習(xí)碩，趙蕾，史愛華，章振華，李林，沈佳，崔麗娜，姜北宇，張建偉

(北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100097)

禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)是嚴(yán)重危害家禽和野禽的一種烈性傳染性病原，根據(jù)其臨床致病性差異，將其分為高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)[1]。其中，H9N2亞型低致病性禽流感病毒(LPAIV)感染禽類雖然引起的死亡率較低、臨床癥狀較輕，但仍然是威脅我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的重要病原之一[2]。H9 AIV不僅廣泛存在于活禽市場(chǎng)，還可以感染人[3-4]。有報(bào)道表明，目前流行的H9 AIV可以作為基因供體，為多種流感病毒提供內(nèi)部基因與其他亞型病毒重排，給新型流感病毒在人群中的大規(guī)模流行埋下了隱患[5]。通過疫苗免疫接種預(yù)防禽流感仍然是現(xiàn)今采用的主要手段。值得注意的是，近年來H9 AIV的變異現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，其中2011-2014年H9 VIA的變異速度是1999-2005年的10.64倍[6]。然而，AIV抗原大多利用非免疫雞胚制備，病毒在雞胚中的傳代是造成AIV基因變異的主要原因之一[7-8]；其次，禽流感流行需要大量疫苗時(shí)，有可能存在雞胚供應(yīng)不足的問題；同時(shí)，制苗用雞胚的來源不明，也有造成外源病毒污染的可能[9]。與傳統(tǒng)雞胚制苗方法比較，動(dòng)物懸浮細(xì)胞制備疫苗具有細(xì)胞來源和背景清晰，不含有外源病毒的優(yōu)點(diǎn)，病毒抗原穩(wěn)定，批間差異小，易于擴(kuò)大和大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。許多學(xué)者比較了MDCK貼壁細(xì)胞制備的人流感疫苗與雞胚源疫苗的效果，認(rèn)為兩種疫苗有著相當(dāng)?shù)拿庖咝Ч鸞10-12]。為了探討和驗(yàn)證由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所純懸浮馴化的MDCK細(xì)胞制備H9亞型AIV抗原疫苗免疫效力，進(jìn)行了MDCK細(xì)胞源疫苗和雞胚源H9亞型AIV疫苗的比較試驗(yàn)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 MDCK懸浮細(xì)胞株(MDCK-sus)由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所免疫與預(yù)防研究室購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的MDCK貼壁細(xì)胞自行馴化獲得，懸浮細(xì)胞批號(hào)為20190520，代次為MDCK-sus F10。

1.1.2 病毒株 制苗毒株：H9亞型AIV BX13株由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所免疫預(yù)防研究室2013年從北京某雞場(chǎng)分離、純化及鑒定，毒株代號(hào)為A/Chicken/Beijing/BX/13(H9N2)株(BX13)。制苗毒株為H9亞型AIV BX13株1-E3，批號(hào)：20170523，毒價(jià)為107.7EID50/0.1mL。攻毒毒株為H9亞型AIV BX13株1-E1，批號(hào)：20170411，毒價(jià)為108.7EID50/0.1mL。

1.1.3 雞胚 SPF雞胚購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司，在本研究室孵化至10日齡，用于毒種繁殖，毒價(jià)測(cè)定及攻毒后的分毒試驗(yàn)。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 21日齡SPF雞購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司，北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所SPF雞舍飼養(yǎng)。

1.1.5 HI抗原 HI工作抗原由本研究室制備，H9亞型AIV BX13株1-E3，批號(hào)：20170425，HA效價(jià)為29，使用時(shí)按照1∶128配制4HA工作抗原。

1.1.6 雞紅細(xì)胞懸液 1%雞紅血球由本研究室采集成年公雞血液制備，用于收獲的病毒液HA和試驗(yàn)雞的血清HI抗體測(cè)定。

1.1.7 主要試劑與耗材 無血清培養(yǎng)基MS01購(gòu)自蘇州市沃美生物技術(shù)有限公司；250 mL三角瓶購(gòu)自Corning公司。

