湯 震，顧麗霞，相興偉,2,*，聞?wù)?*，曲有樂，鄭 斌,2，宋厚輝

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022；2.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江 舟山 316021；3.浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院，浙江 杭州 311300）

免疫低下是免疫系統(tǒng)異常的病理性特征，免疫系統(tǒng)包括免疫器官和免疫組織[1]。其中腸黏膜是機體最大的免疫組織，處于被大量抗原包圍的狀態(tài)，具備防御腸內(nèi)致炎因子及致病微生物入侵的功能[2-3]。腸黏膜組織遭到破壞會引發(fā)許多腸源性疾病[4-5]。腸黏膜上皮細(xì)胞之間的緊密連接為主要連接方式[6]，緊密連接分子是由3 種膜蛋白（閉鎖蛋白（Occludin）、緊密連接蛋白和連接黏附分子）以及閉合小環(huán)蛋白（zonula occludens，ZO）家族組成，緊密連接分子表達(dá)量是反映腸道緊密連接屏障功能和通透性功能的重要指標(biāo)[7-8]。其中ZO-1與Occludin定位于細(xì)胞連接處，二者是表達(dá)緊密連接屏障功能的重要蛋白，對保持緊密連接的完整性起到關(guān)鍵作用[9-10]。因此，闡明緊密連接分子表達(dá)量的變化，對認(rèn)識腸黏膜屏障功能、預(yù)防與治療某些腸道疾病具有重要意義。

目前，硒元素被認(rèn)為具有增強機體免疫力、抗氧化、抗腫瘤的生物學(xué)功能，常用的補硒方式為補充以亞硒酸鈉為代表的無機硒，其吸收轉(zhuǎn)化率低且使用受到限制，使用不當(dāng)會產(chǎn)生許多副作用[11]。通過攝入有機硒的方式補充機體所需硒元素能夠提高其轉(zhuǎn)化率并降低毒副作用。目前，對有機硒的開發(fā)引起了研究者的關(guān)注，其中硒多糖可發(fā)揮多糖、硒的雙重生物活性，因此學(xué)者們對其研究尤為重視[12]。前期研究結(jié)果表明，硒化低聚氨基多糖（low-molecular-mass seleno-aminopolysaccharide，LSA）具有較低的毒性，且含有較高含量的多糖和更高生物活性的硒[13]，具有提高機體免疫功能、改善斷奶應(yīng)激引起的腸道免疫失調(diào)的作用[14-15]。本實驗采用腹腔注射環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CPA）建立小鼠免疫抑制模型，研究LSA對免疫低下小鼠組織形態(tài)、回腸ZO-1及OccludinmRNA表達(dá)的影響，進(jìn)而探討LSA對免疫抑制小鼠的免疫器官及腸道組織的保護(hù)作用，以期為將其開發(fā)為免疫調(diào)節(jié)劑提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康BALB/c雄性小鼠80 只，6～8 周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2013-0016。實驗前小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由取食飲水。

CPA 美國Sigma公司；低聚氨基多糖 浙江金殼生物化學(xué)有限公司；LSA 浙江海洋大學(xué)海洋藥物研究實驗室；TRIzol試劑 美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix ExTaq日本Takara公司；DEPC水（RNase-Free水） 生工生物工程（上海）股份有限公司；亞硒酸鈉、乙醇、異丙醇、多聚甲醛、冰乙酸均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)、MyCycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；Multiskan FC全自動酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；CKX41倒置顯微鏡 深圳市宇德立生物科技有限公司；ZHJH-C1209C型垂直流超凈工作臺上海智城儀器制造有限公司；ABI ViiA? 7實時熒光定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及給藥

小鼠按體質(zhì)量隨機分為8 組，分別為空白組（Con組）、模型組（CPA組）、3 種劑量LSA組、亞硒酸鈉組（SE組）、低聚氨基多糖組（LA組）、亞硒酸鈉與低聚氨基多糖復(fù)合組（SELA組），每組10 只?？瞻捉M與模型組灌胃生理鹽水，LSA1、LSA2、LSA3組分別按照0.3、0.6、0.9 mg/（kgmb·d）劑量灌胃LSA，SE組灌胃Na2SeO3（0.3 mg/（kgmb·d）），LA組灌胃低聚氨基多糖（9.87 mg/（kgmb·d）），SELA組灌胃Na2SeO3（0.3 mg/（kgmb·d））＋低聚氨基多糖（9.87 mg/（kgmb·d）），連續(xù)灌胃14 d；除空白組外，其他組在第11、12、13、14天腹腔注射50 mg/kgmbCPA，每日1 次。

