沙萬里, 閆滿，叢薇，劉東旭，尹柏雙，李國江*

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學院，吉林吉林 132101；2.吉林省預防獸醫(yī)學重點實驗室，吉林吉林132101； 3.永吉縣動物疫病預防控制中心，吉林吉林132100)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是導致仔豬腹瀉死亡的主要原因之一，2012 -2017年全國各地區(qū)呈爆發(fā)趨勢且防治效果不明顯[1]。PED最明顯特點是3～7日齡新生仔豬高發(fā)，臨床表現(xiàn)為嚴重腹瀉、嘔吐、脫水，是致死率極高的腸道傳染病[2]。由于豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)為有囊膜不分節(jié)段單股正鏈RNA的結構特點[3]，研究發(fā)現(xiàn)S基因存在核苷酸插入與缺失及氨基酸突變、ORF3基因存在氨基酸變異[4-5]。部分地區(qū)PEDV流行株調(diào)查情況顯示，國內(nèi)大部分流行株親緣關系較近，與疫苗株CV777、中國早期分離株CH/S、韓國流行株DR13、泰國流行株TH/AY/2.7/12、日本株14JM/01等親緣關系較遠[6]，這可能是導致疫苗免疫效果不佳、PED暴發(fā)流行的主要原因。本研究通過PEDV膠體金試紙、RT-PCR檢測及臨床癥狀與病理剖檢相結合作為診斷方法，通過篩陽性樣本制備小腸組織滅活液，與原使用疫苗對比，評價免疫效果，為進一步驗證PEDV流行株的遺傳變異和分析PED的暴發(fā)流行及提供緊急防治措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及實驗動物 樣品來自2016年1月-2018年5月間，分布在吉林市、永吉、樺甸、舒蘭、蛟河、磐石地區(qū)3～7日齡仔豬發(fā)生嚴重腹瀉、嘔吐、脫水和死亡的30個豬場150份完整腸道樣本，保存于吉林農(nóng)業(yè)科技學院(吉林省豬生態(tài)養(yǎng)殖及疫病防控科技創(chuàng)新中心)-80 ℃冰箱；清潔級昆白鼠30只；產(chǎn)前90 d妊娠母豬72頭(校企合作產(chǎn)學研基地PEDV陽性場)。

1.2 主要試劑 PEDV膠體金檢測卡(韓國金諾)、組織DNA/RNA基因組通提試劑盒(日本TaKaRa9766)、反轉錄試劑盒(TaKaRa 6210A)、EX Tap聚合酶(日本TaKaRa)、瓊脂糖(西班牙BIOWEST)；PDEV ELISA抗體檢測試劑盒(北京飛凱)、50×TAE(北京博奧拓達)、0.9%生理鹽水、0.4%甲醛、雙抗、LB培養(yǎng)基等均為國產(chǎn)化學試劑。

1.3 PEDV膠體金試紙檢測 將病料置于4 ℃條件下解凍，用棉簽采集腸內(nèi)容物放入PEDV檢測樣品稀釋管(含稀釋液)中充分混勻，吸取上清液4～5滴至試紙條加樣孔中，室溫條件下5 min內(nèi)觀察結果。判定標準：C處出現(xiàn)紅色條帶檢測卡有效，T處出現(xiàn)紅色線條帶判定PED陽性。

1.4 PEDV RT-PCR檢測

1.4.1 引物設計 參考 GenBank 中公布的 PEDV CV777 毒株全基因序列(登錄號為 AF353511)，通過軟件設計1對引物用于擴增ORF3基因，將其命名為PED-ORF3U1/L1，目的擴增基因片段長度為792 bp，引物由博仕生物技術有限公司合成，引物信息見表1。

表1 PEDV CV777 ORF3引物信息Tab 1 Primer information of PEDV CV777 ORF3

1.4.2 病毒RNA提取與cDNA合成 將保存的病料反復凍融(解凍條件為4 ℃)三次，取小腸組織及內(nèi)容物20 mg，按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0方法提取樣品總RNA，置于-80 ℃保存。cDNA 的合成體系：Primescript RT Enzyme Mix 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、5×Primescript Buffer 4 μL、RNase Free ddH2O 4 μL、總RNA產(chǎn)物10 μL，最終總體系為20 μL，37 ℃孵育15 min。獲得的cDNA模板置于-80 ℃保存。

1.4.3 RT-PCR擴增 以合成的cDNA模板進行PDEV ORF3基因擴增，根據(jù)引物設計預期基因片段長度為792 bp。PCR反應體系：Premix Taq DNA酶12.5 μL、PEDV-ORF3 U1 2 μL、PEDV-ORF3 L1 2 μL、cDNA模板2.5 μL、ddH2O 6 μL，反應總體系為25 μL。擴增反應條件：45 ℃ 30 min，95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃ forever。取擴增產(chǎn)物3 μL上樣3%瓊脂糖凝膠孔，電泳電壓條件150 V。

1.5 小腸組織滅活液免疫效果分析

1.5.1 抗原滅活 按照病料來源分類，選取PEDV雙鑒定法陽性病料整段小腸及內(nèi)容物，按照病料重量與無菌生理鹽水(0 ℃預冷)1∶10比例5000 r/min勻漿，16層紗布無菌條件下過濾3次，0.4%比例加入甲醛充分混勻，37 ℃轉瓶滅活48 h，按1500 UI/mL體積比加入雙抗液(青霉素和鏈霉素)混勻，分裝后-20 ℃保存?zhèn)溆?。取上述滅活? μL分別接種LB固、液培養(yǎng)基，37 ℃ 48 h進行無菌檢驗。以0.5 mL、1.5 mL、3 mL劑量分別注射5只昆白鼠，同劑量生理鹽水注射組為對照，進行安全性評估。

