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        鄰苯二甲酸二丁酯的光敏毒性作用及機制

        2019-12-03 01:08:18李志軍包海鷹
        食品科學 2019年21期
        關鍵詞:質量

        李志軍,包海鷹*

        (吉林農業(yè)大學藥用菌物資源及開發(fā)利用重點研究室,食藥用菌教育部工程研究中心,吉林 長春 130118)

        鄰苯二甲酸酯(phthalate esters,PAEs)是鄰苯二甲酸的酯化衍生物。作為塑化劑,PAEs被廣泛應用于塑料、涂料、油墨的生產(chǎn)中,同時也可添加于驅蟲劑、發(fā)膠噴霧劑、指甲油和火箭燃料中,但PAEs對人類健康具有嚴重危害[1]。PAEs是全球最普遍的環(huán)境激素類污染物,在食品、飲用水、人體體液中被不同程度檢出[2]。美國國家環(huán)保局將PAEs列為環(huán)境優(yōu)先污染物,同時其也被人們稱為“第二個全球性多氯聯(lián)苯污染物”。PAEs經(jīng)口進入人體后主要以水解產(chǎn)生單酯的形式被吸收,單酯被認為是產(chǎn)生毒性的主要化合物。哺乳動物腸黏膜細胞中的腸酯酶及小腸中的細胞外膜可將PAEs水解成單酯[3],如鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)進入體內后可水解為鄰苯二甲酸單丁酯(mono-n-butylphthalate,MBP)。PAEs被吸收后主要以蛋白結合體的形式通過血液分布于全身各器官[4]。PAEs類化合物感染大鼠后,在大鼠肝臟、腎臟、心臟、肺、睪丸等各臟器中均可檢出其原型及代謝產(chǎn)物,甚至還可以通過血腦屏障在腦組織中檢出[5]。研究表明,MBP生物活性更高、毒性更強,其不僅對生殖、發(fā)育、體內激素、核受體、炎癥和肥胖等方面都能產(chǎn)生影響,甚至還可以致死、致畸、致突變[6];因此MBP成為PAEs毒性研究的新熱點[7-11]。MBP灌胃染毒大鼠后,肝臟和腎臟中活性氧(reactive oxygen species,ROS)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量較高,谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量較低。MBP的暴露與大鼠肝臟和腎臟組織的氧化損傷存在直接聯(lián)系[12-13]。據(jù)Cao Yuchun[14]和白璐[15]等報道,在食用膠質菌中含有天然的PAEs類物質并具有光敏活性,但目前尚鮮見對DBP導致的光敏體內藥代動力學及機制的研究。本研究以DBP為對象,從自由基損傷和肝臟、腎臟毒性角度探討DBP的光敏毒性、致毒機制和體內代謝過程,以期為全面評價PAEs對人體健康的影響提供更豐富的信息,為全面了解PAEs毒性提供依據(jù),為安全性評價和毒性機制的研究提供參考資料。

        1 材料與方法

        1.1 動物、材料與試劑

        雄性Wistar大鼠(體質量200~220 g)購自吉林大學標準試驗動物中心,生產(chǎn)許可證號:SCXK(吉)2016-0003。

        DBP標準品、MBP標準品(純度≥99.0%) 美國Sigma公司;甲基叔丁基醚(純度≥99.0%) 國藥集團化學試劑有限公司;冰醋酸、三氯乙酸、氯仿(均為分析純)、甲醇(色譜純) 美國Tedia公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

        1.2 儀器與設備

        2695型高效液相色譜儀 美國Waters公司;1K15高速離心機 美國Sigma公司;MVS.1漩渦混合器 北京北德科學器材有限公司;KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;ME204E型萬分之一天平梅特勒-托利多(常州)稱重設備系統(tǒng)有限公司;電子轟擊質譜儀 美國Thermo Fisher公司;電噴霧離子源浙江好創(chuàng)生物技術有限公司;RM2126RT切片機德國Leica公司;BX51光學顯微鏡(附帶DP75數(shù)碼相機) 日本Olympus公司。

