唐 川，楊 銘，盧 軒

（大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

食品包裝具有防止食品受到氧化、微生物或其他因素影響的作用，可以保障食品品質(zhì)，延長(zhǎng)貨架期[1]。目前市面上的食品包裝大部分采用聚苯乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯等高分子材料制成，在自然環(huán)境中難以降解，易造成環(huán)境污染；并且這些材料與食品直接接觸可能會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)，對(duì)食品造成污染[2]。隨著人們對(duì)食品質(zhì)量及食品安全要求的不斷提高，傳統(tǒng)食品包裝已不能滿足人們的需求。近年來(lái)，食品活性包裝作為一種新型包裝引起人們的廣泛關(guān)注[3]。食品活性包裝可通過(guò)負(fù)載去氧劑、抑菌劑、干燥劑等活性物質(zhì)改變包裝食品的環(huán)境條件、改進(jìn)食品安全性和感官品質(zhì)，具有良好的應(yīng)用前景[4]。

殼聚糖是幾丁質(zhì)經(jīng)脫乙酰得到的產(chǎn)物，在自然界中儲(chǔ)量巨大，殼聚糖無(wú)毒、可食用、成膜性好，具有良好的生物相容性和生物可降解性，在生物醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[5-6]，將殼聚糖制備成膜、微粒、復(fù)合膜等形式用于食品包裝的研究已有很多報(bào)道[7-9]。為了更好地發(fā)揮食品包裝抗氧化、抑菌、干燥等功能，通常采用在食品包裝中加入相應(yīng)活性物質(zhì)來(lái)達(dá)到特定的功能[10-11]。丁香酚（eugenol，EG）是丁香揮發(fā)油中的主要成分，具有較強(qiáng)的抑制細(xì)菌、真菌作用，是良好的天然抑菌劑[12]。將丁香酚負(fù)載于膜材料中是制備抑菌包裝的一種有效策略[13-14]。目前，將活性物質(zhì)負(fù)載于包裝材料中的方法主要是在包裝材料加工階段將活性物質(zhì)直接混入或?qū)b材料浸沒(méi)于活性物質(zhì)溶液中。這些方法在處理過(guò)程中會(huì)使用大量有機(jī)溶劑或需要在較高溫度下操作，易導(dǎo)致活性物質(zhì)失活、分布不均勻和產(chǎn)品有機(jī)溶劑殘留等問(wèn)題，因此尋找一種安全有效的方法將活性物質(zhì)負(fù)載到包裝材料中制備食品活性包裝變得十分迫切。

超臨界溶液浸漬（supercritical solution impregnation，SSI）法是一種將小分子物質(zhì)負(fù)載到聚合物中的技術(shù)[15]。SSI過(guò)程中，活性物質(zhì)溶解于超臨界二氧化碳（supercritical-CO2，SC-CO2）中，隨SC-CO2擴(kuò)散進(jìn)入基質(zhì)材料并與基質(zhì)材料充分接觸，隨后活性物質(zhì)與基質(zhì)材料發(fā)生相互作用吸附于基質(zhì)材料中，泄壓后，活性物質(zhì)均勻負(fù)載于基質(zhì)材料中，形成具有相應(yīng)活性的基質(zhì)材料[16]。SSI不改變基質(zhì)材料結(jié)構(gòu)，活性物質(zhì)在基質(zhì)中分布均勻，負(fù)載量可通過(guò)改變SSI過(guò)程參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)，并且操作條件溫和、不使用有機(jī)溶劑、對(duì)環(huán)境友好，在食品加工過(guò)程中具有極大潛力。但目前SSI的研究主要集中在印染及醫(yī)藥領(lǐng)域[17-18]，在食品工業(yè)中的研究尚處于起步階段[19]。

本實(shí)驗(yàn)擬采用殼聚糖膜（chitosan film，CSF）為基質(zhì)，利用SSI將丁香酚負(fù)載于殼聚糖膜中用于食品活性包裝。研究SSI過(guò)程參數(shù)對(duì)丁香酚負(fù)載量的影響，考察負(fù)載丁香酚殼聚糖膜（EG-CSF）形貌、水蒸氣透過(guò)率、吸水率及抑菌等性質(zhì)，以期為SSI制備食品活性包裝的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖（脫乙酰度85.0%、黏度154 mPa·s） 濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司；丁香酚（純度＞99.0%）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；CO2（食品級(jí)，純度＞99.9%）大連永豐氣體有限公司；冰醋酸、甘油（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphlycoccus aureus）、綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院。

1.2 儀器與設(shè)備

SFE-500MR-2-FMC10 SSI裝置 美國(guó)Waters公司；S-4800掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立公司；Magna-550II紅外光譜儀美國(guó)尼高力公司；DNP-9162恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DZF-6021真空干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 殼聚糖膜的制備

