符金華， 楊琳芬， 董澤民 ， 徐國茂， 姜文娟， 葉 金，吳 宇， 邢 磊， 劉國花， 樊 晶， 周仁丹， 廖 豐

（1.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌330029；2.國家糧食局科學(xué)研究院，北京100037；3.南昌大學(xué)分析測試中心，江西南昌330047；4.雙胞胎（集團(tuán)）股份有限公司，江西南昌330096）

隨著檢測技術(shù)的飛速發(fā)展， 儀器設(shè)備的迭代更新，高精密度的儀器應(yīng)用越來越普遍。 其中，液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）是目前痕量物質(zhì)定性和定量分析的首選， 其兼具液相色譜與質(zhì)譜技術(shù)的優(yōu)點，具有高靈敏度和精確度，并大大縮 短 分 析 時 間 （Ito 等，2002； Matuszewski 等，2000；Sutherland 等，2000；Fu 等，1998）。 然而，在含相同濃度的待測物標(biāo)準(zhǔn)溶液和飼料等畜產(chǎn)品樣品通過LC-MS 分析時，某些待測物的質(zhì)譜響應(yīng)發(fā)生顯著的增強(qiáng)或抑制， 尤其在縮短色譜分離時間時更為顯著（Bogialli 等，2003），這種現(xiàn)象即為質(zhì)譜檢測中的“基質(zhì)效應(yīng)”（ME）?；|(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的主要原因有以下幾個方面：（1）樣品中其他基質(zhì)成分與目標(biāo)物在離子化階段發(fā)生互相競爭， 從而會顯著地降低或增加目標(biāo)物的離子化效率及離子強(qiáng)度；（2）源于樣品在前處理過程中使用的部分試劑或藥物溶劑，如吐溫-80、聚乙二醇-400（Xu 等，2010）、Tris 緩沖液、NADPH 等（Pellati 等，2002）；（3） 不恰當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)會與待測物競爭液滴表面的電荷而導(dǎo)致離子強(qiáng)度變化（Liang 等，2010）。因此，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重影響目標(biāo)化合物的LC-MS 定量分析準(zhǔn)確度和精密度， 在應(yīng)用LC-MS 技術(shù)測定時，必須重視基質(zhì)效應(yīng)的影響及作為方法學(xué)考察的重要部分（林濤等，2015； 卞愧等，2014；Rogatsky 等，2005；Ito 等，2002）。

真菌毒素具有高毒性和強(qiáng)致癌性， 嚴(yán)重危害人、畜健康，威脅食品安全并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失（符金華等，2017）。 本研究針對目前農(nóng)產(chǎn)品、飼料、飼料原料中真菌毒素污染較為普遍的現(xiàn)狀，旨在利用超高效液相色譜-三重四級桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（Qtrap-UPLC-MS/MS） 技術(shù)建立一種快速定性、定量分析飼料、飼料原料、奶和肉樣品中16 種真菌毒素的分析方法（符金華等，2019、2017；張大偉等，2018；楊琳芬等，2017）。在整個定量線性范圍內(nèi)，以目標(biāo)物在空白基質(zhì)液中的峰面積與溶劑中峰面積的百分比來系統(tǒng)地探究常見的5 大類配合飼料（魚、豬、鴨、雞和牛）、5 種飼料原料（豆粕、魚粉、菜籽粕、菜粕及DDGS）等25 種樣品的基質(zhì)效應(yīng)對常見16 種真菌毒素測定的干擾， 并提出針對性的消除措施， 為提高Qtrap-UPLC-MS/MS 法測定16種真菌毒素結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑 質(zhì)譜型號為Sciex4500 Qtrap（美國Sciex 公司）；液相為島津LC-20AD XR（日本Shimadzu 公司）；赫西離心機(jī)（中國湖南赫西儀器裝備有限公司）；HY-3 多功能振蕩器 （中國江蘇光都機(jī)電設(shè)備有限公司）：Milli-Q 超純水純化系統(tǒng) （美國Millipore 公司），METTLER TOLEDO ME104 分析天平（中國梅特勒-托利多（上海）有限公司）。

雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-Ac-DON）、15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 （15-Ac-DON）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-3-葡萄糖苷（DON-3G）、T-2 毒素（T-2）、HT-2 毒素（HT-2）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、赭曲霉毒素A（OTA）、伏馬毒素B1（FB1）、伏馬毒素B2（FB2）、雜色曲霉毒素（ST）標(biāo)準(zhǔn)溶液 （濃度為0.2 ～ 20 μg/mL，Romer 公司）；黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為0.03 ～1 μg/mL，Sigma-Aldrich 公司）；13C 標(biāo)記的黃曲霉毒素（B1、B2、G1、G2）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、 雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙?；撗跹└牭毒┐?、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏馬毒素（B1、B2）、T-2 毒素、HT-2 毒素、雜色曲霉毒素的14 種穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液 （濃度為0.01 ～2.5 μg/mL，Romer 公司）；甲醇、乙 腈（HPLC 級，F(xiàn)isher 公司）；乙酸銨、甲酸、乙酸（HPLC 級，美國Sigma 公司）；0.2 μm PTFE 膜針頭過濾器（PALL公司）。

1.2 液相色譜條件 Waters 公司CORTECSTM UPLC C18柱（100 mm × 2.1 mm，1.6 μm）；柱溫40℃； 進(jìn)樣量2 μL； 流動相A 為甲醇，B 為含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）的甲酸和1 mmol/L 乙酸銨的水溶液；流速為0.3 mL/min；采用梯度洗脫。

1.3 質(zhì)譜條件 加熱電噴霧離子源溫度為500 ℃；噴霧電壓為5500 V； 離子傳輸管溫度為320 ℃；gas1 和gas2 均為50 psi，氣簾氣為35 psi。 EPI 掃描速度10000 Da/s， 掃描質(zhì)量范圍為50 ～1000，分段多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式，MRM 檢測窗口設(shè)置為30 s，錐孔電壓50 V；正、負(fù)離子采集。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別移取一定體積的16 種霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容， 得到16 種霉菌毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃保存，濃度詳見表1。

表1 真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液及相應(yīng)的穩(wěn)定同位素混合溶液的濃度 g/mL

穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)混合工作液： 根據(jù)表1 相應(yīng)的穩(wěn)定同位素混合溶液的濃度， 分別移取一定體積的14 種霉菌毒素穩(wěn)定同位素單標(biāo)溶液于4 mL儲液瓶中， 用水稀釋至2 mL 配制穩(wěn)定同位素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混勻后于-20 ℃避光保存。 準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液適量，用乙腈-水-乙酸溶液（35:64.5:0.5）逐級稀釋，配制成不同濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。 向400 μL 內(nèi)插管中加入20 μL 14 種穩(wěn)定同位素混合工作液， 再分別吸取180 μL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液于內(nèi)插管中， 渦旋混勻后準(zhǔn)備上機(jī)檢測。

1.5 樣品前處理方法 稱取飼料樣品 （5±0.1）g于50 mL 離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL 乙腈-水-乙酸溶液（V/V/V，70：29：1，）提取溶劑，渦旋2 min，振蕩30 min，以4000 r/min 離心10 min 使固液分離。 準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移0.5 mL 上清液于1.5 mL 離心管中，加入0.5 mL 水稀釋， 渦旋混勻1 min， 然后以12000 r/min 離心10 min，取上清液用0.22 μm 的PTFE 濾膜過濾， 吸取20 μL 預(yù)先渦旋混勻的穩(wěn)定同位素混合溶液于400 μL 內(nèi)插管中， 再加入180 μL 的樣品濾液，混合后待測。

2 結(jié)果與討論

本研究以目標(biāo)物在空白基質(zhì)液中的峰面積與溶劑中峰面積的百分比來系統(tǒng)評估25 種樣品的基質(zhì)效應(yīng)。 當(dāng)結(jié)果接近100%時，表明無明顯的基質(zhì)效應(yīng)，而高于100%說明有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，低于100%則說明有基質(zhì)抑制效應(yīng)。16 種真菌毒素在5大類配合飼料和5 種飼料原料中的基質(zhì)效應(yīng)如圖1 ～圖6 所示。