        1.3 方法

        1.3.1 DBP和MBP質量濃度的測定

        色譜柱:C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相A:甲醇,流動相B:體積分數(shù)0.1%甲酸-水溶液。梯度條件:0~5 min,80%~95% A;5~9 min,95%~100% A;9~10 min,100% A;10~13 min,100%~80% A;13~15 min,80% A。流速:0.25 mL/min;檢測波長:254 nm;柱溫:25 ℃;進樣量:10 μL。

        1.3.2 DBP體外實驗

        對6 只健康Wistar雄性大鼠眼眶取血10 mL,置于肝素化的離心管中,3 000×g離心15 min,吸取血清4 mL作為空白。分別取40 mg DBP溶于2 mL生理鹽水和2 mL大鼠血清中,避光30 ℃放置12 h(避光組);分別取40 mg DBP溶于2 mL生理鹽水和2 mL大鼠血清中,置于日光下12 h(日光組)。3 000×g離心15 min,取血清0.2 mL,添加0.6 mL甲醇,漩渦振蕩1 min,離心,上清液70 ℃下烘干,再用0.2 mL甲醇超聲溶解,離心,微孔濾膜過濾。取上清液10 μL,按照1.3.1節(jié)方法測定DBP和MBP質量濃度。

        1.3.3 DBP體內實驗

        1.3.3.1 DBP血藥濃度的測定

        對大鼠一次性給予2 000 mg/kgmbDBP灌胃染毒。對照組以等體積玉米油進行灌胃。分別設置避光組和日光組,避光組置于暗室中,調節(jié)暗室內溫度與室外一致,日光組置于室外日光下,每組6 只大鼠。大鼠灌胃后分別于5、15、30、45 min和1、2、3、4、5、8、12、24、48 h眼眶取血0.8 mL,置于肝素化的離心管中,3 000×g離心15 min,取血清0.2 mL,添加0.6 mL甲醇,漩渦振蕩1 min,離心,上清液70 ℃下烘干,再用0.2 mL甲醇超聲溶解,離心,微孔濾膜過濾。取上清液10 μL按照1.3.1節(jié)方法測定DBP和MBP質量濃度。

        1.3.3.2 MBP組織分布的測定

        按1.3.3.1節(jié)方法對大鼠灌胃進行200 mg/kgmbMBP染毒。溶劑對照組以等體積玉米油進行灌胃。日光組和避光組分別設置為5、15、30、45 min和1、2 h組,每組6 只大鼠。各組大鼠經(jīng)灌胃染毒后觀察并記錄體征變化。染毒結束后處死大鼠,分取肝臟、心臟、肺、腎臟和脾臟。臟器用生理鹽水沖洗表面血跡,濾紙吸干,稱質量,磨碎。用20 mL甲醇超聲提取,取上清液1 mL,烘干,再用0.2 mL甲醇超聲提取,離心,微孔濾膜過濾。取上清液10 μL按照1.3.1節(jié)方法測定MBP質量濃度。

        1.3.3.3 臟器損傷相關指標的測定

        按1.3.3.2節(jié)方法對大鼠進行灌胃染毒,日光組和避光組分別設置為5、15、30、45 min和1、2 h組,每組6 只大鼠。對大鼠進行眼眶取血,以灌胃染毒前采血樣品為空白對照,離心10 min后吸出上層血漿,分別檢測血漿中MDA、GSH、ROS含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力。隨后取大鼠的部分肝臟和腎臟組織,先用預冷的磷酸鹽緩沖液漂洗,然后稱取適量組織,加入磷酸鹽緩沖液(pH 7.5),制成質量分數(shù)為10%的勻漿液,低溫離心后取上清液,參考文獻[13]測定ROS、GSH、MDA含量和SOD活力。

        1.3.3.4 組織病理學變化觀察

        按1.3.3.2節(jié)方法對大鼠進行灌胃染毒,取大鼠部分肝臟和一側的腎臟,用體積分數(shù)10%甲醛溶液固定,脫水,透明,浸蠟,包埋,切片,蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色,在光學顯微鏡下觀察組織的病理學變化。

        1.3.3.5 代謝樣品的采集

        取健康Wistar雄性大鼠12 只,隨機分為避光組和日光組,每組各6 只。分置于代謝籠中,給藥前禁食,實驗期間自由進食與飲水。以2 000 mg/kgmbDBP給大鼠灌胃染毒。分別收集避光組與日光組給藥前(空白)及給藥后0~4、4~8、8~12、12~24 h各時間段的尿樣和糞樣,記錄尿樣體積,置于-80 ℃保存待測。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