殼聚糖膜采用溶液澆注法制備，將殼聚糖溶解于體積分?jǐn)?shù)為1%的冰醋酸水溶液中，配制成0.02 g/L的殼聚糖溶液，并向殼聚糖溶液中加入甘油作為塑化劑，加入量為殼聚糖溶液體積的1%，取5 mL殼聚糖溶液倒入截面積為100 mm×100 mm的聚四氟乙烯皿中，40 ℃真空干燥12 h，脫模后得到殼聚糖膜。得到的殼聚糖膜密封保存于25 ℃、（55±3）%相對(duì)濕度的干燥皿中備用。

1.3.2 負(fù)載丁香酚殼聚糖膜的制備

EG-CSF采用SSI進(jìn)行制備，SSI設(shè)備如圖1所示。該系統(tǒng)主要由一個(gè)帶加熱夾套及攪拌器的100 mL高壓釜、一個(gè)高壓泵以及泄壓閥組成，高壓釜的溫度、壓力及泄壓過(guò)程由計(jì)算機(jī)控制，壓力精度±0.1 MPa，溫度精度±1 ℃，泄壓速率精度±0.1 MPa/min。實(shí)驗(yàn)流程參照本課題組之前的研究[20]：將丁香酚置于高壓釜中，丁香酚可使高壓釜內(nèi)SC-CO2達(dá)到飽和，殼聚糖膜包裹于濾紙中置于高壓釜攪拌槳上部，不與丁香酚相接觸；CO2經(jīng)冷卻槽冷卻至0 ℃，通過(guò)高壓泵送入高壓釜中，待高壓釜中溫度、壓力達(dá)到設(shè)定值后，浸漬2 h；達(dá)到浸漬時(shí)間后，關(guān)閉高壓泵，打開(kāi)泄壓閥，以一定速率進(jìn)行泄壓；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取出樣品置于密封袋中，保存于干燥皿中，等待進(jìn)一步的表征。

圖 1 SSI過(guò)程示意圖Fig. 1 Schematic diagram of SSI process

1.3.3 EG-CSF形貌的觀察

EG-CSF的形貌采用SEM進(jìn)行觀察。將EG-CSF通過(guò)碳膠帶固定于樣品臺(tái)上，噴金處理60 s后，利用SEM觀察其形貌。

EG-CSF的厚度采用螺旋測(cè)微儀進(jìn)行測(cè)定。在EG-CSF樣品上隨機(jī)選取5 個(gè)點(diǎn)進(jìn)行厚度測(cè)量，計(jì)算平均值作為膜厚，用于后續(xù)EG-CSF水蒸氣透過(guò)率的計(jì)算。

1.3.4 EG-CSF負(fù)載量的測(cè)定

EG-CSF中丁香酚負(fù)載量通過(guò)質(zhì)量法進(jìn)行測(cè)定，SSI前采用分析天平對(duì)殼聚糖膜質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，記為m0/g；SSI完成后，待EG-CSF質(zhì)量恒定時(shí)，對(duì)EG-CSF質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，記為m1/g，EG-CSF中丁香酚負(fù)載量可通過(guò)公式（1）進(jìn)行計(jì)算。

1.3.5 EG-CSF吸水量的測(cè)定

EG-CSF樣品測(cè)量質(zhì)量，記為m0/g，隨后浸沒(méi)于去離子水中，待樣品完全溶脹后取出，使用濾紙拭去樣品表面水滴后稱質(zhì)量，記為m1/g，每個(gè)樣品測(cè)定3 次，根據(jù)公式（2）計(jì)算EG-CSF吸水量。

1.3.6 EG-CSF水蒸氣透過(guò)率的測(cè)定

EG-CSF水蒸氣透過(guò)率按照美國(guó)材料與試驗(yàn)協(xié)會(huì)E96-16[21]方法測(cè)定。選用直徑40 mm的透濕杯，內(nèi)裝3 g無(wú)水氯化鈣，用EG-CSF將透濕杯口覆蓋并密封固定，稱質(zhì)量后置于干燥器中。干燥器中盛有飽和氯化鈉溶液保持相對(duì)濕度75%，并置于30 ℃培養(yǎng)箱中。每12 h稱量一次，累積測(cè)定1 周，記錄透濕杯質(zhì)量的增加量，每個(gè)樣品測(cè)定3 次，根據(jù)公式（3）計(jì)算水蒸氣透過(guò)率。

式中：△m/△t為單位時(shí)間內(nèi)增加的水的質(zhì)量/（g/s）；l為EG-CSF厚度/m；A為有效的擴(kuò)散面積/m2；△P為EG-CSF兩側(cè)的水蒸氣滲透壓差/Pa。

