亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        基因工程改造植物乳桿菌生產(chǎn)光學(xué)純D-乳酸

        2019-12-03 02:40:39張媛王小艷陳博李義佟毅
        當(dāng)代化工 2019年4期

        張媛 王小艷 陳博 李義 佟毅

        摘 ?????要: 為獲得高產(chǎn)高光學(xué)純D-乳酸生產(chǎn)菌,本研究從篩選得到的一株耐高溫耐高糖的植物乳桿菌出發(fā),利用基因工程技術(shù),敲除其中與L-乳酸合成相關(guān)的基因,引入或增強(qiáng)D-乳酸脫氫酶活性,構(gòu)建了一株基因工程菌Lp-DA。該菌株可45℃發(fā)酵,產(chǎn)乳酸近200 g/L,D-乳酸光學(xué)純度達(dá)到99.9%,為光學(xué)純D-乳酸工業(yè)生產(chǎn)提供了新的菌株選擇。

        關(guān) ?鍵 ?詞:D-乳酸;植物乳桿菌;光學(xué)純;基因敲除;基因敲入

        中圖分類號(hào):TQ 78 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A ??????文章編號(hào): 1671-0460(2019)04-0674-06

        Abstract: ?In order to obtain high-yield and high-optical pure D-lactic acid producing strain, a strain of Lactobacillus plantarum with high temperature and sugar tolerance was screened out. Starting from this strain, a genetically engineered strain Lp-DA was constructed by knocking out the genes related to L-lactic acid synthesis and introducing or enhancing the activity of D-lactic acid dehydrogenase. This strain can be fermented at 45 ℃ to produce nearly 200 g/L of lactic acid, and the optical purity of D-lactic acid can reach 99.9%. It provides a new strain option for industrial production of optical pure D-lactic acid

        Key words: ?D-lactic acid; Lactobacillus plantarum; optical pure; gene knockout; gene knockin

        聚乳酸(Poly-lactic acid,PLA)是一種以乳酸為主要原料聚合得到的聚合物,利用生物質(zhì)資源作為原料,來源豐富而且可再生。聚乳酸的生產(chǎn)過程無污染,其產(chǎn)品可以生物降解,實(shí)現(xiàn)在自然界中的循環(huán),與有限的石油和化石資源相比,生物質(zhì)資源的優(yōu)勢在于不會(huì)有釋放到大氣中的凈二氧化碳[1],因此是理想的綠色高分子材料,具有廣闊的市場前景。近年來聚乳酸技術(shù)的突破提高了其力學(xué)、耐熱、耐久性能及生物相容性,促進(jìn)了聚乳酸在高性能、高附加值材料領(lǐng)域的應(yīng)用拓展[2]。國內(nèi)外許多研究表明聚L-乳酸和聚D-乳酸的共聚可提高其機(jī)械性能、熱穩(wěn)定性等,實(shí)現(xiàn)聚乳酸材料的改性[3,4],拓寬了聚乳酸的應(yīng)用范圍。

        乳酸(Lactic acid)又叫α-羥基丙酸、丙醇酸,根據(jù)其結(jié)構(gòu)中的手性碳原子劃分為L-乳酸和D-乳酸。聚乳酸的合成需使用高光學(xué)純度的乳酸單體作為前體。高光學(xué)純度的D-乳酸,因其可被用來提高聚乳酸材料的性能而備受關(guān)注。利用發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸具有生產(chǎn)成本低、產(chǎn)物光學(xué)純度和安全性高、生產(chǎn)條件溫和、污染小等優(yōu)點(diǎn)。然而,大多數(shù)乳酸菌只能同時(shí)生產(chǎn)L-乳酸和D-乳酸,只有極少數(shù)的天然乳酸菌和一些模式工程菌可用于專門生產(chǎn)D-乳酸,這些菌株D-乳酸產(chǎn)量和光學(xué)純度仍需要進(jìn)行大幅度的提升,因此,在通過微生物發(fā)酵法大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)D-乳酸時(shí),目前可選擇的菌株仍然十分有限。由此,高產(chǎn)高光學(xué)純度D-乳酸的發(fā)酵菌株成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