        所有實驗均重復3 次,結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和簡單相關性分析。用SIMCA-P 11.5軟件對數(shù)據(jù)進行回歸分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

        2 結果與分析

        2.1 DBP體外實驗分析結果

        圖 1 MBP和DBP的液相色譜圖Fig. 1 Liquid chromatograms of MBP and DBP

        圖1結果表明,DBP與血清混合后,在避光和日光下放置12 h均有MBP生成。但DBP與生理鹽水混合后,在避光和日光下放置12 h均無MBP的生成。在空白血清中沒有檢測到MBP和DBP。對MBP進行分離,其電子轟擊質譜圖如圖2所示。

        圖 2 MBP的電子轟擊質譜圖Fig. 2 Electron impact mass spectrum of MBP

        2.2 DBP體內實驗分析結果

        圖 3 DBP和MBP在大鼠體內的質量濃度變化Fig. 3 Changes in blood concentrations of DBP and MBP in rats

        對大鼠單獨灌胃1/10半數(shù)致死量的DBP后,DBP在大鼠體內的質量濃度變化見圖3。隨著時間的延長,DBP在大鼠血液中的質量濃度不斷增加,在15 min左右避光組與日光組出現(xiàn)最大值,避光組為0.063 μg/mL,日光組為0.026 μg/mL;之后DBP質量濃度均下降,到3 h左右避光組出現(xiàn)第2個峰值(0.017 μg/mL);同時,根據(jù)高效液相色譜分析結果,從大鼠血液中還檢測到MBP。日光組大鼠在2 h左右全部死亡,其血液中的MBP質量濃度高于避光組大鼠,在2 h時達到0.133 μg/mL。避光組大鼠血液中的MBP質量濃度在1 h時出現(xiàn)最大值(0.054 μg/mL),之后趨于平穩(wěn),12 h后開始下降,24 h左右MBP質量濃度降到0.001 μg/mL。

        2.2.2 MBP在大鼠體內的分布

        大鼠灌胃DBP并在日光下照射2 h左右后出現(xiàn)急性中毒死亡,因此選擇將組織分布實驗時間設計在0~2 h。DBP灌胃大鼠后主要以水解產(chǎn)生MBP的形式被吸收,因此以MBP作為研究對象。圖4結果表明,MBP灌胃大鼠后,避光條件與日光條件下,肝臟與腎臟中MBP質量濃度均高于脾、肺和心臟。肝臟和腎臟在避光條件與日光條件下MBP分布表現(xiàn)出較大差異:在避光條件下,肝臟中MBP質量濃度在45 min左右達到最大值(0.030 μg/mL),然后趨于平穩(wěn);腎臟中MBP質量濃度在45 min左右達到最大值(0.254 μg/mL),之后趨于平穩(wěn);日光組肝臟與腎臟中MBP質量濃度均在30 min左右達到最大值,肝臟中為0.048 μg/mL,腎臟中為0.043 μg/mL,之后MBP質量濃度先下降后趨于平穩(wěn)。

        圖 4 MBP在大鼠體內的分布Fig. 4 Distribution of MBP in rats

        2.2.3 臟器損傷相關指標的測定

        表 1 MBP對大鼠肝臟中ROS、MDA、GSH含量和SOD活力的影響Table 1 Effect of DBP on ROS, MDA, GSH and SOD levels in rat liver

        由表1、2可見,與空白對照組相比,避光組和日光組大鼠肝臟和腎臟中的ROS和MDA含量均升高,但灌胃30 min后日光組ROS含量明顯高于避光組。避光組和日光組大鼠肝臟和腎臟中GSH含量和SOD活力均降低,但灌胃15 min后日光組明顯低于避光組。

        表 2 MBP對大鼠腎臟中ROS、MDA、GSH含量和SOD活力的影響Table 2 Effect of DBP on ROS, MDA, GSH and SOD levels in rat kidney

        2.2.4 大鼠肝臟組織切片觀察結果

        圖 5 大鼠肝臟組織HE染色結果(×100)Fig. 5 Hematoxylin eosin staining of liver tissue(× 100)

