盧宗梅 周勇 楊儒文 劉夢涵 彭超 朱威宇 何太波 佟毅

摘 ?????要：以黑曲霉Co827菌株為試驗菌株，在淀粉全清液培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以多尺度手段對培養(yǎng)基中的氮源、磷源對菌株產(chǎn)酸能力的影響進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明：黑曲霉Co827以淀粉糖液為碳源的全清液發(fā)酵培養(yǎng)基中，生長期（種子罐培養(yǎng)基）的碳氮比為30、氮磷比為3.2，產(chǎn)酸期（發(fā)酵罐培養(yǎng)基）的碳氮比為70，氮磷比為3.5。

關(guān) ?鍵 ?詞：全清液;發(fā)酵;碳氮比;氮磷比

中圖分類號：TQ 921.1 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）04-0830-04

Abstract： Aspergillus Niger Co827 was used as the experimental strain. On the basis of starch clear medium， the effect of nitrogen and phosphorus sources on the acidogenicity of this strain was studied by multi-scale method. The results showed that Aspergillus Niger Co827 was fermented in pure fermentation medium with starch sugar solution as carbon source. During the growth period （seed tank medium）， the ratio of carbon to nitrogen was 30， the ratio of nitrogen to phosphorus was 3.2; the ratio of carbon to nitrogen in the acid-producing period （fermentation tank medium） was 70， and the ratio of nitrogen to phosphorus was 3.5.

Key words： ?full clear liquid ; fermentation; carbon nitrogen ratio; N：P ratio

檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸，又名枸櫞酸，是動植物內(nèi)的一種天然成分和身體代謝的中間產(chǎn)物，也是食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的有機(jī)酸之一，廣泛應(yīng)用于工業(yè)、食品業(yè)和化妝業(yè)等領(lǐng)域。它是無色透明或半透明晶體，或粒狀、微粒狀粉末，無臭，有很強(qiáng)的酸味，但令人愉快，稍有澀味。易溶于水，在溫暖空氣中漸漸風(fēng)化，在潮濕空氣中微有潮解性。檸檬酸晶體有兩種，36 ℃以上結(jié)晶出來不含結(jié)晶水的為無水檸檬酸，36 ℃以下結(jié)晶出來帶有一個結(jié)晶水的為一水檸檬酸[1]。

目前，檸檬酸生產(chǎn)中基本采用的都是玉米粉液化液加過濾清液的粗獷發(fā)酵控制方式。由于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分由玉米粉液化液提供，其中成分復(fù)雜且波動大，生產(chǎn)不易控制。因此，為了實現(xiàn)發(fā)酵過程的精準(zhǔn)控制，通過開發(fā)全清液培養(yǎng)基并實現(xiàn)營養(yǎng)組學(xué)的精準(zhǔn)控制，氮源和磷源是其中最為重要的兩種營養(yǎng)。

氮源分為有機(jī)氮源和無機(jī)氮源，黑曲霉可以利用很多無機(jī)和有機(jī)氮源，尤其偏好于無機(jī)氮源[2]。并且在發(fā)酵檸檬酸中途添加NH+4鹽也有優(yōu)越性。國內(nèi)對玉米粉檸檬酸發(fā)酵研究已經(jīng)非常成熟。研究檸檬酸發(fā)酵氮源種類的有很多。以薯干粉為原料發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸和以玉米粉液化濾液為基料，添加玉米粉調(diào)整氮源發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸，培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量與產(chǎn)酸情況的研究[3]。添加適量的有機(jī)氮源對檸檬酸產(chǎn)量具有促進(jìn)作用[4]。玉米粉檸檬酸發(fā)酵中液化條件影響糖液中溶磷水平，對檸檬酸發(fā)酵高產(chǎn)酸非常重要[5]。然而，在全清液檸檬酸發(fā)酵的研究過程中，并沒有對氮磷的精準(zhǔn)控制進(jìn)行系統(tǒng)和深入的研究。

本文以淀粉全清液檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，對碳氮磷的關(guān)系進(jìn)行研究，從而達(dá)到檸檬酸發(fā)酵營養(yǎng)的精準(zhǔn)控制，提高發(fā)酵水平。

1 ?實驗部分

1.1 材料

1.1.1 ?材料

供試驗菌種：黑曲霉（Aspergillus niger）Co827，由中糧生物化學(xué)（安徽）股份有限公司提供。

淀粉：普通商品淀粉，由中糧生物能源（榆樹）有限公司提供。

玉米粉、a-耐高溫淀粉酶、糖化酶等均由中糧生物化學(xué)（安徽）股份有限公司提供。

1.1.2 ?設(shè)備與儀器

高百特全自動5 L發(fā)酵罐、金怡牌HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋、金怡牌JJ-1増力電動攪拌器;電子調(diào)溫電爐;美國Extrel公司MAX300-LG質(zhì)譜儀高精度尾氣在線快速分析系統(tǒng)、INNOVA搖床、1 000 mL燒杯、250 mL三角瓶。