由圖1 可知，16 種真菌毒素在魚飼料中的基質(zhì)效應(yīng)為48.6% ～145.4%。其中T-2/OTA/FB1/FB2四種毒素的基質(zhì)效應(yīng)為101.7% ～145.4%， 且有不同程度依次增大的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。 其他毒素都存在不同程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)， 基質(zhì)效應(yīng)為48.6% ～99.5%。 同時，五種魚配合飼料的基質(zhì)效應(yīng)呈現(xiàn)一致規(guī)律性變化，16 種真菌毒素的整體基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)， 這可能與魚飼料中含有較多的植物性原料有關(guān)， 如菜粕和菜籽粕會引入大量色素等有機(jī)質(zhì)， 樣品的提取上清液顏色明顯比其他基質(zhì)的更深，最終導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)。

圖2 結(jié)果顯示，16 種真菌毒素在豬飼料中的基質(zhì)效應(yīng)為41.8% ～146.4%， 其中ST/T-2/OTA/HT2/FB2/FB1六種毒素的基質(zhì)效應(yīng)為101.8% ～146.4%，且為依次增強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。 其他的毒素基質(zhì)效應(yīng)為41.8% ～99.6%， 都存在不同程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)， 且6 種豬飼料的基質(zhì)效應(yīng)也呈現(xiàn)一致規(guī)律性變化。 同時， 絕大部分毒素的基質(zhì)效應(yīng)處于61.5% ～109.5%， 相對魚飼料來說，其基質(zhì)效應(yīng)的程度更弱。

圖1 16 種真菌毒素在5 種魚飼料基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)

圖2 16 種真菌毒素在6 種豬飼料基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)

由圖3 所示，16 種真菌毒素在鴨飼料中的基質(zhì)效應(yīng)為43.2% ～148.1%， 其中肉鴨料中T-2/OTA/FB2/FB1四種真菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)為101.7% ～148.1%，呈現(xiàn)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。其他的毒素都存在不同強(qiáng)弱的基質(zhì)抑制效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)為70.6% ～98.6%。然而，蛋鴨飼料出現(xiàn)了不同于另兩種鴨飼料的基質(zhì)效應(yīng)，DON/3-AcDON/15-Ac-DON 三種真菌毒素出現(xiàn)了106.8% ～137.4%的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，而出現(xiàn)在魚、豬等飼料中基質(zhì)增強(qiáng)的T-2/OTA/FB2/FB1等毒素出現(xiàn)基質(zhì)抑制現(xiàn)象，這個可能與蛋鴨料中的蛋白質(zhì)等其他營養(yǎng)成分含量較高有關(guān)。

圖3 16 種真菌毒素在3 種鴨飼料基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)

由圖4 可知，16 種真菌毒素在不同種類雞飼料中的基質(zhì)效應(yīng)為42.1% ～148.3%。 其中T-2/OTA/HT-2/FB2/FB1五種毒素出現(xiàn)了依次增大的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)， 基質(zhì)效應(yīng)為103.9% ～148.3%，F(xiàn)B2/FB1兩種毒素的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)嚴(yán)重。其他的毒素都存在不同強(qiáng)弱的基質(zhì)抑制效應(yīng)， 且絕大部分毒素的基質(zhì)效應(yīng)處于67.5% ～89.1%， 說明該基質(zhì)效應(yīng)抑制程度較其他飼料要弱一些。 同時，五種雞飼料的基質(zhì)效應(yīng)呈現(xiàn)一致規(guī)律性變化。

圖4 16 種真菌毒素在5 種雞飼料基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)

由圖5 可知，16 種真菌毒素在犢牛飼料中的基質(zhì)效應(yīng)為50.3% ～140.8%，其中ST/T-2/HT-2/OTA/FB2/FB1六種毒素出現(xiàn)了依次增大的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)， 基質(zhì)效應(yīng)為105.4% ～140.8%， 且FB2/FB1兩種毒素的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)嚴(yán)重。 其他的毒素都存在不同強(qiáng)弱的基質(zhì)抑制效應(yīng)， 且絕大部分毒素的基質(zhì)效應(yīng)處于66.0% ～86.7%， 說明該基質(zhì)抑制效應(yīng)程度不太明顯。

圖5 16 種真菌毒素在牛飼料基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)