1.3.2 小鼠臟器指數(shù)的測定

末次給藥24 h（禁食）后，小鼠稱體質(zhì)量，眼球取血，頸椎脫臼處死，隨后迅速摘取脾臟和胸腺，用生理鹽水洗滌臟器后用濾紙吸干水跡，分別稱質(zhì)量，記錄。按照下式計算臟器指數(shù)。

1.3.3 小鼠脾臟、空腸組織形態(tài)學(xué)觀察

新鮮脾臟與空腸組織用生理鹽水多次沖洗，洗去殘留血液，加10 mL體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液常溫固定24 h，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片機將組織石蠟塊連續(xù)切成6 μm組織切片，每個組織塊隨機選取兩張進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，顯微鏡下觀察組織病理變化情況。

1.3.4 小鼠回腸組織緊密連接蛋白mRNA表達(dá)水平測定

1.3.4.1 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

小鼠回腸組織在液氮中進(jìn)行充分研磨，收集回腸組織粉末，每0.1 g小腸組織加1 mL TRIzol試劑，室溫靜置5 min充分裂解細(xì)胞；加入0.2 mL氯仿，用力振蕩離心管15 s（使溶液充分乳化，呈乳白狀且無分層現(xiàn)象），4 ℃、12 000 r/min離心15 min；取上清液，加入等體積預(yù)冷異丙醇，充分混勻，－20 ℃靜置30 min使RNA沉淀，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，移除上清液，加入4 ℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液（DEPC水配制）1 mL，離心，溫和洗滌沉淀，重復(fù)2 次，置于通風(fēng)櫥內(nèi)使乙醇揮發(fā)；加適量DEPC水溶解RNA，即得RNA樣品。取1 μL RNA樣品用核酸蛋白定量儀檢測OD260nm/OD280nm、OD260nm/OD230nm及RNA質(zhì)量濃度，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的完整性。取上述RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，具體操作依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.4.2 引物設(shè)計

表 1 ZO-1、Occludin的實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

設(shè)計并合成小鼠ZO-1、Occludin特異性引物，具體序列見表1。用SYBR Green法對反轉(zhuǎn)錄所得cDNA模板進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測（以β-actin作為內(nèi)參基因）。

1.3.4.3 實時熒光定量PCR擴增

取適量上述cDNA樣品，依照熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作。以cDNA為模板，用目的基因引物進(jìn)行實時熒光定量PCR分析，擴增體系為：10 μL SYBR Green qPCR mix、0.4 μL ROXII、2.0 μL cDNA、10 μmol/L上游引物0.4 μL、10 μmol/L下游引物0.4 μL、dH2O 6.8 μL，總計20.0 μL。

將上述體系按照如下程序進(jìn)行擴增：50 ℃、120 s，95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，各靶基因相應(yīng)退火溫度退火60 s，40 個循環(huán)。溶解曲線的繪制按照熒光定量PCR儀的說明書進(jìn)行。每個樣品靶基因的相對mRNA表達(dá)水平用2－△△Ct法計算，每組別樣品進(jìn)行4 個重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，各組間釆用最小顯著性差異法進(jìn)行多重比較檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 LSA對小鼠臟器指數(shù)的影響

與空白組比較，模型組小鼠連續(xù)腹腔注射4 d CPA后，出現(xiàn)厭食、精神委頓等臨床表現(xiàn)。對各組小鼠體質(zhì)量、脾臟及胸腺指數(shù)進(jìn)行測定，結(jié)果如表2所示。與對照組相比，CPA顯著降低了小鼠脾臟和胸腺指數(shù)（P＜0.05）。與模型組相比，灌胃LSA能顯著提高小鼠脾臟及胸腺指數(shù)（P＜0.05）。此外，與模型組小鼠相比，SE組、LA組及SELA組小鼠的胸腺、脾臟指數(shù)均無顯著性變化。

表 2 LSA對小鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)的影響Table 2 Effect of LSA on body mass, thymus index and spleen index in mice

2.2 LSA對小鼠脾臟組織形態(tài)的影響

圖 1 LSA對小鼠脾臟組織形態(tài)的影響（×100）Fig. 1 Effect of LSA on spleen morphology of mice (× 100)

器官的組織結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮功能的基礎(chǔ)。脾臟分為被膜和實質(zhì)，脾實質(zhì)的淋巴組織由白髓和紅髓組成。由圖1可知，空白組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)清晰，白髓、紅髓界限明顯，白髓面積大；模型組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)較模糊，白髓和紅髓界限不清，白髓面積明顯縮??；與模型組比較，中、高劑量LSA組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)較清晰，紅髓和白髓界限較明顯，白髓面積增大。結(jié)果提示攝入LSA對小鼠脾臟組織有保護(hù)作用。