1.1.8 儀器設(shè)備 細(xì)胞搖床購(gòu)自上海一恒科技有限公司；倒置顯微鏡購(gòu)自上海光學(xué)儀器廠；血球計(jì)數(shù)板購(gòu)自上海市求精生化試劑儀器有限公司；2L生物反應(yīng)器BioFlo?/CelliGen?115購(gòu)自美國(guó)NBS公司。

1.2 方法

1.2.1 疫苗制備 分別制備雞胚源和MDCK純懸浮細(xì)胞源疫苗。雞胚源疫苗抗原制備方法為取10萬倍稀釋的AIV BX13制苗毒株，接種10日齡SPF雞胚，每胚0.1 mL, 密封針孔，置37 ℃孵育，每24 h照蛋，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，收獲24 h～120 h內(nèi)死胚和120 h時(shí)活胚的雞胚尿囊液，測(cè)定其HA和EID50，用作制備雞胚源疫苗抗原。

MDCK細(xì)胞源疫苗抗原制備方法為將2L生物反應(yīng)器進(jìn)行清洗、安裝、高壓滅菌后冷卻備用，取生長(zhǎng)到一定密度的細(xì)胞，使用無血清MS01培養(yǎng)基制備成密度為2.0×106/mL ～2.5×106/mL的細(xì)胞懸液1L，以感染復(fù)數(shù)(MOI)0.01接種H9亞型禽流感病毒BX13株，同時(shí)按照3.5 μg/mL的終濃度加入TPCK-Trypsin，將以上細(xì)胞-病毒混合液加入到生物反應(yīng)器中，設(shè)置生物反應(yīng)器參數(shù)，溶氧DO為40%，pH 7.2，溫度33 ℃，攪拌速度60 r/min, 收獲培養(yǎng)72 h的抗原液，測(cè)定其HA和EID50，用作制備細(xì)胞源疫苗抗原。

疫苗制備方法為首先分別將2種抗原液加入終濃度為2 mL/L的甲醛溶液，置37 ℃恒溫?fù)u床內(nèi)滅活24 h。經(jīng)滅活檢驗(yàn)合格后取上述2種滅活抗原液，分別制備雞胚源抗原水相和細(xì)胞源抗原水相，同時(shí)制備油相，以油相∶水相比為2∶1的比例乳化制成油包水型滅活疫苗，配苗時(shí)收獲抗原液的病毒滴度均為107.7EID50/0.1mL。

1.2.2 疫苗物理性狀檢驗(yàn) 外觀：應(yīng)為白色均勻乳劑。劑型：取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均應(yīng)不擴(kuò)散。穩(wěn)定性：吸取疫苗10 mL加入離心管中，以3500 r/min離心15 min, 管底析出水相應(yīng)不超過0.5 mL。粘度：按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合規(guī)定。無菌檢驗(yàn)：按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。

1.2.3 免疫試驗(yàn)分組與免疫接種 90只21日齡SPF雞隨機(jī)分為9組，A1～A4組每組10只雞，分別胸肌注射雞胚源滅活疫苗，注射劑量為0.3、0.2、0.1、0.02 mL/只(107.7EID50/只、107.5EID50/只、107.2EID50/只、106.5EID50/只)；B1～B4組每組10只，分別胸肌注射MDCK懸浮源滅活疫苗，注射劑量為0.3、0.2、0.1、0.02 mL/只(107.7EID50/只、107.5EID50/只、107.2EID50/只、106.5EID50/只)；C組5只雞，不免疫接種，用于攻毒對(duì)照；D組5只雞為健康對(duì)照。

1.2.4 試驗(yàn)雞HI抗體檢測(cè) 各組雞均在免疫接種后7 d、14 d、21 d翅靜脈采血、分離血清，待檢測(cè)AIV HI抗體。

1.2.5 攻毒試驗(yàn) 免疫后21 d采血后，A1～A4, B1～B4，C組雞分別翅靜脈注射100倍稀釋的AIV BX13攻毒毒株, 每只0.5 mL(病毒含量107.4EID50), D組5只雞不做任何處理，為健康對(duì)照。