        本研究從大曲樣品中篩選獲得耐高溫高糖的乳酸菌,并利用基因工程技術(shù),敲除其中與L-乳酸合成相關(guān)的基因,并引入或增強(qiáng)D-乳酸脫氫酶的活性,構(gòu)建一株高產(chǎn)高光學(xué)純度的D-乳酸工程菌,達(dá)到提高D-乳酸產(chǎn)量和光學(xué)純度的目的。為光學(xué)純D-乳酸工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵菌株提供了新的選擇。

        1 ?實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 ?實(shí)驗(yàn)材料

        1.1.1 ?菌株及培養(yǎng)條件

        大腸桿菌DH5α菌株為購于全式金公司的Trans5α感受態(tài),培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng),篩選用抗生素濃度為25 μg/mL 氯霉素或250 μg/mL紅霉素。

        植物乳桿菌Lp43#篩選自大曲樣品,培養(yǎng)使用MRS培養(yǎng)基。37~45 ℃培養(yǎng),篩選用抗生素濃度為10 μg/mL 氯霉素或10 μg/mL紅霉素。

        1.1.2 ?酶和試劑

        EasyTaq Mix,DNA Assembly Mix,DNA marker,凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購于全式金公司;PrimeStar DNA聚合酶購于TaKaRa公司;基因組提取試劑盒購于TIANGEN公司;限制性內(nèi)切么、DNA連接酶購于NEB公司;紅霉素、氯霉素等購于Solarbio公司。

        1.1.3 ?培養(yǎng)基

        LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L,pH 7.0。

        MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、檸檬酸二銨2.0 g/L、無水乙酸鈉5.0 g/L、硫酸錳0.25 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、吐溫80 1.0 mL/L,pH 6.5;MRS固體培養(yǎng)基:在上述MRS液體培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g/L;MRS-CaCO3平板:MRS固體培養(yǎng)基中再加入CaCO3 10 g/L;發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖180~200 g/L、酵母提取物10 g/L、乙酸鈉2 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、MnSO4·H2O 0.25 g/L、吐溫80 1 ml/L、CaCO3 90~100 g/L,pH 6.5。

        1.2 ?實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 ?菌株的分離篩選

        將1 g大曲樣品搗碎后用10 mL無菌生理鹽水溶解,充分混勻30 min;取上述稀釋液10倍梯度稀釋后涂布于MRS-CaCO3平板,37 ℃培養(yǎng)24 h,挑取透明圈較大的菌落接種MRS培養(yǎng)基,37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)1 h,取5 μL培養(yǎng)液點(diǎn)在MRS-CaCO3平板上,將平板放置于45 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 h;挑選平板中菌落生長較快并且溶鈣圈較大的幾個(gè)單菌落再次轉(zhuǎn)接MRS培養(yǎng)基,37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)1 h,取5 μL培養(yǎng)液點(diǎn)在MRS-CaCO3固體平板上,將平板放置于48 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑選其中溶鈣圈比較明顯的備選菌株保存并進(jìn)行發(fā)酵搖瓶實(shí)驗(yàn)。

        將備選菌株接種MRS培養(yǎng)基,37 ℃ 150 r/min過夜培養(yǎng)獲得種子液,在30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中按照10%(v/v)的比例接種上述種子液,37 ℃ 150 r/min搖床培養(yǎng)3~5 h讓菌株生長,然后升溫到45 ℃或48℃,繼續(xù)以150 r/min搖床培養(yǎng)72 h獲得發(fā)酵液。發(fā)酵結(jié)束后通過高效液相色譜檢測發(fā)酵產(chǎn)物中的乳酸,篩選出高溫高糖條件下產(chǎn)乳酸較快、乳酸產(chǎn)量較高的菌株。

