夏 康，郭 佳，翟官忠，劉澤林，王 瀟，劉修恒

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430060)

乳腺癌高表達(dá)基因1(breast cancer overexpressed gene 1，BCOX1)是在乳腺癌研究中新發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)基因[1]。BCOX1被發(fā)現(xiàn)以來，研究主要集中在闡明該基因在乳腺癌中的作用。我們發(fā)現(xiàn)其所在的人類染色體17q11.2-q22區(qū)域中多個(gè)突變的基因位點(diǎn)與前列腺癌易感性相關(guān)[2]。在本課題組前期的體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，異常表達(dá)的BCOX1具有調(diào)控前列腺癌細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的能力[3]。到目前為止，BCOX1在前列腺組織中的表達(dá)情況尚不明確。本研究旨在檢測(cè)BCOX1在良惡性前列腺組織中的表達(dá)水平，分析其與前列腺癌患者臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，探討B(tài)COX1對(duì)前列腺癌患者生存的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后，收集2006年1月至2012年6月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科行前列腺癌根治術(shù)的100例患者的手術(shù)標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組為80例同期行經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)患者的良性前列腺增生組織標(biāo)本。所有患者均經(jīng)病理學(xué)確診，且在手術(shù)前均未經(jīng)內(nèi)分泌治療、放療、化療等其他治療干預(yù)。回顧性收集以上100例前列腺癌患者的臨床病歷資料：術(shù)前血清前列腺特異抗原(prostate specific antigen，PSA)、前列腺癌TNM臨床分期、術(shù)后Gleason評(píng)分、精囊侵犯、血管侵犯和切緣狀態(tài)。

1.2 免疫組化法將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的前列腺石蠟組織標(biāo)本，切片(4 μm)后脫蠟、水化。消除內(nèi)源性過氧化物酶并行抗原修復(fù)。一抗為BCOX1兔抗人多克隆抗體(Biorbyt，USA)，4 ℃過夜。滴加二抗后二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，并用蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水干燥后封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 結(jié)果評(píng)判在Olympus顯微鏡下觀察，BCOX1陽性染色位于細(xì)胞質(zhì)中，表現(xiàn)為淡黃色細(xì)顆粒、棕黃色顆粒和褐黃色粗顆粒。染色評(píng)判方法為依據(jù)組織中陽性細(xì)胞百分比和細(xì)胞的染色強(qiáng)度綜合判斷。陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分；陽性細(xì)胞數(shù)<50%為1分；陽性細(xì)胞數(shù)>50%為2分。胞質(zhì)不染色或微弱染色為0分；胞質(zhì)染色為1分；胞質(zhì)強(qiáng)染色為2分。將以上2種評(píng)分相加后為BCOX1在前列腺癌組織中的表達(dá)水平：0～2分為低表達(dá)，3～4分為高表達(dá)[4]。由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師在不知曉樣本的臨床和病理信息情況下，使用以上評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，達(dá)成共識(shí)。

1.4 對(duì)所有前列腺癌患者術(shù)后進(jìn)行門診和電話隨訪生化復(fù)發(fā)(biochemical recurrence，BCR)：手術(shù)后未接受輔助治療的患者，連續(xù)2次PSA≥0.2 ng/mL[5]。無生化復(fù)發(fā)生存期(BCR-free survival，BRFS)：手術(shù)之日算起，終止日期為生化復(fù)發(fā)的時(shí)間；總生存期(overall survival，OS)：手術(shù)之日算起，終止日期為死亡或末次隨訪日期，按月計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，分類變量采用χ2檢驗(yàn)，單因素生存分析采用Kaplan-Meier法并用Log-rank檢驗(yàn)，用Cox回歸模型分析各變量與預(yù)后的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 前列腺癌組織和良性前列腺增生組織中BCOX1蛋白的表達(dá)BCOX1主要在前列腺癌組織的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，正常前列腺組織中細(xì)胞質(zhì)無或淺染色，在Gleason評(píng)分>7的高度惡性前列腺癌組織中的細(xì)胞質(zhì)深染(圖1C)。將BCOX1在前列腺組織中的蛋白表達(dá)水平分為低表達(dá)和高表達(dá)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。80例良性前列腺增生組織中BCOX1高表達(dá)率為7.50%(6/80)；100例前列腺癌組織中BCOX1高表達(dá)率為72.00%(72/100)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果說明，在蛋白水平BCOX1在前列腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于良性前列腺增生組織。

圖1 BCOX1在前列腺良惡性組織中的蛋白表達(dá)(免疫組化，×400)