2.3 LSA對小鼠空腸組織形態(tài)的影響

圖 2 LSA對小鼠空腸組織形態(tài)的影響（×100）Fig. 2 Effect of LSA on histopathological observation of the mice jejunum (× 100)

如圖2所示，空白組（圖2A）小腸絨毛排列整齊、細(xì)長緊密、隱窩較深、腸壁厚實；而模型組（圖2B）小腸絨毛松散且絨毛結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破損，部分絨毛甚至出現(xiàn)斷裂、脫落的現(xiàn)象，隱窩變淺，腸壁變?。坏蛣┝縇SA組小鼠小腸絨毛形態(tài)無明顯改善，中、高劑量LSA組（圖2D、E）小腸絨毛形態(tài)略有好轉(zhuǎn)，相對模型組和低劑量LSA組，絨毛結(jié)構(gòu)較完整，破損狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，排列較整齊。上述結(jié)果提示攝入LSA對小鼠空腸組織有一定的保護(hù)作用，能夠緩解CPA導(dǎo)致的腸道損傷。

2.4 總RNA純度和完整度分析結(jié)果

采用微量核酸定量儀檢測RNA OD260nm/OD280nm，結(jié)果顯示其值都在1.8～2.0之間，表明提取的總RNA無明顯的鹽類、DNA及蛋白等其他有機物污染。如圖3所示，有清晰的28S、18S及5S條帶，其中28S條帶亮度基本是18S的兩倍，5S條帶亮度較弱，且條帶與條帶之間無明顯拖尾現(xiàn)象，表明總RNA較完整，基本無降解。因此，所提樣品總RNA質(zhì)量可靠，可用于后續(xù)實驗。

圖 3 部分小鼠回腸組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 3 Agarose gel electropherogram of total RNA from ileum tissue of mice

2.5 回腸組織緊密連接蛋白mRNA表達(dá)水平

由4圖可知，與空白組比較，模型組小鼠回腸ZO-1和OccludinmRNA表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，灌胃LSA后，免疫抑制小鼠回腸ZO-1及OccludinmRNA表達(dá)量有所上升，其中，中、高劑量LSA組的ZO-1、OccludinmRNA表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），且中劑量LSA組的效果最好。但是SE組、LA組及SELA組小鼠回腸ZO-1、OccludinmRNA表達(dá)量與模型組相比變化不顯著。

圖 4 LSA對小鼠回腸ZO-1（A）和Occludin（B）mRNA表達(dá)水平的影響Fig. 4 Effect of LSA on mRNA expression of ZO-1 (A) and occludin (B)in ileum of immunosuppressed mice

3 討 論

研究表明，硒作為機體必不可少的微量元素之一，在體內(nèi)起著非常重要的作用，尤其在氧化還原系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)方面[16-18]，但亞硒酸鈉具有較大的毒性，副作用較大。為解決以亞硒酸鈉補硒方式中硒毒性的問題，硒多糖作為一種低毒、高活性有機硒成為了研究的焦點，許多學(xué)者利用多糖的羥基作為結(jié)合位點與亞硒酸鈉反應(yīng)制備硒多糖，研究其活性。劉寬輝等證明多糖-硒化多糖復(fù)方可以增強免疫活性[19]；于闖發(fā)現(xiàn)經(jīng)亞硒酸鈉化學(xué)修飾后的茶多糖（Cse-tps1）活性明顯比普通茶多糖（Tps1）強，其中Cse-tps1主要是以Vas C—O—Se和O—H—Se與多糖進(jìn)行結(jié)合[20]；羊雪芹等通過建立CPA誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠模型研究Z0206細(xì)菌富硒，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌富硒多糖能增強小鼠的免疫功能，對CPA誘導(dǎo)的免疫抑制具有緩解作用[21]。與單一羥基結(jié)合位點的多糖相比，本研究中使用低聚氨基多糖存在氨基、酰胺基結(jié)合位點，能夠提高的硒化效率，研究結(jié)果表明硒化修飾增強了低聚氨基多糖的生物活性。