        以200 mg/kgmbMBP灌胃后,在顯微鏡下觀察經(jīng)HE染色的大鼠肝臟組織細胞時發(fā)現(xiàn),肝細胞的損傷程度與光照時間存在明顯的時間-效應關系,大鼠肝細胞在日光下2 h損傷最明顯。由圖5可看出,避光組灌胃MBP后5 min~2 h內,肝臟細胞均以中央靜脈為中心向外呈輻射狀排列,肝竇狀隙規(guī)則分布且細胞排列較為密實,肝臟細胞損傷不明顯(圖5A~D)。日光組在灌胃MBP后30 min左右肝細胞局部伴隨輕微炎癥細胞浸潤、細胞核輕微固縮、局部胞漿空亮和局部細胞腫大等癥狀;隨著時間的延長,在1 h左右出現(xiàn)部分肝細胞水腫、細胞核固縮、破裂、水解癥狀;2 h左右肝細胞出現(xiàn)胞漿空亮、核消失、空泡樣變、脂肪滴增大融合、局部細胞嚴重壞死癥狀,說明肝細胞存在嚴重的氧化損傷(圖5E~H)。因此,在日光下MBP對大鼠肝臟的損傷程度高于避光條件。

        2.2.5 大鼠腎臟組織切片觀察結果

        丹皮酚對強直性脊柱炎模型小鼠Wnt和BMP/Smad信號轉導通路的影響 ………………………………… 吳 琪等(11):1500

        圖 6 大鼠腎臟組織HE染色結果(×100)Fig. 6 Hematoxylin eosin staining of kidney tissue(× 100)

        顯微鏡下觀察大鼠腎臟組織切片時發(fā)現(xiàn),與肝臟組織細胞相比,日光組大鼠腎臟組織細胞同樣發(fā)生了嚴重的組織損傷。灌胃MBP后,避光組大鼠(圖6A~D)出現(xiàn)了局部腎小管上皮細胞脫落、水樣變性等癥狀,但大鼠腎臟病理切片可見腎皮質和髓質結構清晰,系膜區(qū)無增生及沉積物,基底膜未見病變;隨著時間的延長,在2 h左右細胞腎小囊管腔變窄,出現(xiàn)炎癥細胞浸潤等癥狀。日光組大鼠(圖6E~H)灌胃MBP后1 h左右,出現(xiàn)了腎小體數(shù)目減少、腎小囊管腔變窄、淋巴細胞浸潤程度增大等癥狀,且損傷程度明顯高于避光組。結果表明日光能夠加重MBP對大鼠的腎臟損傷。

        2.2.6 DBP對大鼠排泄的影響

        大鼠灌胃DBP后,其主要以MBP的形式從尿液中排泄,且在尿液中沒有檢測到DBP,避光組0~4 h時尿液中MBP質量濃度為0.427 μg/mL,4~8 h時為0.164 μg/mL,8~12 h時為0.455 μg/mL,12~24 h時為0.560 μg/mL。日光組0~4 h時尿液中MBP質量濃度為0.132 μg/mL,4~8 h時為0.069 μg/mL,8~12 h時為0.291 μg/mL,12~24 h時為0.099 μg/mL。在0~24 h內,避光組大鼠尿液中MBP質量濃度高于日光組(圖7A)。MBP和DBP在大鼠糞便中均被檢出(圖7B),且0~24 h內避光組大鼠糞便中DBP和MBP質量濃度均大于日光組。結果表明與日光組相比較,避光組大鼠體內DBP更容易代謝排出體外。

        圖 7 大鼠排泄物中DBP、MBP的質量濃度變化Fig. 7 Changes in urinary and fecal concentrations of DBP and MBP in rats

        3 討 論

        PAEs是全球最普遍的環(huán)境激素類污染物,其中DBP是我國最常使用的增塑劑之一,其可通過飲食攝入、呼吸道吸入和皮膚接觸等途徑對人體造成危害[16],可導致過敏性皮炎[17]以及生殖[18]、神經(jīng)、肝臟、腎臟和心臟等多種器官系統(tǒng)的損傷[17-23]。DBP導致肝細胞過氧化物酶增多、肝腫大的問題曾引起專家的重視,盡管該作用機制還不是十分明確,但是過氧化物酶增生和肝腫大通常發(fā)生在腫瘤形成之前[24]。近年來,有研究者通過測量尿液中DBP代謝物MBP的含量來間接反映DBP的接觸水平,基于樣品的易得到性和檢測方法的成熟性,認為MBP是一種較合適的反映DBP暴露的生物標志物[25]。