1.5.2 免疫效果分析 選取3個防控無明顯效果且準備進行返飼的校企合作產(chǎn)學研基地PEDV陽性場，依次命名為A、B、C，24頭/場，每組12頭：a1-12原疫苗組、b1-12組織滅液組。分別于產(chǎn)前70 d、35 d后海穴注射4 mL/頭，產(chǎn)前2 d采集靜脈血，分離血清-20 ℃保存。參照PDEV ELISA抗體檢測試劑盒說明書進行抗體水平測定，結果判定：OD陽性對照≥0.4試驗有效，臨界值=0.3*OD陽性對照，OD樣本≥臨界值為陽性。新生仔豬發(fā)病率=(發(fā)病數(shù)/同組總頭數(shù))×100%、新生仔豬死亡率=(死亡數(shù)/同組總頭數(shù))×100%。

2 結果與分析

2.1 PEDV檢測結果 結合臨床和病理剖檢(圖1)、PEDV膠體金試紙及RT-PCR檢測結果綜合判定。在試紙卡中C、T位置出現(xiàn)紅色條帶證明PEDV陽性(圖2)，RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳在792 bp處出現(xiàn)條帶證明PEDV陽性(圖3)。疑似PEDV感染場采樣統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表2，吉林、永吉、舒蘭、磐石、蛟河、樺甸場陽性率依次為100%、100%、80%、80%、80%、60%，樣本陽性率依次為92%、84%、68%、76%、76%、56%，總體場陽性率76%，總體樣本陽性率75%。

圖1 臨床癥狀與病理剖檢結果Fig 1 Clinical symptoms and pathological examination results

C：檢測對照線；T：樣本檢測線 C: Test control line; T: Sample line圖2 PEDV膠體金試紙檢測結果Fig 2 Detection results of PEDV colloidal gold dipstick

M: DNA Marker DL 2000；1-6：檢測樣本 M: DNA Marker DL 2000；1-6：Test sample圖3 PEDV膠體金試紙檢測結果Fig 3 Detection results of PEDV colloidal gold dipstick

表2 疑似PEDV感染場檢測結果數(shù)據(jù)統(tǒng)計Tab 2 Statistics of detection results of suspected PEDV infection field

2.2 PDEV ELISA抗體檢測結果 抗體檢測結果如表3所示，三個試驗場組織滅活液組抗體平均值、標準差、陽性率均高于原疫苗組，而A場和C場離散度高于原疫苗組、B場低于原疫苗組，總體數(shù)據(jù)折線圖(圖4)表明，組織滅活液組抗體平均水平高于原疫苗組。

表3 PEDV ELISA抗體檢測結果Tab 3 Results of antibody detection by PEDV ELISA

圖4 PEDV總體抗體水平趨勢Fig 4 All trend of antibody level of PEDV

2.3 預防效果 使用來源于各自養(yǎng)殖場內(nèi)病料制備的小腸組織滅活液與原疫苗免疫進行對比分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明(表4)，A場發(fā)病率從68.5%下降到8.5%，死亡率從60.1%下降到8.5%；B場發(fā)病率從71.4%下降到16.1%，死亡率從68.3%下降到16.1%；C場發(fā)病率從58.7%下降到7.7%，死亡率從53.1%下降到7.7%。

表4 新生仔豬發(fā)病率、死亡率Tab 4 Morbidity and mortality of newborn piglets

3 討論與結論

仔豬感染PEDV在診斷過程中需要綜合考慮各種因素。RT-PCR是目前普遍采用的一種分子生物學檢測技術，具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點，但是通過復檢各地區(qū)部分檢測結果時，假陰、陽性的問題一直存在，在該流程中人為操作、主觀判斷、核酸污染等均可影響結果準確性。目前，膠體金試紙技術非常成熟，在應用過程中具有簡便、快速、直觀等優(yōu)勢，但與RT-PCR檢測結果復核時也存在一定差別。PED臨床癥狀和病理變化[7]較為典型，在此基礎上結合上述檢測方法，可提高PED臨床診斷準確性，實現(xiàn)及時預警，可有效防控PED流行與爆發(fā)，減少養(yǎng)殖企業(yè)經(jīng)濟損失。

全國各地區(qū)PEDV流行毒株與參考毒株ORF3和S基因同源性與系統(tǒng)進化研究結果表明，S基因存在核苷酸缺失、變異及突變，毒株之間存在部分差異[8-9]，與本研究中抗體檢測結果相互驗證，解釋了應用參考株疫苗雖然產(chǎn)生了抗體，但達不到預期免疫保護效果，而免疫滅活液卻效果顯著這一問題。

本試驗制備的免疫滅活液是自家苗的一種，具有高度同源性，解決了血清型不同和病原變異這一主要矛盾。當某些種類疫病爆發(fā)且無有效防治方法時，自家苗可作為一種緊急防治措施控制疫情。但值得注意的是，雖然臨時使用自家苗起到了明顯的防治效果，相對于返飼又具有較好的生物安全性，但是自家苗的病毒效價、注射劑量、免疫麻痹、含多種抗原導致的免疫應激、非目標病原以及雜質廢物等對機體的負面影響是需要慎重考慮的。建議在疫病防控中通過基因型比對等方法及時配型，使用標準化商用疫苗實現(xiàn)疫情的有效防控。

本研究結果表明，針對爆發(fā)PED且無有效防治效果，應用來源于場內(nèi)小腸組織病料重量與無菌生理鹽水(0 ℃預冷)1∶10比例、0.4%甲醛滅活48 h、1500 UI/mL雙抗制備的滅活液產(chǎn)前70 d、35 d后海穴注射4 mL/頭免疫妊娠母豬，可作為緊急防治措施有效防控PED疫情。