1.2.6 分毒試驗(yàn) 試驗(yàn)雞攻毒后第3天，分別采集每只雞的咽拭子和泄殖腔拭子，置于裝有0.8mL生理鹽水(含青、鏈霉素雙抗1萬單位，pH 7.2)的eppendorf管中，渦旋振蕩混勻后，3000 r/min離心5 min, 取同一只雞的咽拭子和泄殖腔拭子上清液混合作為1個(gè)樣品，尿囊腔接種5枚10日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚。接種后定期照蛋，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，收獲72～120 h死亡雞胚尿囊液，分別測(cè)定HA價(jià)，至120 h, 按照分組分別收獲活胚尿囊液，測(cè)定HA價(jià)。若同一只雞的樣品接種的5枚雞胚中有1枚雞胚的HA價(jià)≥4log2,該樣品判定為分毒陽性。若接種樣品的5枚雞胚均為陰性，取5枚雞胚尿囊液的混合液再接種5枚10齡SPF雞胚進(jìn)行盲傳，最終確定樣品的分毒結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 疫苗制備 參照《中國(guó)獸藥典》有關(guān)雞禽流感疫苗的檢驗(yàn)方法，對(duì)2種疫苗的試驗(yàn)室制品進(jìn)行了物理性狀和無菌檢驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 AIV BX13株雞胚源疫苗與MDCK細(xì)胞源疫苗物理性狀和無菌檢驗(yàn)Tab 1 Physical characters and sterility test of AIV BX13 strain of the two vaccines

2.2 血清HI抗體消長(zhǎng)規(guī)律 不同源和劑量疫苗免疫后7 d、14 d、21 d各組雞的血清HI抗體，結(jié)果見表2。免疫前隨機(jī)抽取90只21日齡試驗(yàn)雞中10只，測(cè)定其AIV HI抗體水平均為陰性。以不同免疫劑量的雞胚源疫苗和MDCK細(xì)胞源疫苗免疫21日齡SPF雞后7 d，AIV HI抗體水平為0log2；免后14 d和21 d, 兩種疫苗免疫雞的HI抗體滴度隨著免疫時(shí)間的增加而提高，同時(shí)也隨著免疫劑量的增加而提高，兩種疫苗免疫接種后21 d的 HI抗體也較免疫后7 d、14 d顯著提高。MDCK細(xì)胞源疫苗免疫組與雞胚源疫苗組均在免疫后21 d產(chǎn)生了更高水平的HI抗體。攻毒前攻毒對(duì)照組和健康對(duì)照組試驗(yàn)雞HI 抗體均為陰性。

表2 禽流感BX13株不同源疫苗和劑量免疫后抗體消長(zhǎng)規(guī)律Tab 2 Growth and decline of AIV BX13 HI titer after different source vaccines and doses of immunization

HI抗體單位log2

2.3 攻毒試驗(yàn)結(jié)果 攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果見表3。攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，雞胚源疫苗和細(xì)胞源疫苗免疫接種后21 d，用與制苗株同源的H9亞型 AIV BX13株翅靜脈攻毒，雞胚源疫苗免疫雞的接種劑量為0.1 mL/只雞(107.2EID50/只)以上時(shí)，試驗(yàn)雞的攻毒保護(hù)率達(dá)到100%；MDCK細(xì)胞源疫苗免疫雞的免疫劑量為0.2 mL/只雞(107.5EID50/只)以上時(shí)，試驗(yàn)雞的攻毒保護(hù)率達(dá)到100%。攻毒對(duì)照雞均100%分毒陽性，健康對(duì)照雞分毒陰性。

表3 2種滅活疫苗不同免疫接種劑量的攻毒試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 The challenge results of the 2 vaccines with different immune doses

攻毒試驗(yàn)結(jié)果：陽性數(shù)/攻毒數(shù)(健康對(duì)照除外))