1.1.3 ?培養(yǎng)基

商品淀粉加水調(diào)漿至20%濃度，調(diào)整pH至5.7，添加a-淀粉酶加熱至95 ℃保溫20 min開始碘試，當(dāng)?shù)庠嚦始t棕色即合格。

以玉米漿、硫酸銨、磷酸氫二鉀等為營養(yǎng)鹽調(diào)整培養(yǎng)基中的氮、磷。

1.2 ?方法

1.2.1 ?種子罐碳氮比、氮磷比正交搖瓶試驗

淀粉制備的糖液、玉米漿、硫酸銨、磷酸氫二鉀按照總糖（9%、10%、11%、12%）、碳氮比（20、25、30、35）、氮磷比（2.5、3.0、3.5、4.0）三因素四水平進(jìn)行正交搖瓶試驗，具體見表1。

搖瓶培養(yǎng)基按照表1的正交表配制好以后，每組3個平行搖瓶，250 mL三角瓶裝培養(yǎng)基50 g，用三層紗布一層牛皮紙封口包扎121 ℃滅菌25 min，降溫至常溫后，在無菌環(huán)境中接黑曲霉孢子1 500萬個/瓶，然后稱重W，放入搖床內(nèi)36 ℃、400 r/min條件下培養(yǎng)26 h取下。對每個搖瓶復(fù)重至W，然后做顯微鏡觀察并過濾檢測酸度和pH。

試驗證明，調(diào)整后使種子罐和發(fā)酵罐的培養(yǎng)基營養(yǎng)都得到了均衡，而且在一定范圍內(nèi)，只要達(dá)到營養(yǎng)的均衡，發(fā)酵周期和轉(zhuǎn)化率波動都不大。最高能夠做到56.2 h，產(chǎn)酸214.40 g/L水平，見表5。

3 ?結(jié)果與討論

3.1 ?碳氮磷比例對菌球形態(tài)的影響

對于黑曲霉檸檬酸發(fā)酵來說，菌球形態(tài)也是影響高產(chǎn)酸的重要因素。菌球松緊適度且小而規(guī)則，增大了菌球與介質(zhì)的接觸面積，而且有利于物質(zhì)傳輸，因此產(chǎn)酸濃度高、速率快。由于在培養(yǎng)基中，產(chǎn)物檸檬酸需要碳源來轉(zhuǎn)化，因此碳源是過量的，這樣，菌體的生長主要靠氮磷來調(diào)節(jié)。既要控制好菌體生物量，同時也要控制好碳源與生物量之間的比例。合適的碳氮磷比例，有利于菌球的均衡生長。

3.2 ?總糖對產(chǎn)酸速率和轉(zhuǎn)化率的影響

當(dāng)培養(yǎng)基中營養(yǎng)達(dá)到均衡時，總糖對轉(zhuǎn)化率和周期的影響不顯著。是在碳、氮、磷達(dá)到某種平衡的條件下，也就是說，培養(yǎng)基中一種營養(yǎng)變動而其他營養(yǎng)也需要隨之而調(diào)整，使各種營養(yǎng)達(dá)到一種平衡。如果在某一種培養(yǎng)基配方中單獨(dú)調(diào)整總糖濃度，則發(fā)酵產(chǎn)酸和周期等肯定會隨著而發(fā)生較大變化。當(dāng)培養(yǎng)基調(diào)整總糖時，氮、磷等營養(yǎng)需要隨之調(diào)整以保持一定平衡。

4 ?結(jié) 論

本文主要研究了發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳氮磷平衡問題，從而開發(fā)出全清液檸檬酸發(fā)酵工藝。為了達(dá)到高速產(chǎn)酸和高收率，培養(yǎng)基中的碳氮磷等需要保持動態(tài)的平衡。種子罐培養(yǎng)基總糖11%，碳氮比30，氮磷比3.2時，種子的質(zhì)量大幅度提升。發(fā)酵罐培養(yǎng)基在一定的范圍內(nèi)調(diào)整總糖時，保持碳氮比70，氮磷比3.5時，可以得到高效發(fā)酵水平。

參考文獻(xiàn)：

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[3]孫維國.部分有機(jī)氮源對檸檬酸發(fā)酵的影響[R].寧夏寧馨兒生物工程股份有限公司.

[4]張偉心，王建平，等.有機(jī)氮源對檸檬酸發(fā)酵的影響[J].河北大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2000（2）.

[5]代真真，周勇，劉玉偉，滿云，張繼學(xué)，王永紅，等，檸檬酸發(fā)酵過程中液化條件的影響[D].華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海.

[6] 張嗣良，儲炬.多尺度微生物過程優(yōu)化[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：230-289