陳玉樂(lè)，呂 偉，楊文杰，劉天杰，李 磊

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710061)

腎癌是泌尿系統(tǒng)腫瘤中死亡率最高的疾病，約1/3的腎癌患者會(huì)因腫瘤轉(zhuǎn)移而死亡[1]。進(jìn)一步闡明腎癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)于提高腎癌治療效果具有積極意義。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallopeptidases，MMPs)類(lèi)，如基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)在腎癌等腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[2]。研究表明，腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用與腫瘤進(jìn)展過(guò)程關(guān)系密切。既往研究中我們發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞這一特殊類(lèi)型間質(zhì)細(xì)胞在腎癌組織中聚集并對(duì)腎癌血管形成過(guò)程產(chǎn)生影響[3]。國(guó)內(nèi)有學(xué)者初步發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞可促進(jìn)腎癌的侵襲遷移[4]。然而，肥大細(xì)胞是否可通過(guò)MMPs影響腎癌侵襲轉(zhuǎn)移尚不清楚。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步探討了肥大細(xì)胞對(duì)腎癌體外侵襲遷移與MMPs的影響以及可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與抗體逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購(gòu)自寶生物(大連)有限責(zé)任公司。Fast200總RNA極速抽提試劑盒購(gòu)自上海飛捷生物技術(shù)有限公司。Dulbecco’s Modified Eagle Media-F12(DMEM-F12)培養(yǎng)基及Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自杭州四季青公司。 Millicell小室購(gòu)自Millipore公司。重組人TGF-β蛋白購(gòu)自R&D公司，溶解于無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)，使用時(shí)以0 nmol/L(對(duì)照)、100 nmol/L、400 nmol/L等終濃度培養(yǎng)細(xì)胞。MMP2、MMP9及GAPDH抗體購(gòu)自Abcam公司。Matrigel購(gòu)自BD公司。SB431542購(gòu)自Selleck公司，溶解于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，使用時(shí)以100 nmol/L終濃度培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人腎癌OSRC-2細(xì)胞系由西安交通大學(xué)泌尿外科研究所凍存保種，于含100 mL/L FBS的DMEM-F12常規(guī)培養(yǎng)。人肥大細(xì)胞HMC-1細(xì)胞系購(gòu)自ATCC公司，于含100 mL/L FBS的IMDM常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2(體積分?jǐn)?shù))。

1.3 HMC-1細(xì)胞條件培養(yǎng)基收集取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMC-1細(xì)胞，PBS離心洗滌后以不含F(xiàn)BS的DMEM-F12懸浮。調(diào)整細(xì)胞濃度后以5×106個(gè)/皿的密度接種到10 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基為10 mL不含F(xiàn)BS的DMEM-F12。培養(yǎng)24 h后用孔徑為0.44 μm的濾器過(guò)濾細(xì)胞上清液。使用時(shí)與新鮮無(wú)FBS的DMEM-F12按1∶1混合后再加入100 mL/L的FBS，對(duì)照組則用新鮮DMEM-F12加入100 mL/L的FBS。

1.4 RT-PCR實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR Fast200總RNA極速抽提試劑盒提取細(xì)胞總RNA，定量后按400 ng上樣量進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。定量逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物后調(diào)整濃度為0.2 g/L，按1 μL上樣量(即200 ng)以SYBR Green I 嵌合熒光法進(jìn)行real time RT-PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)引物序列如下：GAPDH上游5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCGG-3′,下游5′-GACGGTGCCATGGAATTTGC-3′；MMP2上游5′-ACAAAGAGTTGGCAGTGCAATA-3′，下游5′-CCGCATGGTCTCGATGGTAT-3′；MMP9上游5′-GTCATCCAGTTTGGTGTCGC-3′，下游5′-GGACCACAACTCGTCATCGT-3′。

1.5 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)胰酶消化OSRC-2細(xì)胞，加入含100 mL/L FBS的DMEM終止消化。PBS洗細(xì)胞3次以去除FBS。無(wú)FBS DMEM-F12重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至1.25×105個(gè)/mL。向millicell小室的上室加入200 μL細(xì)胞懸液，即2.5×104個(gè)OSRC-2細(xì)胞。下室加入含100 mL/L FBS的DMEM-F12。隨后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。取出millicell小室，用棉簽擦去上室的細(xì)胞。PBS洗小室3次后將下室細(xì)胞置于多聚甲醛固定液中固定10 min。再用PBS洗小室3次，隨后將下室置于1 mL/L結(jié)晶紫溶液染色5 min。PBS洗去殘留結(jié)晶紫后置于顯微鏡下觀察。取10個(gè)隨機(jī)視野(×200)計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)并以其平均數(shù)代表體外遷移能力。