1.3.7 EG-CSF傅里葉變換紅外光譜的表征

采用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法（attenuated total reflection fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR）對(duì)殼聚糖膜浸漬前后進(jìn)行掃描，樣品測(cè)試前進(jìn)行空白校正，扣除背景吸收，掃描波數(shù)400～4 000 cm－1，分辨率4 cm－1，掃描32 次。

1.3.8 EG-CSF抑菌性的測(cè)定

EG-CSF抑菌性能通過(guò)紙片法進(jìn)行測(cè)定，考察EG-CSF對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌生長(zhǎng)抑制情況。將3 種細(xì)菌分別在LB培養(yǎng)基中37 ℃下培養(yǎng)8 h進(jìn)行活化，活化后在胰蛋白酶大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）板上培養(yǎng)得到單菌落。挑取單菌落接種于5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)8 h。將菌液稀釋10 倍體積，取200 μL涂布于TSA平板，然后將直徑為10 mm的EG-CSF置于平板上，于37 ℃下培養(yǎng)24 h，測(cè)量EG-CSF抑菌圈直徑，每個(gè)樣品測(cè)定3 次。同時(shí)取空白CSF作為陰性對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 7.5軟件作圖。采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s多重比較檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析（以P＜0.05表示差異顯著）。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 EG-CSF形貌

采用SEM對(duì)SSI前后殼聚糖膜形貌進(jìn)行了表征。圖2a為溶液澆注法制備得到殼聚糖膜，圖2b為殼聚糖膜由SSI在20 MPa、1 MPa/min操作條件下制備得到的EG-CSF樣品。由結(jié)果可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)SSI負(fù)載丁香酚后，殼聚糖膜表面沒(méi)有明顯形貌變化，說(shuō)明SSI對(duì)殼聚糖膜的形貌無(wú)影響。此外，SSI后，EG-CSF表面無(wú)明顯丁香酚顆?；蛞旱胃街Y(jié)合操作過(guò)程中殼聚糖膜采用濾紙包裹不與丁香酚直接接觸，與EG-CSF負(fù)載量結(jié)果可知，SSI過(guò)程中丁香酚的負(fù)載并不是簡(jiǎn)單地由泄壓時(shí)丁香酚在殼聚糖膜表面析出完成，而是由SC-CO2將丁香酚溶解后，以分子狀態(tài)擴(kuò)散進(jìn)入殼聚糖膜中，泄壓后以分子狀態(tài)分散于殼聚糖膜中，這一結(jié)果也與之前的研究結(jié)果[22]相符。

圖 2 CSF及EG-CSF掃描電子顯微鏡圖Fig. 2 SEM images of CSF and EG-CSF

2.2 EG-CSF負(fù)載量

SSI可通過(guò)調(diào)節(jié)過(guò)程參數(shù)調(diào)控活性物質(zhì)在基質(zhì)中的負(fù)載量。根據(jù)之前的研究[16]，SSI達(dá)到浸漬平衡后，浸漬時(shí)間對(duì)過(guò)程影響較小，2 h可以保證SSI達(dá)到浸漬平衡。因此，本研究考察了浸漬溫度40 ℃、浸漬時(shí)間2 h條件下，浸漬壓力（10、15、20 MPa）及泄壓速率（1、5 MPa/min）對(duì)丁香酚在殼聚糖膜中負(fù)載量的影響。各條件下EG-CSF中丁香酚的負(fù)載量結(jié)果如表1所示，EG-CSF中丁香酚在浸漬壓力20 MPa、泄壓速率1 MPa/min時(shí)負(fù)載量最大，為6.02%；浸漬壓力10 MPa、泄壓速率5 MPa/min時(shí)負(fù)載量最小，為4.59%。在同一壓力下，泄壓速率為1 MPa/min時(shí)，EG-CSF負(fù)載量大于泄壓速率為5 MPa/min時(shí)的EG-CSF負(fù)載量，這是由于在較高的泄壓速率下，溶解有丁香酚的SC-CO2會(huì)以更快的速度離開(kāi)基質(zhì)材料，最終導(dǎo)致負(fù)載量降低[23]。這種泄壓速度對(duì)EG-CSF負(fù)載量的影響在較高壓力時(shí)更加明顯，因?yàn)樵谳^高壓力時(shí)，基質(zhì)材料的溶脹程度更大[24]，更加利于溶有丁香酚的SC-CO2向基質(zhì)外的擴(kuò)散，并且更高的壓力下，丁香酚在SC-CO2中的溶解度也更大[25]。在這些原因的共同作用下，較高的泄壓速度會(huì)導(dǎo)致EG-CSF的負(fù)載量降低，并且在較高的壓力下，這種現(xiàn)象更加明顯。從結(jié)果中還可以看出，在泄壓速度較低時(shí)，隨著壓力的增加，EG-CSF的負(fù)載量有增大趨勢(shì)，但在泄壓速度較大時(shí)，壓力對(duì)EG-CSF負(fù)載量的影響并不明顯。