A：良性前列腺增生組織；B：低度惡性前列腺癌組織；C：高度惡性前列腺癌組織。

2.2 BCOX1蛋白表達(dá)與前列腺癌臨床病理的關(guān)系在前列腺癌組織中，BCOX1蛋白表達(dá)水平在不同Gleason評(píng)分和PSA水平之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)，而在不同年齡、TNM臨床分期、周圍血管侵犯、術(shù)后切緣狀態(tài)和精囊侵犯之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

2.3 BCOX1的表達(dá)與前列腺癌患者的BRFS和OS的關(guān)系利用Kaplan-Meier對(duì)不同BCOX1表達(dá)水平前列腺癌患者的BRFS和OS進(jìn)行生存曲線分析，結(jié)果顯示，BCOX1高表達(dá)前列腺癌患者與低表達(dá)患者比較5年BRFS明顯縮短，且BCOX1高表達(dá)前列腺癌患者5年OS顯著低于低表達(dá)前列腺癌患者(P<0.05，圖2)。

2.4 影響前列腺癌患者預(yù)后的單因素和多因素生存分析對(duì)100例前列腺癌患者生存資料進(jìn)行預(yù)后分析，單因素分析發(fā)現(xiàn)TNM臨床分期、精囊侵犯、術(shù)后切緣狀態(tài)以及BCOX1表達(dá)水平與BRFS和OS相關(guān)；將上述各因素納入多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)TNM臨床分期、精囊侵犯、術(shù)后切緣狀態(tài)以及BCOX1表達(dá)水平與BRFS和OS相關(guān)(表2，表3)。單因素及多因素Cox回歸分析均提示BCOX1是前列腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表1 不同Gleason評(píng)分、臨床分期、PSA水平、精囊侵犯、血管侵犯和切緣狀態(tài)前列腺癌組織中BCOX1蛋白的表達(dá)[例(%)]

項(xiàng)目例數(shù)BCOX1蛋白低表達(dá)高表達(dá)χ2值P值年齡(歲)0.6310.427 <604210(23.81)32(76.19) ≥605818(31.03)40(68.97)Gleason評(píng)分4.9820.026 <72411(45.83)13(54.17) ≥77617(22.37)59(77.63)TNM臨床分期2.1160.146 16020(33.33)40(66.67) 2或 3408(20.00)32(80.00)周圍血管侵犯0.3450.557 陰性338(24.24)25(75.76) 陽性6720(29.85)47(70.15)PSA(ng/mL)7.4790.006 <104619(41.30)27(58.70) ≥10549(16.67)45(83.33)術(shù)后切緣狀態(tài)1.7730.183 陰性4315(34.88)28(65.12) 陽性5713(22.81)44(77.19)精囊侵犯2.4800.115 陰性7925(31.65)54(68.35) 陽性213(14.29)18(85.71)

PSA：血清前列腺特異抗原。

圖2 BCOX1高表達(dá)與低表達(dá)前列腺癌患者的生存曲線

表2 單因素和多因素分析影響前列腺癌患者BRFS的危險(xiǎn)因素

變量單因素分析Exp(B)95%CIP值多因素分析Exp(B)95%CIP值年齡(歲)1.7180.952～3.1030.072Gleason評(píng)分0.6630.336～1.3100.237TNM臨床分期2.5901.442～4.6500.0012.1011.155～3.8220.015周圍血管侵犯1.8710.966～3.6230.063PSA(ng/mL)0.9890.549～1.7830.971術(shù)后切緣狀態(tài)3.9412.058～7.5450.0002.9431.461～5.9270.003精囊侵犯3.5501.939～6.4980.0002.0121.042～3.8830.037BCOX13.4031.345～8.6080.0102.5821.019～6.5470.046

