于滿滿， 張美美， 孫悠然， 謝小來

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

反芻動物瘤胃內(nèi)存在著大量、 復(fù)雜的微生物菌群，其中非致病性微生物主要包括瘤胃細(xì)菌、厭氧真菌和瘤胃原蟲（嚴(yán)淑紅，2016）。這3 種微生物之間相互協(xié)同與競爭， 是瘤胃微生態(tài)保持動態(tài)平衡的重要因素，是促進(jìn)反芻動物生長發(fā)育，維持機(jī)體健康的前提。 瘤胃微生物的生長發(fā)育受動物年齡、品種、地域環(huán)境、季節(jié)和飼料種類等不同因素影響（李嵐捷，2017），而粗飼料則是影響瘤胃微生物區(qū)系的最直接因素， 不同粗飼料種類及其組合對瘤胃微生物菌群的影響各不相同， 研究粗飼料組合對瘤胃微生物區(qū)系的影響意義重大。

苜蓿是反芻動物飼養(yǎng)中重要的粗飼料， 營養(yǎng)價值很高，蛋白質(zhì)含量約為20%以上，粗纖維約為25%，且可消化粗纖維比例較高，氨基酸組合平衡，維生素含量豐富，但其價格也相對較高，飼養(yǎng)成本提高（Blümmel 等，2010）。 許多研究表明，氨化時秸稈中有機(jī)物與氨發(fā)生氨解作用， 破壞了木質(zhì)素與纖維素之間的酯鍵， 形成銨鹽為瘤胃微生物提供氮源，從而提高了瘤胃微生物活力，改善了秸稈營養(yǎng)價值（Saenger 等，1982），在國內(nèi)外均有廣泛的應(yīng)用。 氨化處理后的秸稈其粗蛋白質(zhì)含量、采食量（Fernando 等，2010；Herrerasaldana 等，1983）以及有機(jī)物、酸性洗滌纖維和干物質(zhì)消化率均有所提高（Herrerasaldana 等，1983），從而提高反芻動物的生產(chǎn)性能。因此，本研究將苜蓿干草和氨化玉米秸稈以不同比例混合， 旨在探究兩種粗飼料原料的最優(yōu)組合， 為今后優(yōu)化反芻動物飼料組合， 降低畜牧業(yè)飼養(yǎng)成本和提高飼料利用率提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及前處理 苜蓿（AM）采自黑龍江省哈爾濱市雙城區(qū)雀巢DFI 奶牛場；氨化玉米秸稈（ACS）由黑龍江省哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供。 其中，氨化玉米秸稈由高壓氨化系統(tǒng)制備，即將新鮮玉米秸稈晾曬至其含水量為10%左右后，置于高壓氨化設(shè)備中，充入氨氣，在0.3 Mpa 壓力條件下，氨化3 h 制得氨化玉米秸稈試驗(yàn)樣品。 飼料樣品經(jīng)65 ℃干燥制成風(fēng)干樣，經(jīng)1 mm 篩粉碎后過40 目篩，密封保存以備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計 采用單因子試驗(yàn)設(shè)計，AM 和ACS 以100∶0、80∶20、60∶40、50∶50、40∶60、20∶80 和0∶100 比例進(jìn)行組合，每種組合3 個重復(fù)，同時設(shè)置3 個空白樣品（發(fā)酵管中不加發(fā)酵底物）。

1.3 體外發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn) 試驗(yàn)選擇3 頭健康狀況良好、年齡相近、體重（550±50）kg、裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛（干奶期），并于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)阿城實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行瘤胃液的采集工作。 試驗(yàn)牛精料（每頭4 kg/d）被等分為2 份，分別在7:00 和17:00 飼喂，粗飼料為干羊草，自由采食和飲水。 瘤胃液供體牛精料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 精料組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.4 瘤胃DNA 的提取 參考天根TIANamp Stool DNA Kit 糞便基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型，目錄號： DP328）說明書，提取瘤胃微生物總DNA。 利用紫外分光光度計對OD260/OD280純度及DNA 的濃度進(jìn)行檢測， 并用Marker 為DL2000，0.8%和1%瓊脂糖凝膠電泳分別檢測瘤胃微生物總DNA 和瘤胃微生物DNA 的完整性，利用凝膠成像分析系統(tǒng)在電泳結(jié)束后進(jìn)行攝像。