1.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)無(wú)FBS DMEM-F12以1∶5的比例稀釋matrigel，以50 μL/孔鋪于millicell小室的上室，置于37 ℃培養(yǎng)箱4 h使其凝固。隨后向上室加入1×105個(gè)無(wú)FBS DMEM-F12懸浮的OSRC-2細(xì)胞，下室加入含100 mL/L FBS的DMEM-F12。其余操作同Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn)胰酶消化OSRC-2細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以2×106個(gè)/皿的密度接種于10 cm培養(yǎng)皿。培養(yǎng)箱培養(yǎng)6～8 h使細(xì)胞貼壁。隨后棄培養(yǎng)上清，加入含或不含HMC-1細(xì)胞條件培養(yǎng)基的DMEM-F12培養(yǎng)48 h，用人膀胱癌UMUC-3細(xì)胞系總蛋白用作MMP9陽(yáng)性對(duì)照。蛋白提取及Western blot實(shí)驗(yàn)按照課題組所在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)步驟進(jìn)行[5]。MMP2、MMP9及GAPDH一抗分別按1∶1 000、1∶1 000及1∶10 000進(jìn)行稀釋。免疫印跡結(jié)果通過(guò)oddessy顯影系統(tǒng)進(jìn)行顯影。

2 結(jié) 果

2.1 肥大細(xì)胞對(duì)腎癌細(xì)胞體外侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響提取肥大細(xì)胞HMC-1的條件培養(yǎng)基，并用其培養(yǎng)人腎癌OSRC-2細(xì)胞48 h后通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了OSRC-2細(xì)胞體外遷移及侵襲能力變化(圖1A)。體外遷移實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)照組及HMC-1條件培養(yǎng)基處理組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(78.33±9.02)個(gè)和(500.3±35.88)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)照組及HMC-1條件培養(yǎng)基處理組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(51.33±13.37)個(gè)和(302.70±22.56)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1B)。

圖1 肥大細(xì)胞對(duì)腎癌細(xì)胞體外遷移、侵襲能力的影響

A：Transwell遷移和侵襲細(xì)胞實(shí)驗(yàn)圖；B：體外遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)細(xì)胞計(jì)數(shù)及其柱狀圖*P<0.05。

2.2 肥大細(xì)胞對(duì)腎癌細(xì)胞體外MMP2、MMP9表達(dá)的影響通過(guò)real time RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)HMC-1條件培養(yǎng)基處理后OSRC-2細(xì)胞MMP2、MMP9表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞可顯著促進(jìn)OSRC-2細(xì)胞MMP2 mRNA表達(dá)，但對(duì)MMP9 mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響(圖2A)。Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)經(jīng)HMC-1條件培養(yǎng)基處理后OSRC-2細(xì)胞MMP2蛋白表達(dá)水平明顯上升。但在兩組細(xì)胞中均未檢測(cè)到MMP9蛋白表達(dá)(圖2B)。

圖2 肥大細(xì)胞對(duì)腎癌細(xì)胞MMP2、MMP9表達(dá)的影響

A：RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，*P<0.05；B：Western blot檢測(cè)結(jié)果。

2.3 TGF-β信號(hào)在肥大細(xì)胞介導(dǎo)的腎癌侵襲遷移及MMP2表達(dá)中的作用不同濃度重組人TGF-β蛋白處理OSRC-2細(xì)胞48 h，提取總RNA后通過(guò)real time RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MMP2表達(dá)情況，結(jié)果表明TGF-β可呈濃度依賴(lài)性地促進(jìn)OSRC-2細(xì)胞MMP2表達(dá)(圖3A)。隨后在普通培養(yǎng)及HMC-1條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的OSRC-2細(xì)胞加入TGF-β信號(hào)抑制劑SB431542，經(jīng)real time RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SB431542可抑制HMC-1條件培養(yǎng)基引起的MMP2上調(diào)，但對(duì)普通培養(yǎng)的OSRC-2細(xì)胞MMP2表達(dá)無(wú)明顯抑制作用(圖3B)。這一結(jié)果表明肥大細(xì)胞可通過(guò)分泌TGF-β促進(jìn)腎癌細(xì)胞MMP2表達(dá)。此外，通過(guò)Ttranswell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，SB431542可抑制HMC-1條件培養(yǎng)基引起的OSRC-2細(xì)胞體外遷移及侵襲(圖3C、D)。

圖3 TGF-β信號(hào)在肥大細(xì)胞介導(dǎo)的腎癌侵襲遷移及MMP2表達(dá)中的作用

A：real time RT-PCR 檢測(cè)外源性TGF-β對(duì)OSRC-2細(xì)胞MMP2表達(dá)的影響，*P<0.05；B：real time RT-PCR 檢測(cè)SB431542對(duì)HMC-1條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的OSRC-2細(xì)胞MMP2表達(dá)的影響，*P<0.05；C：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SB431542對(duì)HMC-1條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的OSRC-2細(xì)胞體外遷移、侵襲的影響；D：遷移和侵襲細(xì)胞計(jì)數(shù)，*P<0.05。

