCF)組成的SCF/c-kit信號(hào)通路，可調(diào)控ICCs的生長(zhǎng)發(fā)育及其表型的維持，從而調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力[2]。此外，水通道蛋白(aquaporins,AQPs)可高效、選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)外的水分子以維持內(nèi)環(huán)境的水液平衡，其在腸道的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腸道對(duì)水分的吸收減少，導(dǎo)致水分大量在腸腔聚集，最終形成腹瀉[3]。

復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿(以下簡(jiǎn)稱：復(fù)方糖漿)是一種中藥復(fù)方制劑，含黨參、白術(shù)、茯苓、山楂、山藥等多味中藥及多種B族維生素，臨床用于治療消化不良和小兒厭食。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方糖漿可有效調(diào)節(jié)FD大鼠的胃腸運(yùn)動(dòng)，改善小腸吸收功能[4]，但其具體機(jī)制尚不清楚。因此本實(shí)驗(yàn)以此為基礎(chǔ)，進(jìn)一步考察復(fù)方糖漿對(duì)FD大鼠胃竇組織中SCF、Cx43、c-kit及結(jié)腸組織中AQP4、AQP8蛋白表達(dá)表達(dá)水平的影響，探討復(fù)方糖漿治療FD的可能分子機(jī)制，從而為該方劑的進(jìn)一步開發(fā)及臨床推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠(體重180～200 g)，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005。于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[使用許可證：SYXK(閩)2016-0006]適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，室溫(25±1)℃，自由飲水?dāng)z食。

1.2 藥品與試劑 復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿[國(guó)藥控股星鯊制藥(廈門)有限公司，批號(hào)：20970104]；多潘立酮片(西安楊森制藥有限公司，批號(hào)：180306533)；氯化鈉注射液(江西科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)：C18082207)；水合氯醛(阿拉丁，批號(hào)：40935760)；大鼠胃泌素ELISA試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司，批號(hào)：CSB-E12743r)；大鼠VIP酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(上海西塘生物科技有限公司，批號(hào)：f17131)；抗AQP4抗體(Abcam公司，批號(hào)：ab9512)；抗AQP8抗體(Abcam公司，批號(hào)：ab14363-2)； 抗c-kit抗體(Abcam公司，批號(hào)：ab5506)；抗Connexin-43抗體(PTG，批號(hào)：15386)；抗SCF抗體(Novusbio，批號(hào)：NBP1-77030)；抗β-Actin抗體(北京全式金生物，批號(hào)：HC201)。

1.3 儀器 XY2000C電子天平(常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司)；Primo R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)；SK-1快速混勻器(常州國(guó)華電器有限公司)；Infinite 200 PRO多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；ChemiDoc XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)、Mini PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽、轉(zhuǎn)印槽(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分組與造模 48只合格大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，復(fù)方糖漿低、中、高劑量組及多潘立酮組，每組8只。除正常組每日常規(guī)飼養(yǎng)不予造模外，其余各組均采用夾尾刺激(每天2次)+不規(guī)則飲食(逢單日禁食，飲水正常)+冰生理鹽水灌胃(每次2 mL，每天1次)，連續(xù)造模2周，2周后若大鼠出現(xiàn)緊張易怒反應(yīng)、進(jìn)食量明顯減少、體重明顯減輕等情況，表明造模成功。

2.2 給藥 根據(jù)前期研究基礎(chǔ)[4]，復(fù)方糖漿低、中、高劑量組分別予復(fù)方糖漿2.7、5.4、10.8 g·kg-1，多潘立酮組給予多潘立酮4 mg·kg-1，正常組及模型組灌胃等體積生理鹽水，于造模后第7天開始給藥，每天1次，連續(xù)給藥14 d。

2.3 小腸推進(jìn)率、胃排空率測(cè)定及標(biāo)本采集 末次給藥結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12 h，灌胃1 mL的炭餐指示劑，30 min后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血后處死，即刻剖開腹腔，迅速剪取全胃，濾紙拭干后稱全質(zhì)量，沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內(nèi)容物后拭干后稱凈重，胃排空率=[1-(胃全重-胃凈重)/所灌糊質(zhì)重量]×100%；剪取距幽門0.5 cm處適量大小的胃竇組織，冰生理鹽水沖洗后，置于凍存管中，液氮凍存；分離上至幽門下至回盲部的腸管，在松弛狀態(tài)下測(cè)量并記錄幽門至炭餐指示劑最前端的距離，記為炭餐指示劑推進(jìn)長(zhǎng)度，小腸推進(jìn)率=炭餐指示劑推進(jìn)長(zhǎng)度/小腸總長(zhǎng)度×100%；剪取近端結(jié)腸組織適量，冰生理鹽水沖洗后，置于凍存管中，液氮凍存。