1.5 體外發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn) 試驗(yàn)根據(jù)Menke 等（1988）及Schofield 等（1995）方法進(jìn)行。 準(zhǔn)確稱取200 mg 飼料組合樣品（DM 基礎(chǔ)）裝入2.0 cm×3.0 cm 的尼龍袋（50 μm）后，置于發(fā)酵管（100 mL 玻璃注射器）底部。 試驗(yàn)當(dāng)日，于晨飼前2 h 采集3頭牛不同位點(diǎn)的瘤胃液， 經(jīng)4 層紗布過濾后放入預(yù)熱并充滿CO2的保溫瓶，密封后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。將人工瘤胃緩沖液和瘤胃液按比例混合（瘤胃液體積∶緩沖液體積=1∶2，39 ℃水浴保溫），其中緩沖液參照Menke 等（1988）配制方法。 每個發(fā)酵管準(zhǔn)確抽取30 mL 人工瘤胃液，操作過程持續(xù)通入CO2直至接種完畢。 將接種好的發(fā)酵管中排出全部氣體后， 立即用止流夾封住發(fā)酵管針頭部分的橡膠管，密封后置于39 ℃的恒溫水浴搖床中培養(yǎng)48 h 后終止發(fā)酵。

1.6 測定指標(biāo)及方法

1.6.1 粗飼料常規(guī)成分 干物質(zhì)（DM）、粗蛋白質(zhì)（CP）、粗脂肪（EE）和粗灰分（Ash）的測定分析過程參照國標(biāo)相關(guān)規(guī)定操作。中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）利用ANKON 半自動纖維測量儀進(jìn)行測定。 不同比例氨化秸稈替代苜蓿的營養(yǎng)成分含量計算公式如下：

AB 飼草組合營養(yǎng)成分含量=A 飼草比例×A飼草營養(yǎng)成分含量+B 飼草比例×B 飼草營養(yǎng)成分含量；

瘤胃微生物相對數(shù)量表示為相對于瘤胃總細(xì)菌16S rDNA 的百分比，公式如下：

目標(biāo)菌相對數(shù)量/%=2-（Ct目標(biāo)菌-Ct 總細(xì)菌）×100；

式中：Ct 目標(biāo)菌為目標(biāo)菌引物所測的Ct 值，Ct 總細(xì)菌為以總細(xì)菌為引物所得的Ct 值。

1.6.2 瘤胃微生物 試驗(yàn)測定的瘤胃微生物包括產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球、真菌、溶纖維丁酸弧菌和原蟲。 在發(fā)酵試驗(yàn)后3、6、12、24、48 h 時，取一部分發(fā)酵培養(yǎng)液快速置于液氮罐中并轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存， 用于瘤胃微生物DNA 的提取。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016 進(jìn)行簡單處理和分析后， 再利用SPSS 19.0軟件中的單因子方差分析 （one-way ANOVA，LSD），并進(jìn)行Duncan 氏多重比較檢驗(yàn)。 結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P ＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 氨化秸稈與苜蓿組合對其營養(yǎng)成分的影響表2 為7 組不同比例氨化秸稈和苜蓿組合的營養(yǎng)成分。結(jié)果表明，不同比例氨化秸稈和苜蓿組合的各組DM 含量相差較小，AM:ACS （100:0） 組與AM:ACS（0:100）組DM 含量僅相差1.2%；CP、EE和Ash 的含量隨氨化秸稈添加比例的提高而不斷降低；ADF 和NDF 的含量隨著氨化秸稈添加比例的提高而不斷增加。