        1.2.2 ?菌株鑒定

        篩選獲得的菌株通過顯微鏡檢測菌株形態(tài),并結(jié)合16S rDNA 測序方法,鑒定菌株分類。

        1.2.3 ?重組質(zhì)粒構(gòu)建

        基因敲除質(zhì)粒構(gòu)建:使用對應(yīng)引物(表1)分別擴(kuò)增大腸桿菌復(fù)制子p15Aori(來自商業(yè)載體pACYC)、紅霉素抗性基因EmR(來自商業(yè)載體pMG36e)、待敲除基因CDS上游1 000 bp序列(擴(kuò)增自Lp43#基因組)、氯霉素啟動(dòng)子P32、氯霉素抗性基因CmR(來自商業(yè)載體pNZ8148)和待敲除基因CDS下游 1000 bp序列(擴(kuò)增自Lp43#基因組),使用DNA Assembly重組試劑盒組裝成為基因敲除質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入Trans5α感受態(tài),氯霉素和紅霉素抗性,經(jīng)測序鑒定,獲得pKO-GeneX系列質(zhì)粒,GeneX為ldhL1、ldhL2或larA(圖1)。

        基因插入質(zhì)粒構(gòu)建:分別合成待插入基因植物乳桿菌的ldhD(Gene ID:1061762)和德氏乳桿菌ldhA(Gene ID:4085369)基因的CDS序列,并在起始密碼子之前和終止密碼子之后分別加入XhoI和BamHI酶切位點(diǎn),雙酶切獲得待插入基因的片段;將前面構(gòu)建的pKO質(zhì)粒同樣用XhoI和BamHI雙酶切獲得去除了氯霉素抗性基因的載體片段,將經(jīng)過同樣雙酶切并純化后的載體和基因片段用DNA連接酶連接后,轉(zhuǎn)入Trans5α感受態(tài),紅霉素抗性,經(jīng)測序鑒定,獲得基因插入質(zhì)粒,命名為pKI-X:GeneY,GeneY為ldhD或ldhA(圖2)。

        1.2.4 ?植物乳桿菌電轉(zhuǎn)化

        接種平板活化的植物乳桿菌單菌落于4 mL MRS培養(yǎng)基中37 ℃ 150 r/min過夜培養(yǎng),按初始OD600= 0.2轉(zhuǎn)接至100 mL含1%甘氨酸的MRS培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)至OD600= 0.6;菌液冰浴20 min,4 ℃、8 000×g離心15 min收集菌體;用100 mL 4℃預(yù)冷的1 mM MgCl2和30% PEG1000依次沖洗菌體1次;用1 mL 4 ℃預(yù)冷的30% PEG1000重懸菌體,每份分裝100 μL感受態(tài)。

        每份感受態(tài)細(xì)胞加入5 μg重組質(zhì)粒,冰浴10 min,使用0.2 cm電轉(zhuǎn)杯,1.5 kV、25 F、200 Ω電擊,迅速加入0.8 mL MRS-SM培養(yǎng)基(在MRS培養(yǎng)基中加入0.5 M蔗糖和0.1 M MgCl2),37 ℃培養(yǎng)2 h,離心1 min,去掉部分上清后重懸涂布于含抗生素的MRS平板上,37 ℃培養(yǎng)2 d獲得單菌落。

        1.2.5 ?基因敲除菌株篩選

        植物乳桿菌中電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入基因敲除質(zhì)粒,氯霉素抗性篩選,并使用對應(yīng)鑒定引物菌落PCR,獲得有2條條帶的發(fā)生了第一次交換的陽性轉(zhuǎn)化子,挑選1~2個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子用含氯霉素的MRS液體培養(yǎng)基傳代培養(yǎng),每2代劃線并菌落PCR篩選僅剩較小一條條帶,即為第二次交換成功的菌株,經(jīng)測序確認(rèn)目標(biāo)基因已敲除,即獲得目標(biāo)基因敲除的植物乳桿菌菌株。