表 1 40 ℃、SSI浸漬2 h后，EG-CSF負(fù)載量、厚度、吸水率、水蒸氣透過(guò)率Table 1 LC, thickness, WU and WVP of EG-CSF prepared by SSI

2.3 EG-CSF吸水率及水蒸氣透過(guò)率

水分在食物的保存過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用，因此本研究對(duì)EG-CSF的吸水率及水蒸氣透過(guò)率性能進(jìn)行了考察，結(jié)果如表1所示。負(fù)載丁香酚后的EG-CSF與空白CSF相比，吸水率大幅下降，這是由于SSI后，疏水性物質(zhì)丁香酚嵌入至親水性的CSF中，與殼聚糖中的羥基及氨基產(chǎn)生氫鍵或共價(jià)鍵，減弱了殼聚糖與水分子之間的相互作用，使得CSF的親水性下降，最終導(dǎo)致EG-CSF的吸水率降低[26]。

CSF的水蒸氣透過(guò)率經(jīng)過(guò)SSI負(fù)載丁香酚后同樣出現(xiàn)降低的現(xiàn)象。這可能是由于丁香酚在EG-CSF表面及內(nèi)部均勻的負(fù)載，形成了水蒸氣屏障，阻礙了水蒸氣的滲透擴(kuò)散；另一方面，殼聚糖在SSI過(guò)程中可能發(fā)生了殼聚糖分子鏈的重排，改變了其水蒸氣滲透性能[27]。在這兩方面的作用下，使得EG-CSF的水蒸氣透過(guò)率下降。這對(duì)于EG-CSF在食品包裝中的應(yīng)用是十分有利的，食品包裝要求膜材料具有較低的水蒸氣透過(guò)率，可以減少食物與環(huán)境之間水分轉(zhuǎn)移[28]。

2.4 EG-CSF FTIR分析結(jié)果

丁香酚原料、殼聚糖膜以及SSI后殼聚糖膜和EG-CSF的FTIR分析結(jié)果如圖3所示。由圖3中曲線b和c可知，空白殼聚糖膜經(jīng)SC-CO2過(guò)程處理前后的FTIR光譜未見(jiàn)明顯變化，說(shuō)明SSI對(duì)殼聚糖膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)無(wú)影響；由圖3中曲線a可知，丁香酚在1 517.5 cm－1處具有吸收峰，該峰由苯環(huán)的振動(dòng)引起，結(jié)合圖3中曲線d在1 514 cm－1處出現(xiàn)峰值，說(shuō)明丁香酚可通過(guò)SSI負(fù)載至殼聚糖膜中。

圖 3 原料及EG-CSF的 FTIR圖Fig. 3 FTIR spectra of raw materials and EG-CSF

2.5 EG-CSF抑菌性能

EG-CSF作為食品活性包裝，其抑菌性能對(duì)其應(yīng)用具有重要意義。本研究采用抑菌圈法考察了EG-CSF對(duì)3 種常見(jiàn)致病菌的生長(zhǎng)抑制情況，結(jié)果如表2所示。EG-CSF對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌均有抑制作用，且對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用強(qiáng)于大腸桿菌及綠膿假單胞菌。這是由于丁香酚對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用強(qiáng)于對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制作用[29]。并且由表2可見(jiàn)，隨著EG-CSF中丁香酚負(fù)載量的增加，對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用增強(qiáng)，這是由于丁香酚對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制作用具有濃度依賴性[12]?？瞻證SF未表現(xiàn)出對(duì)供試菌的生長(zhǎng)抑制作用，說(shuō)明EG-CSF對(duì)供試菌的生長(zhǎng)抑制作用源于其中負(fù)載的丁香酚。

表 2 EG-CSF對(duì)供試菌的抑菌圈直徑Table 2 Diameters of inhibition zones of three bacteria when exposed to EG-CSF

3 結(jié) 論

采用SSI將丁香酚負(fù)載于殼聚糖膜中，通過(guò)調(diào)節(jié)SSI過(guò)程參數(shù)可調(diào)節(jié)EG-CSF中丁香酚的負(fù)載量，負(fù)載量最高為6.02%。SSI后EG-CSF的吸水率和水蒸氣透過(guò)率較空白CSF均有下降。EG-CSF對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用強(qiáng)于大腸桿菌和綠膿假單胞菌，并且抑制作用與丁香酚負(fù)載量相關(guān)。本研究利用SSI將丁香酚負(fù)載于殼聚糖膜中，過(guò)程條件溫和且避免了有機(jī)溶劑的使用，EG-CSF中丁香酚負(fù)載量可調(diào)，且具有良好的抑菌效果，可應(yīng)用于食品活性包裝領(lǐng)域。