表2 氨化秸稈與苜蓿不同比例組合的營養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)） %

2.2 瘤胃微生物DNA 的Real-time PCR 定量結(jié)果 由各菌群相對數(shù)量的變化趨勢圖（如圖1～圖6） 可知， 不同比例氨化秸稈和苜蓿組合對體外發(fā)酵48 h 后幾種瘤胃微生物產(chǎn)生不同程度的影響。 從整體變化趨勢上看，在發(fā)酵48 h 后，與發(fā)酵3 h 時各菌群的相對數(shù)量相比，黃色瘤胃球菌和原蟲的相對數(shù)量顯著降低 （P ＜0.05），而產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌和真菌的相對數(shù)量則顯著上升（P ＜0.05），溶纖維丁酸弧菌的相對數(shù)量無明顯變化。 由表3 可知，在發(fā)酵48 h時，原蟲的相對數(shù)量在所測定的瘤胃微生物中數(shù)量最多，而真菌的相對數(shù)量最少；在三種主要的纖維分解菌中，白色瘤胃球菌的相對數(shù)量明顯高于黃色瘤胃球菌，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的相對數(shù)量顯著高于（P ＜0.05）其他兩種纖維分解菌，且隨著氨化秸稈添加比例的提高整體呈上升趨勢，其中AM:ACS（20:80）組的黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的相對數(shù)量達(dá)到最高值， 分別為0.036%和0.26%。

表3 氨化秸稈與苜蓿不同比例組合對體外發(fā)酵48 h 時瘤胃微生物區(qū)系的影響16S rDNA%

圖1 氨化秸稈與苜蓿不同比例組合對體外瘤胃發(fā)酵液黃色瘤胃球菌相對數(shù)量的變化趨勢圖

圖2 氨化秸稈與苜蓿不同比例組合對體外瘤胃發(fā)酵液白色瘤胃球菌相對數(shù)量的變化趨勢圖

圖3 氨化秸稈與苜蓿不同比例組合對體外瘤胃發(fā)酵液產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌相對數(shù)量的變化趨勢圖

圖4 氨化秸稈與苜蓿不同比例組合對體外瘤胃發(fā)酵液溶纖維丁酸弧菌相對數(shù)量的變化趨勢圖

圖5 氨化秸稈與苜蓿不同比例組合對體外瘤胃發(fā)酵液原蟲相對數(shù)量的變化趨勢圖

圖6 氨化秸稈與苜蓿不同比例組合對體外瘤胃發(fā)酵液真菌相對數(shù)量的變化趨勢圖

3 討論

3.1 氨化秸稈與苜蓿組合對營養(yǎng)成分的影響CP 含量是評價飼料營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)之一。在本試驗(yàn)中， 各組CP 含量隨著組合中添加氨化秸稈比例的增加呈逐漸降低的趨勢， 其中添加100%苜蓿干草的CP 含量最高而添加100%氨化玉米秸稈的CP 含量則最低，且兩者相差5.81%。而兩者DM 含量接近。這可能是由于苜蓿干草和玉米秸稈分別屬于豆科植物和禾本科植物，而豆科植物的CP 含量及可溶性糖一般要高于禾本科植物，而苜蓿干草為優(yōu)質(zhì)豆科牧草，營養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)于其他粗飼料， 并且其本身CP 含量相對較高（王芳等，2016）。 因此添加100%苜蓿干草的CP含量明顯高于其余各組。