        1.2.6 ?基因插入菌株篩選

        在植物乳桿菌敲除菌株中轉(zhuǎn)入對應(yīng)的基因插入質(zhì)粒,紅霉素抗性篩選,并使用對應(yīng)鑒定引物菌落PCR,獲得有2條條帶的發(fā)生了第一次交換的陽性轉(zhuǎn)化子,挑選1~2個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子用無抗MRS液體培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)用于篩選第二次交換的菌株,成功發(fā)生基因插入的菌株菌落PCR結(jié)果應(yīng)僅剩一條偏大條帶,經(jīng)測序確認(rèn)目標(biāo)基因已插入到基因組中對應(yīng)位置,即獲得目標(biāo)基因敲入的植物乳桿菌菌株。

        1.2.7 ?發(fā)酵方法

        將菌株接種20 mL MRS培養(yǎng)基,37 ℃ 150 r/min過夜培養(yǎng)獲得種子液。然后,在100 mL產(chǎn)酸發(fā)酵培養(yǎng)基中按照10%(v/v)的比例接種上述種子液,37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)6 h讓菌株生長,然后維持37 ℃或升溫至45 ℃,繼續(xù)以150 r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)66 h獲得發(fā)酵液,發(fā)酵過程中定期取樣檢測發(fā)酵產(chǎn)物。

        1.2.8 ?產(chǎn)物分析

        乳酸、葡萄糖等濃度檢測方法:色譜儀為Agilent Technologies 1260 Infinity II;檢出器RID;分離柱為Aminex HPX-87H Column 300 mm×7.8 mm;流動(dòng)相0.005 M硫酸;流量0.5 mL/min;進(jìn)樣量20 μL。

        乳酸的光學(xué)純度檢測方法:色譜儀為Agilent Technologies 1260 Infinity;檢出器波長254 nm,靈敏度0.32AUFS;分離柱為MCI GEL-CRS10 W(3u)4.6 ID×50 mm;流動(dòng)相0.002 M硫酸銅;流量0.5 mL/min;進(jìn)樣量20 μL。根據(jù)峰面積計(jì)算L-乳酸和D-乳酸的比例。

        增強(qiáng)乳酸發(fā)酵菌株對環(huán)境脅迫的抵抗力是提高乳酸發(fā)酵能力的方向之一,本研究通過篩選,獲得了耐高溫、高糖的乳酸發(fā)酵菌株。利用耐高溫菌株進(jìn)行發(fā)酵可以縮短生產(chǎn)周期、減少溫控所需的能耗以及減少雜菌污染的風(fēng)險(xiǎn);而耐高糖的性能有助于簡化發(fā)酵工藝,提高乳酸總產(chǎn)量。

        采用基因工程手段對乳酸高產(chǎn)菌株進(jìn)行改造,能進(jìn)一步提高其產(chǎn)酸效率和乳酸的光學(xué)純度。本研究使用同源重組的基因工程手段,敲除了植物乳桿菌中可能與L-乳酸合成相關(guān)的基因,并在同一位點(diǎn)替換了外源或內(nèi)源的D-乳酸脫氫酶基因,進(jìn)一步提高其活性。發(fā)酵結(jié)果分析認(rèn)為,敲除菌株ldhL1、ldhL2、larA基因后,阻斷了代謝途徑中可能的L-乳酸代謝,同時(shí),菌株的乳酸積累不受這幾個(gè)基因缺失的影響,表明該植物乳桿菌的乳酸代謝過程中,乳酸脫氫酶的種類不是乳酸產(chǎn)量的限制因素。并且增加的D-乳酸脫氫酶活性更有助于提高D-乳酸的合成能力。改造后菌株與野生菌株相比,在乳酸產(chǎn)量和乳酸光學(xué)純度方面均有大幅提升。

        同源重組方法是基因組改造的常用手段,產(chǎn)生的變化僅存在于基因組中,因此構(gòu)建的突變體具有較高的遺傳穩(wěn)定性。并且最終的菌株沒有選擇標(biāo)記和質(zhì)粒殘留,可避免常規(guī)基因工程菌培養(yǎng)體系復(fù)雜等問題,安全性較高,也便于對菌株進(jìn)行進(jìn)一步的代謝途徑改造。