PSA：血清前列腺特異抗原；BCOX1：乳腺癌高表達(dá)基因1；BRFS：無生化復(fù)發(fā)生存期。

表3 單因素和多因素分析影響前列腺癌患者OS的危險(xiǎn)因素

PSA：血清前列腺特異抗原；BCOX1：乳腺癌高表達(dá)基因1。

3 討 論

前列腺癌的生化復(fù)發(fā)提示預(yù)后不良，隨著對(duì)前列腺癌研究的不斷深入，前列腺癌預(yù)后評(píng)估相關(guān)新型分子標(biāo)志物不斷被發(fā)現(xiàn)。共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因(ataxia telangiectasia mutated gene，ATM)與乳腺癌敏感基因1/2(breast cancer susceptibility gene 1/2，BRcA1/2)的突變能區(qū)分惡性程度較高的前列腺癌和惰性前列腺癌；神經(jīng)纖毛蛋白2(neuropilin 2，NRP 2)可作為高危前列腺癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；前列腺癌根治術(shù)前中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比值(neutrophil lymphocyte ratio，NLR) 與患者高生化復(fù)發(fā)率密切相關(guān)[6-8]?；谀[瘤基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)，按照BCOX1基因的表達(dá)水平和Gleason評(píng)分將前列腺癌患者分組后，利用UALCAN公共網(wǎng)站(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)可進(jìn)行基因表達(dá)與生存分析的在線統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[9]。

BCOX1基因序列是由1 103個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成，可以編碼由222個(gè)氨基酸組成的BCOX1蛋白，在細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)[10]。研究表明BCOX1主要在乳腺癌組織中存在，特別是在惡性程度較高的乳腺癌(浸潤(rùn)性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌)中高表達(dá)。最近研究表明BCOX1表達(dá)與乳腺癌的病理級(jí)別、人類表皮生長(zhǎng)因子受體2 (human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2)以及三陰性乳腺癌相關(guān)，BCOX1的高表達(dá)可以作為預(yù)測(cè)乳腺癌不良預(yù)后的新生物指標(biāo)[11]。BCOX1基因所在的人類染色體17q11.2-q22區(qū)域中部分基因位點(diǎn)突變被認(rèn)為與前列腺癌易感性相關(guān)[12]。通過分析公共microarray數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.oncomine.org/)中的人類前列腺組織中BCOX1的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)BCOX1的mRNA水平在前列腺癌組織中的表達(dá)顯著高于良性前列腺增生組織，而BCOX1在前列腺組織中的具體表達(dá)情況尚不清楚[13]。

本研究中我們用免疫組化染色方法觀察100例前列腺癌組織和80例良性前列腺增生組織中的BCOX1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，蛋白水平BCOX1在前列腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于良性前列腺增生組織，異常表達(dá)的BCOX1可能與前列腺癌具有相關(guān)性。進(jìn)一步分析BCOX1與前列腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在前列腺癌組織中，BCOX1蛋白表達(dá)水平在不同Gleason評(píng)分和PSA水平之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示BCOX1高表達(dá)可能是前列腺癌的高危因素與術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)。

通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者中BCOX1的蛋白表達(dá)水平與患者術(shù)后BRFS和OS相關(guān)，進(jìn)一步利用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析，結(jié)果顯示BCOX1的表達(dá)是前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)和預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，BCOX1表達(dá)較高的前列腺癌患者生存期相對(duì)較短。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)有關(guān)BCOX1基因與前列腺癌預(yù)后的關(guān)系具有一致性。BCOX1在前列腺癌中的具體作用機(jī)制尚不明確，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的BCOX1不僅可以調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，還可以影響STAT3信號(hào)通路的激活參與前列腺癌細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌分化的調(diào)控。神經(jīng)內(nèi)分泌分化最具有代表性的標(biāo)記物是嗜鉻粒蛋白A，可以作為去勢(shì)抵抗性前列腺癌患者生存期的預(yù)測(cè)指標(biāo)[14]。以上結(jié)果表明，BCOX1是前列腺癌的相關(guān)癌基因，是判斷前列腺癌預(yù)后的潛在指標(biāo)，可能為優(yōu)化患者的術(shù)后臨床決策提供依據(jù)，提高患者的生存期。

本研究為單中心回顧性研究，標(biāo)本量較小，可能導(dǎo)致患者的代表性差，結(jié)果存在一定偏倚。此外前列腺癌患者的生存期較長(zhǎng)，本研究隨訪時(shí)間較短，今后我們將加大樣本量并繼續(xù)對(duì)這部分患者進(jìn)行隨訪研究。BCOX1能否作為分子生物學(xué)診斷和治療的靶點(diǎn)，有待后期實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

綜上所述，BCOX1在前列腺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與前列腺癌術(shù)前PSA水平、術(shù)后Gleason評(píng)分有關(guān)，與前列腺癌患者預(yù)后密切相關(guān)，可為篩選高風(fēng)險(xiǎn)前列腺癌患者提供重要信息，有助于對(duì)具有潛在復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和不良預(yù)后的患者進(jìn)行早期綜合治療。BCOX1可能成為監(jiān)測(cè)前列腺癌患者預(yù)后的理想指標(biāo)。