陳曉琳 （2014） 研究認(rèn)為， 飼料中NDF 和ADF 含量與CP 含量呈負(fù)相關(guān)，即隨著飼料中CP含量的不斷增加，NDF 和ADF 含量會隨之不斷降低。在本試驗(yàn)中，NDF 和ADF 的含量隨著氨化秸稈添加比例的提高而不斷增加， 而CP 含量則隨著氨化秸稈添加比例的不斷提高而逐漸呈下降趨勢， 說明飼料中CP 含量與NDF、NDF 含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氨化玉米秸稈的NDF和ADF 含量最高， 分別為70.41%和54.43%，均明顯高于苜蓿干草。說明氨化玉米秸稈的纖維類物質(zhì)含量較高，在瘤胃中不易被瘤胃微生物消化分解， 而苜蓿干草的NDF 和ADF 含量最低，分別為45.56%和35.32%，說明容易在瘤胃中被微生物降解利用。 本試驗(yàn)中苜蓿干草的NDF 和ADF 含量與馬鍵等（2016）試驗(yàn)結(jié)果相似，但CP含量較低，這可能是由于飼料來源不同而導(dǎo)致結(jié)果的差異。因此，苜蓿干草其營養(yǎng)價值相對較高，優(yōu)于氨化玉米秸稈。

3.2 氨化秸稈與苜蓿組合對瘤胃微生物區(qū)系的影響 反芻動物體內(nèi)獨(dú)有的種類繁雜、數(shù)量龐大卻又相互競爭和協(xié)同的瘤胃微生物群落，其中細(xì)菌（數(shù)量為109～1010cfu/mL）、真菌（數(shù)量為103～105cfu/mL）和原蟲（數(shù)量為105～106cfu/mL）（Hungate 等，1969）參與飼料發(fā)酵降解，它們通過一系列的生物化學(xué)反應(yīng)將飼料的營養(yǎng)物質(zhì)消化轉(zhuǎn)化成VFA 和MCP， 為反芻動物提供物質(zhì)能源（Wallace 等，1997）， 維持瘤胃功能健康穩(wěn)定，保障反芻動物生產(chǎn)性能，科學(xué)合理地利用和開發(fā)飼料資源具有舉足輕重的意義。維持瘤胃微生物區(qū)系動態(tài)平衡是保證瘤胃健康發(fā)育和維系機(jī)體正常的重要前提。

瘤胃細(xì)菌是目前研究最多的一類， 它們主要降解纖維素、果膠、淀粉、蛋白質(zhì)和糖類等物質(zhì)，對宿主機(jī)體健康和生產(chǎn)性能起主導(dǎo)作用（Welkie等，2010）。其中主要附著在植物碎片上的纖維分解菌對降解飼料具有重要作用， 在高粗料日糧下，主要包括黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌。瘤胃菌群多樣性受日糧組成影響，不同品質(zhì)的日糧條件下其菌種數(shù)量也發(fā)生改變（Chaucheyras-Durand 等，2012）。在本試驗(yàn)中，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的相對數(shù)量顯著高于其他兩種纖維分解菌，并隨著發(fā)酵時間的延長和氨化秸稈的添加比例的提高，整體呈上升趨勢。其原因在于瘤胃內(nèi)產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌分布廣泛，是瘤胃纖維降解優(yōu)勢菌種之一，降解結(jié)構(gòu)堅韌物質(zhì)（如秸稈）的能力很強(qiáng)，特別是在以粗飼料為主的日糧條件下， 氨化秸稈的NDF 和ADF 含量高于苜蓿干草，促進(jìn)了產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的繁殖，使其優(yōu)勢高于其他分解菌種（Fernando 等，2010）。 由各菌群變化趨勢圖可以發(fā)現(xiàn)，黃色瘤胃球菌的數(shù)量隨發(fā)酵時間的延長而呈不斷下降的趨勢，在發(fā)酵48 h 后，白色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量明顯高于發(fā)酵初期，尤其是AM:ACS（20:80）組的黃色瘤胃球菌的相對數(shù)量（0.036%）顯著高于其余各組。以上結(jié)果表明在添加20%苜蓿干草和80%氨化秸稈進(jìn)行體外產(chǎn)氣發(fā)酵時，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和白色瘤胃球菌為優(yōu)勢菌群。 研究發(fā)現(xiàn)，白色瘤胃球菌的親和力高于黃色瘤胃球菌，對纖維的附著能力遠(yuǎn)勝于黃色瘤胃球菌，由于兩種菌在吸附過程中具有相同的屏障和附著點(diǎn)，白色瘤胃球菌能搶占黃色瘤胃球菌的附著點(diǎn)，存在競爭關(guān)系，而與產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的附著位點(diǎn)不一致， 幾乎不存在競爭關(guān)系（周瑞等，2016）。 此外，也有研究表明，在體外培養(yǎng)這三種瘤胃纖維分解菌優(yōu)勢菌時，發(fā)現(xiàn)在生長過程中白色瘤胃球菌會生成一種未知的抑制因子，對黃色瘤胃球菌生長有競爭排斥作用，從而抑制其數(shù)量的增長（Chen 等，2001）。 以上試驗(yàn)結(jié)果與孫攀峰（2007）在研究苜蓿與稻草不同比例組合時，主要纖維分解菌的變化趨勢一致。 溶纖維丁酸弧菌為蛋白降解菌，還可以有效利用木聚糖，分解果膠等。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，不同比例氨化秸稈代替苜蓿干草的組合對溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量無明顯影響，說明苜蓿干草與氨化秸稈組合后的CP 含量， 適宜溶纖維丁酸弧菌的生長繁殖，有利于維持其數(shù)量穩(wěn)定。