免疫抑制是機體免疫功能異常的一種表現(xiàn)，是指機體在單一或多種致病因素的作用下，免疫系統(tǒng)受到損害，導(dǎo)致機體出現(xiàn)暫時性或是持久性的免疫應(yīng)答功能紊亂，從而產(chǎn)生對疾病的高度易感性[22]。CPA作為一種臨床上常用的化療藥物，其在發(fā)揮良好的抑制腫瘤細(xì)胞生長作用的同時也對正常細(xì)胞產(chǎn)生了一定的毒副效應(yīng)，從而造成機體免疫系統(tǒng)損傷。因此，在免疫學(xué)研究中，常以CPA作為制備免疫抑制模型的藥物。本實驗采用腹腔注射CPA建立了BALB/c小鼠免疫抑制模型，實驗結(jié)果顯示，小鼠連續(xù)4 d腹腔注射CPA后產(chǎn)生了明顯的免疫抑制癥狀，行為學(xué)上主要表現(xiàn)為厭食、精神委頓等，小鼠免疫器官（脾臟、胸腺）臟器指數(shù)明顯減?。徊±砬衅琀E染色結(jié)果顯示，模型組小鼠脾臟發(fā)生病理性結(jié)構(gòu)變化，與其他文獻(xiàn)報道的結(jié)果[23-25]基本一致。機體免疫器官由中樞免疫器官和周圍免疫器官兩大部分組成，本研究所涉及的胸腺、脾臟分別屬于中樞免疫器官和周圍免疫器官，兩者的臟器指數(shù)在某種程度上能反映機體免疫功能的高低。因此，本實驗考察了小鼠的胸腺及脾臟指數(shù)，結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠胸腺及脾臟指數(shù)明顯下降，灌胃LSA后的小鼠胸腺及脾臟指數(shù)顯著上調(diào)，說明LSA對CPA所致免疫器官萎縮有一定的預(yù)防和保護(hù)作用。本實驗進(jìn)一步通過病理切片HE染色觀察了小鼠脾臟組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)，結(jié)果顯示，較空白組小鼠，模型組小鼠的脾臟結(jié)構(gòu)較模糊，紅髓、白髓界限不明顯，白髓面積小；灌胃LSA后，小鼠脾臟結(jié)構(gòu)較清晰，紅髓、白髓分界比較明顯，白髓面積增大。小鼠脾臟、胸腺指數(shù)及脾臟形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果提示LSA能在一定程度上逆轉(zhuǎn)CPA引起的變化，改善CPA對小鼠胸腺及脾臟造成的損傷。

腸道不僅是機體消化食物和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，同時也是許多病原體入侵或起始感染的主要位點[26-27]。腸內(nèi)淋巴細(xì)胞較多，且腸道接觸抗原的表面積較大，因此腸道還是機體最大的免疫組織，其免疫屏障功能的正常發(fā)揮對維持機體整體免疫起著至關(guān)重要的作用[28-29]。CPA對增殖迅速的組織細(xì)胞存在強大的殺傷作用，而被應(yīng)用為一種常用的惡性腫瘤化療藥物，但因其特異性不強，易產(chǎn)生多種副作用，其中胃腸道不良反應(yīng)發(fā)生率最高，主要表現(xiàn)為食欲下降、嘔吐、腹瀉等[30]。本實驗發(fā)現(xiàn)，BALB/c小鼠連續(xù)4 d腹腔注射CPA后出現(xiàn)小腸絨毛破損、變短、排列稀疏，細(xì)胞間緊密連接分子ZO-1和OccludinmRNA表達(dá)水平顯著下降等變化，與文獻(xiàn)[31-32]結(jié)果基本一致。腸腔內(nèi)抗原物質(zhì)的抵御作用依賴于腸道組織結(jié)構(gòu)的完整性，其中小腸絨毛長度與結(jié)構(gòu)的完整性在腸道黏膜免疫過程中起著重要的作用[33-34]。本實驗結(jié)果顯示，CPA對小腸絨毛結(jié)構(gòu)有破壞作用，甚至出現(xiàn)部分絨毛脫落的現(xiàn)象，攝入LSA可以在一定程度上緩解CPA對腸絨毛結(jié)構(gòu)的損傷，具有保護(hù)腸道的作用。ZO-1和Occludin是細(xì)胞間緊密連接的重要組成部分，腸道ZO-1、Occludin基因表達(dá)量結(jié)果顯示LSA能顯著恢復(fù)CPA所致細(xì)胞緊密連接分子表達(dá)的抑制，結(jié)合小鼠腸道HE染色結(jié)果，進(jìn)一步證實了LSA對腸道的保護(hù)作用。綜上，本研究結(jié)果表明LSA具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能及保護(hù)腸道作用，這將為LSA的開發(fā)與利用提供數(shù)據(jù)支撐。