2.4 血清胃泌素(GAS)、血管活性肽(VIP)檢測(cè) 各組大鼠取血后，4 ℃，3 500 rpm離心15 min，取上清分裝，于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?yán)格按照試劑盒說明操作，檢測(cè)血清中的GAS、VIP水平。

2.5 組織中AQP4、AQP8、SCF、Cx43、c-Kit蛋白檢測(cè) 取適量大小的胃竇組織和結(jié)腸組織，分別經(jīng)液氮充分研磨，每100 mg組織樣品中加1 mL含蛋白酶抑制劑的裂解液，1 mL注射器抽提數(shù)次充分勻漿，冰上靜置30 min后，14 000 rpm離心10 min，取上清液。BCA法檢測(cè)上清濃度，加入適量的蛋白上樣緩沖液混勻、離心、變性、上樣，每孔上樣總量為40 μg蛋白，SDS-PAGE 凝膠電泳分離后，通過轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，4 ℃敷一抗過夜，隔天TBST洗30 min，室溫敷二抗1.5 h，TBST洗30 min，ECL發(fā)光液顯影，Image Lab軟件分析目標(biāo)條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方糖漿對(duì)FD大鼠腹瀉等一般情況的影響 造模前，各組大鼠狀態(tài)、毛色、體態(tài)等均正常。造模5 d后，各實(shí)驗(yàn)組大鼠煩躁易怒，大便濕軟，食欲下降；造模7 d后，各實(shí)驗(yàn)組大鼠倦怠萎靡、靜臥少動(dòng)，糞便呈黃綠色不成形的稀便；經(jīng)治療14 d后，與模型組相比，復(fù)方糖漿各劑量組及多潘立酮組大鼠精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，活動(dòng)量明顯增加、毛色光澤，大便恢復(fù)正常。

3.2 復(fù)方糖漿對(duì)FD大鼠體重的影響 與正常組比較，模型組大鼠的體重明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，復(fù)方糖漿中、高劑量及多潘立酮組大鼠體重明顯升高(P<0.05，P<0.01)，復(fù)方糖漿低劑量組大鼠體重與模型組相比也有一定程度的升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果見表1。

3.3 復(fù)方糖漿對(duì)FD大鼠胃排空率及小腸推進(jìn)率的影響 與正常組比較，模型組大鼠胃排空率和小腸推進(jìn)率均顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，復(fù)方糖漿高劑量組及多潘立酮組大鼠的胃排空率及小腸推進(jìn)率均顯著升高(P<0.01)，復(fù)方糖漿中劑量組大鼠的胃排空率及小腸推進(jìn)率亦有明顯升高(P<0.05)，而復(fù)方糖漿低劑量組的胃排空率及小腸推進(jìn)率與模型組相比無顯著性差異(P>0.05)，結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方糖漿對(duì)FD大鼠體重、胃排空率及小腸推進(jìn)率的影響

注:與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.4 復(fù)方糖漿對(duì)FD大鼠血清GAS、VIP的影響 與正常組相比，模型組大鼠血清中GAS含量顯著降低(P<0.01)，VIP水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，多潘立酮組及復(fù)方糖漿高劑量組GAS水平明顯升高(P<0.01)，VIP水平明顯降低(P<0.01)；復(fù)方糖漿中劑量組VIP水平顯著降低(P<0.05)，而復(fù)方糖漿低劑量組的GAS、VIP水平與模型組相比無顯著性差異(P>0.05)，結(jié)果見表2。

表2 復(fù)方糖漿對(duì)FD大鼠血清GAS、SCF、VIP的影響

注:與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.5 復(fù)方糖漿對(duì)FD大鼠胃竇組織中SCF、c-kit、Cx43蛋白表達(dá)的影響 與正常組相比，模型組SCF、c-kit、Cx43蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組相比，復(fù)方糖漿高劑量組及多潘立酮組SCF、c-kit、Cx43蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01，P<0.05)，復(fù)方糖漿中劑量組c-kit、Cx43蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01，P<0.05)，復(fù)方糖漿低劑量組c-kit蛋白表達(dá)水平也明顯增加(P<0.05)，結(jié)果見圖1。