2.4 抗體水平與分毒陽性率的關(guān)系 抗體水平與分毒率關(guān)系結(jié)果分別見表4和表5。雞胚源疫苗免疫后，3只AIV HI抗體為0log2～3log2的試驗(yàn)雞均分毒陽性，5只AIV HI 抗體4log2～5log2的試驗(yàn)雞均毒陰性， 7只AIV HI抗體為6的試驗(yàn)雞1只分毒陽性，25只AIV HI 抗體為7log2～11log2的試驗(yàn)雞，分毒陽性率為0，試驗(yàn)雞均保護(hù)；MDCK細(xì)胞源疫苗免疫組，3只AIV HI抗體水平為0log2～3log2的試驗(yàn)雞分毒陽性，9只AIV HI 抗體為4log2、5log2、6log2的試驗(yàn)雞5只病毒分離陽性，12只AIV HI抗體為7log2的雞1只分毒陽性，16只AIV HI抗體水平為8log2～10log2的試驗(yàn)雞均未分離到病毒，100%保護(hù)。

表4 雞胚源疫苗免疫后抗體水平與攻毒保護(hù)率的關(guān)系Tab 4 The relationship of AIV HI titer to the protection rate after chicken embryo-derived vaccine immunization

表5 MDCK細(xì)胞源疫苗免疫后抗體水平與保護(hù)率的關(guān)系Tab 5 The relationship of AIV HI titer to the protection rate after cell-derived vaccine immunization

3 討論與結(jié)論

本研究分別采用雞胚培養(yǎng)的方式和純懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的方式制備了2種H9亞型AIV BX13株滅活疫苗，以不同劑量(0.02、0.1、0.2和0.3 mL/只)免疫接種21日齡SPF雞后兩種疫苗均能誘發(fā)雞只產(chǎn)生AIV HI抗體，免疫雞的AIV HI抗體水平均隨著免疫劑量的增加而提高。2種疫苗免疫后7 d均未檢測(cè)到AIV HI抗體，免疫后14 d最高免疫劑量組雞胚源疫苗免疫雞的AIV HI抗體滴度最高達(dá)到3.6log2，MDCK細(xì)胞源疫苗AIV HI抗體滴度最高達(dá)到4.6log2，細(xì)胞源疫苗組稍高。免疫后21 d，兩種疫苗免疫雞的AIV HI抗體水平明顯高于免后14 d,結(jié)果說明免疫時(shí)間和AIV HI抗體水平呈正相關(guān)。當(dāng)免疫劑量為0.1～0.3 mL/只時(shí)，雞胚源疫苗的抗體水平為7.0log2～8.8log2，細(xì)胞源疫苗的抗體水平為7.2log2～8.3log2。張建偉等[13]使用微載體懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞制備禽流感病毒疫苗，證明MDCK細(xì)胞制備的禽流感病毒疫苗具有較好的免疫效果，使用不同劑量接種21日齡SPF雞，免后21 d HI抗體水平最高為5.6log2，如果以免疫后抗體水平評(píng)價(jià)免疫效果，與本研究對(duì)比，免疫劑量相同時(shí)，純懸浮細(xì)胞源疫苗免疫效果明顯高于貼壁培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞源疫苗。

攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究中相同免疫劑量時(shí)，雞胚源疫苗的保護(hù)效果高于純懸浮MDCK細(xì)胞制備的H9亞型AIV疫苗，雞胚源病毒液制備的疫苗以0.1 mL/只(107.2EID50/只)劑量免疫就可以達(dá)到100%保護(hù)；細(xì)胞源病毒液制備的疫苗抗原以0.1 mL/只(107.2EID50/只)劑量免疫保護(hù)率為80%，當(dāng)免疫劑量達(dá)到0.2～0.3 mL/只(107.5EID50/只～107.7EID50/只)時(shí)，保護(hù)率達(dá)到100%，說明當(dāng)免疫劑量為0.2 mL/只(107.5EID50/只)以上時(shí)，雞胚源疫苗和MDCK細(xì)胞源疫苗的攻毒保護(hù)率無顯著差異。免疫劑量相同時(shí)，雞胚源疫苗免疫效果高于細(xì)胞源疫苗的原因尚不清楚，筆者認(rèn)為有以下幾種原因，病毒在MDCK細(xì)胞中傳代是否會(huì)導(dǎo)致病毒變異，抗原液中的MDCK細(xì)胞組分是否影響雞的免疫應(yīng)答，是否存在試驗(yàn)雞只的個(gè)體差異等都有待進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)和深入研究。