        最終獲得的菌株Lp-DA可在45 ℃條件下發(fā)酵大量生產(chǎn)乳酸,并且僅合成D-乳酸,該重組D-乳酸生產(chǎn)植物乳桿菌提供了滿足光學(xué)純D-乳酸工業(yè)生產(chǎn)的新選擇。當(dāng)然,新菌株的工業(yè)應(yīng)用還需要與菌株特性相適應(yīng)的高效發(fā)酵工藝和低能耗的提取精制工藝,才能讓D-乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)更具競爭力。

        參考文獻(xiàn):

        [1] Hofvendahl, K, Hahn-Hagerdal B. Factors affecting the fermentative lactic acid production from renewable resources[J]. Enzyme Microb.Technol, 2000, 26:87–107.

        [2] Lasprilla AJ, Martinez GA, et al. Poly-lactic acid synthesis for application in biomedical devices-A review[J]. Biotechnology Adv., 2012, 30(1):321–328.

        [3] Ouchi T, Ichimura S, Ohya Y. Synthesis of branched poly(lactide) using polyglycidol and thermal, mechanical properties of its solution-cast film[J]. Polymer,2006, 47(1):429–434.

        [4] Tsuji H. Poly(lactide) stereocomplexes: formation, structure, properties, degradation, and applications[J]. Macromolecular Bioscience, 2005, 5(7): 569–597.

        [5] Zheng Z, Sheng B, et al. Relative catalytic efficiency of ldhL- and ldhD–encoded products is crucial for optical purity of lactic acid produced by Lactobacillus strains[J]. Appl Environ Microbiol, 2012, 78:3480-3.

        [6] Siezen RJ, Francke C, et al. Complete resequencing and reannotation of the Lactobacillus plantarum WCFS1 genome[J]. J Bacteriol, 2012, 194:196-6.

        [7] Okano K, Zhang Q, et al. Efficient production of optically pure D-lactic acid from raw corn starch by using a genetically modified L-lactate dehydrogenase gene-deficient and alpha-amylase-secreting Lactobacillus plantarum strain[J]. Appl Environ Microbiol, 2009, 75:462-7.

        [8] Desguin B, Goffin P, et al. Lactate racemase is a nickel-dependent enzyme activated by a widespread maturation system[J]. Nat Commun,2014, 5:3615.

        [9] Razeto A, Kochhar S, et al. Domain closure, substrate specificity and catalysis of D-lactate dehydrogenase from Lactobacillus bulgaricus[J]. J Mol Biol,2002, 318

        亚洲综合在线一区二区三区| 国产第一页屁屁影院| 日本亚洲欧美高清专区| 放荡人妻一区二区三区| 国产av剧情久久精品久久| 日日摸天天碰中文字幕你懂的| 婷婷午夜天| 成在线人视频免费视频| 成人影院羞羞的视频免费观看| 久久亚洲av成人无码电影 | 国产av在线观看91| 国产精品一区二区久久国产| 午夜内射中出视频| 亚洲成av人片天堂网九九| 亚洲av一区二区网址| 亚洲乱码中文在线观看| 国产影片中文字幕| 亚洲日韩区在线电影| 亚洲av色香蕉一区二区三区av| 成 人色 网 站 欧美大片在线观看 | 久久精品女同亚洲女同| 亚洲一区二区三区四区五区六| 999久久久精品国产消防器材| 爱情岛论坛亚洲品质自拍hd| 青草青草伊人精品视频| 亚洲精品不卡av在线免费| 欧美乱大交xxxxx潮喷| 蜜桃精品免费久久久久影院| 亚洲人成绝费网站色www| 在线日本国产成人免费精品| 亚洲精品无码高潮喷水a片软| 亚洲精品免费专区| 在线亚洲免费精品视频| 完整版免费av片| 美丽的熟妇中文字幕| 国产精品va在线观看一| 国产黑丝美女办公室激情啪啪| 亚洲精品无码久久久久av老牛| 欧美日韩国产综合aⅴ| 日本视频一区二区这里只有精品| 欧美伦费免费全部午夜最新|