3.6 復(fù)方糖漿對(duì)FD大鼠結(jié)腸組織中AQP4、AQP8蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組AQP4、AQP8蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，復(fù)方糖漿高劑量組及多潘立酮組AQP4、AQP8蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01)；復(fù)方糖漿中劑量組AQP8蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)，但AQP4蛋白表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果見圖2。

圖1 復(fù)方糖漿對(duì)FD大鼠胃竇組織SCF、c-kit、Cx43蛋白表達(dá)的影響 注:與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖2 復(fù)方糖漿對(duì)FD大鼠結(jié)腸組織AQP4、AQP8蛋白表達(dá)的影響(n=4) 注:與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

FD屬中醫(yī)學(xué)中的胃脘痛、嘈雜、痞滿、納呆、反酸等范疇，其誘因與腦腸軸失衡、內(nèi)臟高敏、飲食失衡以及精神壓力過大有密切聯(lián)系，其中胃腸動(dòng)力障礙是FD最重要的發(fā)病機(jī)制之一。目前西醫(yī)多以促胃動(dòng)力藥等手段加以干預(yù)，雖可改善患者部分癥狀，但其方法單一，療效不明顯。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑等特點(diǎn)，其在治療胃腸障礙性疾病方面具有療效確切、副作用小等優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)代研究表明，復(fù)方糖漿中黨參、白術(shù)、芡實(shí)、山楂、山藥補(bǔ)氣益脾、健胃消食，可促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)；茯苓、薏苡仁健脾滲濕、除濕止瀉，可改善腹瀉。此外，方中維生素B1、B2、B6、煙酰胺等B族維生素，可改善機(jī)體能量代謝，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收和利用能力。

ICCs是胃腸道基本動(dòng)力單位“ENS(腸神經(jīng))-ICCs-SMCs(平滑肌細(xì)胞)”中最重要的協(xié)調(diào)者，也是治療胃腸動(dòng)力障礙的重要靶點(diǎn)[5]。Cx43是ICC細(xì)胞表達(dá)的主要連接蛋白，其表達(dá)降低會(huì)引起胃腸運(yùn)動(dòng)功能紊亂，干細(xì)胞因子受體(c-kit)是胃腸道ICCs的特異性受體，與Cx43存在共定位表達(dá)，c-kit與Cx43表達(dá)異常可引起胃腸運(yùn)動(dòng)功能的紊亂，SCF是c-kit的特異性配體，可與c-kit結(jié)合后激活一系列信號(hào)分子，從而調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力[6-8]。GAS是一種廣泛分布于整個(gè)胃腸道的腦腸肽，具有刺激胃酸、胃蛋白酶分泌的作用，可助消化和促進(jìn)胃排空，血清GAS水平在一定程度上可以反映胃腸道的功能狀態(tài)[9]。本研究表明，復(fù)方糖漿可促進(jìn)FD大鼠GAS的分泌，上調(diào)胃竇組織中SCF、c-kit、Cx43蛋白的表達(dá)水平，增強(qiáng)胃腸平滑肌收縮，從而促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)及胃排空。

腹瀉作為FD典型癥狀中一種，與AQPs有著密切聯(lián)系。研究表明，腸道AQP4異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸對(duì)水分的吸收和分泌紊亂，進(jìn)而引發(fā)腹瀉[10-11]。腸易激綜合征患者AQP8表達(dá)顯著降低，使得結(jié)腸對(duì)水分的吸收明顯減少，可導(dǎo)致糞便松散甚至腹瀉[12-13]。此外，VIP是一種可以抑制胃腸運(yùn)動(dòng)的腸激肽，其水平異常增加會(huì)導(dǎo)致水分不能完全吸收，從而引起腹瀉。本研究表明，復(fù)方糖漿可抑制FD大鼠VIP的分泌，調(diào)節(jié)結(jié)腸組織中AQP4、AQP8蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而改善FD大鼠的腹瀉癥狀。

綜上所述，復(fù)方糖漿可上調(diào)胃竇組織中SCF、Cx43、c-kit的蛋白表達(dá)，增強(qiáng)胃腸平滑肌收縮，促進(jìn)胃腸動(dòng)力活動(dòng)，從而改善FD模型大鼠的胃腸功能障礙；并可通過增加結(jié)腸組織中AQP3、AQP4蛋白表達(dá)水平，平衡水液吸收，減少水液電解質(zhì)在腸腔的累積，從而改善腹瀉癥狀。