        本實驗應用對比研究,結合多元統(tǒng)計分析方法,對DBP的光敏毒性進行研究,旨在找出DBP與光照的關聯(lián)性以及DBP在光照下毒性加劇的機理,從整體上闡明光照條件對大鼠的毒性作用及代謝調控機制。本研究采用高效液相色譜法檢測了在光照和避光條件下大鼠體外、體內血清中DBP和MBP的質量濃度。體外血清實驗結果表明DBP在大鼠血清中轉化為MBP,與是否光照無關。因此,對于MBP在日光下是否會加劇對大鼠的毒性作用以及機理進行研究。大鼠代謝實驗中,經(jīng)口灌胃DBP,其可迅速經(jīng)胃腸道吸收,經(jīng)小腸內的非特異性酶代謝成穩(wěn)定的MBP,MBP和其他代謝產(chǎn)物與葡糖普酸結合后隨尿液排出[3]。大鼠經(jīng)口給予MBP后,在心臟、肝臟、脾、肺和腎臟中均能檢測到DBP,但肝臟和腎臟中MDP質量濃度明顯高于其他臟器。

        Jurczuk等的研究表明,ROS超過一定濃度時會對其他生物分子產(chǎn)生不利影響[26],因此ROS的生成和氧化應激反應是MBP造成肝臟和腎臟炎癥的主要方式。在灌胃MBP后,日光組大鼠的肝臟和腎臟組織GSH含量下降,這可能是由于MBP持續(xù)氧化產(chǎn)生應激產(chǎn)物ROS所引起,同時GSH由于去除過氧化氫而被消耗。王立蓉等研究表明,細胞GSH含量降低到一定程度時,細胞會受到不可逆損傷[27]。MDA在機體的新陳代謝過程中發(fā)揮重要作用,可以造成膜的流動性與通透性的改變,導致異常生理生化反應與免疫反應的產(chǎn)生。SOD可以保護細胞不受氧自由基的損傷,能夠清除H2O2和·OH。當MDA含量升高、SOD活力降低時,可以引發(fā)氧化應激反應,從而損傷細胞甚至導致某些細胞的死亡[28]。對染毒大鼠肝臟和腎臟中關鍵指標進行測定,結果表明,ROS和MDA的含量與MBP染毒后光照時間呈正相關,GSH含量和SOD活力與MBP染毒后光照時間呈負相關;相同劑量MBP染毒后,與避光組相比,日光組大鼠血清中ROS和MDA含量較高,GSH含量和SOD活力較低,表明光照能加劇MBP對大鼠肝臟和腎臟組織的氧化損傷。

        肝臟和腎臟的HE染色病理切片觀察結果表明,染毒后隨著時間的延長,日光組大鼠肝細胞和腎小管上皮細胞出現(xiàn)明顯的細胞核固縮、細胞水腫、空泡樣變、脂肪滴增大融合等癥狀,而避光組損傷程度相對較輕,結果表明日光能夠加劇MBP對大鼠肝臟和腎臟的組織損傷。大鼠排泄物的研究結果表明,光照條件較避光條件下MBP在大鼠體內更不易排出體外。說明DBP是一種對雄性大鼠具有潛在危害的光敏毒性物質。

        DBP可通過食物、飲水等多種途徑被人體攝入[29]。張鵬等研究表明,在膠陀螺中含有一定量的天然DBP[30],且近年來更有膠質菌食用不當而引發(fā)的急性中毒事件的報道[31]。李志軍等研究表明,不同的浸泡方式對黑木耳中DBP含量存在相關性[32],膠質菌的急性中毒事件可能與膠質菌中存在的DBP有關。本研究證明了DBP的光敏毒性和在體內臟器中的分布規(guī)律,應重視DBP對人體的潛在危害,并對DBP及含有天然DBP食品的健康危險度做出更全面的評價。

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