3 討 論

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，大致需要經(jīng)歷脫離原發(fā)病灶、穿過(guò)基底膜進(jìn)入血管、隨血液循環(huán)流動(dòng)、逸出血管到達(dá)遠(yuǎn)隔組織并形成轉(zhuǎn)移灶等多個(gè)步驟[6]。腫瘤細(xì)胞離開(kāi)原發(fā)部位后，必須降解并穿過(guò)介于腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的由細(xì)胞外基質(zhì)組成的基底膜才能進(jìn)入血管，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，包括腎癌細(xì)胞在內(nèi)的多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞均可分泌多種蛋白酶，如MMPs、絲氨酸蛋白酶等。這些酶類(lèi)可有效降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而有助于腫瘤轉(zhuǎn)移。其中，MMP2和MMP9是研究較多的蛋白酶類(lèi)成員，可顯著促進(jìn)腎癌的侵襲轉(zhuǎn)移[7]。MMPs隸屬鋅依賴(lài)性肽鏈內(nèi)切酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)的多種成分，如膠原、纖維連接蛋白等[8]。MMPs對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解一方面可消除腫瘤侵襲屏障，使腫瘤更易侵犯鄰近組織；另一方面，細(xì)胞外基質(zhì)降解后細(xì)胞因子的釋放也可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及血管形成[8]。此外，MMPs也可通過(guò)切割細(xì)胞粘附關(guān)鍵分子等機(jī)制改變腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。例如MMP2對(duì)層黏蛋白5的剪切可促進(jìn)腫瘤的運(yùn)動(dòng)能力[9]。

TGF-β是腫瘤微環(huán)境中的重要成分之一，可由腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞等多種成分分泌[2]。TGF-β介導(dǎo)的下游信號(hào)激活是MMP2表達(dá)的重要調(diào)控因素之一[10]。同時(shí)，肥大細(xì)胞可通過(guò)分泌TGF-β參與多種病理生理過(guò)程[11]。TGF-β與其受體結(jié)合后可通過(guò)Smad依賴(lài)或非依賴(lài)方式介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[12]。早期研究表明，TGF-β在腎癌等腫瘤具有較高的表達(dá)水平，且血清與尿中的TGF-β水平與腎癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[13]。近年來(lái)的多項(xiàng)研究表明，TGF-β在腎癌侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要作用，其機(jī)制包括誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和干細(xì)胞表型[14]、Fascin1的表達(dá)等[15]。在膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中，TGF-β介導(dǎo)的MMP2和MMP9表達(dá)也是其促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制[10]。此前已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)腎癌組織中的TGF-β表達(dá)與MMP2呈正相關(guān)[16]。在本研究中，我們通過(guò)添加外源性TGF-β處理腎癌OSRC-2細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)MMP2轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，提示腎癌中TGF-β也可能通過(guò)促進(jìn)MMP2表達(dá)參與侵襲轉(zhuǎn)移。

近幾年來(lái)，間質(zhì)成分在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中的作用引起了科學(xué)界的廣泛關(guān)注。一方面，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)分泌趨化因子招募并激活間質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中聚集和成熟。另一方面，間質(zhì)細(xì)胞分泌的大量活性介質(zhì)又可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，包括增殖、轉(zhuǎn)移和血管形成等[17]。作為腫瘤微環(huán)境中的重要一員，肥大細(xì)胞可分泌多種具有促進(jìn)血管形成作用的活性分子，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2)和組胺等[18]。我們的前期研究證實(shí)，肥大細(xì)胞可在腎癌組織聚集并促進(jìn)腎癌血管形成以及抗血管靶向治療抵抗[3]。在本研究中，我們通過(guò)肥大細(xì)胞HMC-1細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基處理腎癌OSRC-2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞條件培養(yǎng)基可明顯提高腎癌細(xì)胞的體外侵襲遷移水平，表明肥大細(xì)胞不僅可促進(jìn)腎癌血管形成，也可直接促進(jìn)腎癌細(xì)胞的侵襲與遷移。

研究表明，肥大細(xì)胞可分泌豐富的TGF-β，是某些病理生理?xiàng)l件下TGF-β的重要來(lái)源之一[19]。同時(shí)，肥大細(xì)胞的功能也受到TGF-β的調(diào)節(jié)。因此，TGF-β是腫瘤細(xì)胞與肥大細(xì)胞“對(duì)話(huà)”的重要媒介[2]。在本研究中，我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)肥大細(xì)胞引起的腎癌侵襲遷移機(jī)制進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞可通過(guò)分泌TGF-β促進(jìn)腎癌MMP2表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)侵襲遷移。后續(xù)研究尚需通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等驗(yàn)證肥大細(xì)胞在腎癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，并進(jìn)一步闡明肥大細(xì)胞分泌的TGF-β促進(jìn)腎癌MMP2表達(dá)的詳細(xì)分子機(jī)制。