真菌和原蟲對瘤胃內(nèi)纖維素也有一定的降解作用。瘤胃真菌降解纖維素的能力和穿透能力強(qiáng)，可以穿透粗飼料的角質(zhì)層屏障，使植物纖維組織變得松軟從而易于被瘤胃微生物定植，加速纖維素物質(zhì)的降解，甚至是一些木質(zhì)素（祁茹等，2011）。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃真菌的相對數(shù)量顯著低于其他纖維降解菌，說明瘤胃細(xì)菌與真菌存在拮抗作用（Dehority 等，2000）。 也有研究表明，黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌對瘤胃真菌降解纖維物質(zhì)的能力具有抑制作用 （Roger 等，1992；Bernalier 等，1992）。 與試驗(yàn)發(fā)酵初期相比，發(fā)酵結(jié)束時瘤胃真菌的相對數(shù)量增加，導(dǎo)致其現(xiàn)象的原因可能是真菌在瘤胃微生物中的占比較低，對纖維降解的貢獻(xiàn)率要小于瘤胃細(xì)菌 （Akin 等，1962），同時其更偏向于利用粗日糧中的木質(zhì)素而非纖維素類的物質(zhì)（Tuyen 等，2012）。 原蟲是通過物理作用破壞植物組織， 并分泌一系列降解纖維素的酶類（纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶等），促進(jìn)植物細(xì)胞壁的消化利用。在本試驗(yàn)中，原蟲在微生物區(qū)系中的相對數(shù)量最高，發(fā)酵48 h 后，其相對數(shù)量明顯低于發(fā)酵初期， 這表明原蟲有選擇性的捕食吞噬瘤胃細(xì)菌。 本試驗(yàn)中黃色瘤胃球菌的相對數(shù)量變化趨勢與原蟲的相對數(shù)量變化趨勢一致， 可推測在苜蓿干草與氨化秸稈組合的日糧條件下，原蟲主要捕食黃色瘤胃球菌，使細(xì)菌與原蟲數(shù)量整體處于動態(tài)平衡（Williams 等，1992）。

4 結(jié)論

20%的苜蓿干草和80%的氨化秸稈組合可有效提高其營養(yǎng)成分的互補(bǔ),增強(qiáng)瘤胃內(nèi)主要纖維分解菌的活性，有助于真菌的定植，促進(jìn)瘤胃微生物的發(fā)酵。