由圖6 可知，16 種真菌毒素在5 種常見飼料原料中的基質(zhì)效應(yīng)為30.7% ～148.6%，其中T-2/OTA/FB2/FB1四種毒素出現(xiàn)了依次增大的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)為100.6% ～148.6%，其他的毒素都存在不同強(qiáng)弱的基質(zhì)抑制效應(yīng)。 豆粕和魚粉的基質(zhì)效應(yīng)較弱，但菜粕、菜籽粕和DDGS 三種原料的基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重，且DDGS 最為嚴(yán)重。這可能是由于菜粕中含有較多的色素， 菜籽粕中含有較多的色素和油脂，DDGS 中含有大量的小分子蛋白質(zhì)和有機(jī)酸等有機(jī)物， 從而產(chǎn)生了較強(qiáng)的基質(zhì)干擾。同時，五種飼料原料的基質(zhì)效應(yīng)呈現(xiàn)一致規(guī)律性變化。

圖6 16 種真菌毒素在飼料原料基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)

以上研究結(jié)果表明， 在這幾大類常見動物飼料和原料的基質(zhì)中存在一定的基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng)。T-2/OTA/FB2/FB1等四種真菌毒素的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)明顯，AFB1/AFB2/DON/DON-3G/NIV 等幾種毒素基質(zhì)抑制效應(yīng)明顯。因此，要精確定量測定飼料及原料中常見的16 種真菌毒素，需要采取正確的措施來盡量消除或減弱基質(zhì)效應(yīng)。 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線是一種常見的減少基質(zhì)效應(yīng)的方法， 但是由于自然狀態(tài)下真菌毒素的污染具有普遍性，導(dǎo)致實際工作中不易獲得均不含16 種真菌毒素的空白基質(zhì)樣品， 特別是完全匹配的基質(zhì)樣品更是難上加難， 從而使得代表性基質(zhì)樣品的普適性面臨挑戰(zhàn)，具有較大的不確定性，最終導(dǎo)致基質(zhì)匹配定量在標(biāo)準(zhǔn)化檢測中的應(yīng)用受到局限。然而，穩(wěn)定同位素法是另一種能夠較好消除基質(zhì)干擾的途徑。為了更好消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，本實驗采用穩(wěn)定同位素稀釋法進(jìn)行定量， 以確保結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。結(jié)果證明，穩(wěn)定同位素稀釋法能夠精確定量測定飼料及原料中常見16 種真菌毒素。

以穩(wěn)定同位素稀釋法進(jìn)行定量結(jié)果表明，在一定的線性范圍內(nèi)，16 種真菌毒素線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均＞0.998。 對混合標(biāo)準(zhǔn)添加溶液進(jìn)行逐級稀釋，以3 倍信噪比（S/N）計算檢出限（LOD） 為0.12 ～65 μg/kg，10 倍S/N 計算定量下限（LOQ） 為0.50 ～200 μg/kg。 16 種真菌毒的LOQ 均低于我國和歐盟規(guī)定的飼料及原料中的限量值，取16 種霉菌毒素含量較低（低于方法檢出限） 的5 類常見配合飼料和5 種常見飼料原料樣品。 分別添加高、中、低3 個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個加標(biāo)水平進(jìn)行6 次重復(fù)實驗。 16 種霉菌毒素在5 種常見配合飼料中的回收率絕大數(shù)都在70.2% ～129.5%，16 種霉菌毒素在5 種常見配合飼料中的回收率絕大數(shù)都在66.4% ～128.9%， 且16 種真菌毒素回收率的RSD 值為0.1% ～14.5%。 兩大類基質(zhì)中的回收率和RSD 均符合相關(guān)法規(guī)的檢測要求， 說明本方法準(zhǔn)確度和精密度可以滿足日常檢測的需要。

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，5 大類配合飼料和5 種飼料原料等25 種樣品基質(zhì)對16 種真菌毒素的精確定量測定均存在不同程度的基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng)。 采用同位素稀釋技術(shù)能夠有效地消除基質(zhì)效應(yīng)， 方法準(zhǔn)確度和精密度可滿足于飼料及飼料原料中常見真菌毒素的殘留檢測分析的需要， 為快速精準(zhǔn)測定飼料及原料中16 種真菌毒素的污染防控提供了科學(xué)參考。