鮮有學(xué)者針對(duì)使用懸浮MDCK細(xì)胞制備禽流感疫苗免疫雞后產(chǎn)生的抗體水平與分毒陽性率的關(guān)系做過比較，本試驗(yàn)分析了2種疫苗免疫試驗(yàn)雞后21 d，HI抗體滴度與分毒陽性率之間的關(guān)系。當(dāng)使用雞胚源疫苗免疫時(shí)，15只AIV HI抗體水平為0log2～6log2的試驗(yàn)雞有4只分毒陽性，其中1只AIV HI為6log2也分毒陽性，因此不排除抗體水平為4log2～6log2雞只感染AIV后向環(huán)境排毒的風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng)AIV HI抗體水平為7log2～11log2時(shí)，所有免疫雞均未分離到病毒，說明使用雞胚源抗原制備H9亞型AIV BX13株疫苗免疫試驗(yàn)雞，當(dāng)HI抗體滴度達(dá)到7log2時(shí)，即可阻止雞只排毒。當(dāng)使用MDCK細(xì)胞源疫苗免疫時(shí)，24只AIV HI抗體水平為0log2～7log2的試驗(yàn)雞中9只分毒陽性，其中4只AIV HI抗體水平為6log2～7log2的試驗(yàn)雞病毒分離陽性，說明細(xì)胞源疫苗的免疫效力可能稍低于雞胚源疫苗，是疫苗本身的原因還是試驗(yàn)雞只的個(gè)體原因尚待進(jìn)一步確認(rèn)，當(dāng)細(xì)胞源疫苗免疫雞的AIV HI抗體水平達(dá)到8log2以上時(shí)，雞只停止向外排毒，說明該抗體水平可以有效抑制病毒的排放。綜上所述，抗體水平與排毒有明顯相關(guān)性，雞胚苗源疫苗的AIV HI抗體滴度達(dá)到7log2，細(xì)胞苗源疫苗的AIV HI達(dá)到8log2時(shí)均可抑制病毒排放，本研究由于統(tǒng)計(jì)數(shù)量較少，也由于雞只個(gè)體間存在差異，結(jié)論尚需更多數(shù)據(jù)驗(yàn)證。

本研究顯示，如果用攻毒保護(hù)率評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果，細(xì)胞苗與雞胚苗尚有差異，但差異不大，通過進(jìn)一步篩選對(duì)AIV敏感的細(xì)胞株和改進(jìn)培養(yǎng)工藝，或許可以獲得高產(chǎn)細(xì)胞株和高毒價(jià)的抗原，通過提高毒價(jià)獲得與雞胚苗一致的保護(hù)率的疫苗是可能的。

本研究的目的是找到一種能夠替代雞胚制備AIV疫苗抗原的方法，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，AIV在MDCK懸浮細(xì)胞上的增殖能力與MDCK貼壁細(xì)胞相當(dāng)，可獲得較高的病毒滴度，但貼壁細(xì)胞增殖病毒工藝復(fù)雜，同一批次細(xì)胞瓶中的病毒滴度也存在差異[14]。因此，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞增殖AIV成為了研究熱點(diǎn)。本研究采用純懸浮的MDCK細(xì)胞接種AIV制備抗原和疫苗，通過AIV HI抗體檢測(cè)和攻毒試驗(yàn)證明純懸浮培養(yǎng)方式制備的AIV疫苗具有較好的免疫效果，使用該疫苗免疫SPF雞，0.1 mL/只以上的免疫劑量免疫SPF雞后21 d，抗體水平達(dá)到7.2log2～8.3log2, 0.2 mL/只的免疫劑量即可保護(hù)100%的雞不向外界排毒，證明懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞制備的禽流感疫苗免疫效力確實(shí)可靠。本研究的結(jié)果為后續(xù)繼續(xù)篩選對(duì)AIV增殖效率更高的MDCK細(xì)胞株和利用純懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞制備AIV疫苗抗原奠定了基礎(chǔ)。