朱曉丹，賈春虹，王 東，靖俊杰，賀 敏*

（北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100097）

氟啶胺是日本石原產(chǎn)業(yè)自主研發(fā)生產(chǎn)的2,6-二硝基苯胺類低毒、廣譜性殺菌劑，對蔬菜及果樹上的許多病害都有一定的防治效果[1-3]。氟啶胺對疫病有特效，很多登記產(chǎn)品用于防治辣椒疫病、馬鈴薯和番茄晚疫病等[4-8]。蔥是我國傳統(tǒng)的調(diào)味品蔬菜，在我國屬于小作物[9-10]。近些年隨著市場需要，蔥的種植面積不斷擴(kuò)大，且復(fù)種指數(shù)增加，其病害發(fā)生情況逐年加重[11-13]。氟啶胺已廣泛用于蔥疫病的防治，但目前氟啶胺并未在蔥上登記使用[14]，且無食品安全限量標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)生產(chǎn)和安全監(jiān)管，亟需開展氟啶胺在蔥上的殘留試驗(yàn)，制定氟啶胺在蔥上的食品安全限量標(biāo)準(zhǔn)，保障農(nóng)產(chǎn)品安全和進(jìn)出口貿(mào)易[15]。

關(guān)于氟啶胺的殘留與消解行為研究，國內(nèi)外已見報道的作物有辣椒、馬鈴薯、人參等[16-20]，其在不同作物上的殘留量差異較大。目前國內(nèi)外鮮見氟啶胺在大蔥或小蔥上的殘留報道。國內(nèi)外報道的關(guān)于氟啶胺的檢測分析方法有氣相色譜法[21-23]、液相色譜法[24-25]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[26-28]，涉及的基質(zhì)有蔬菜、水果和糧食作物，但鮮有涉及大蔥或小蔥。因此，本試驗(yàn)開展氟啶胺在大蔥和小蔥上的殘留分析方法研究，并開展氟啶胺39.5%（體積分?jǐn)?shù)）懸浮劑在大蔥和小蔥上的消解動態(tài)和最終殘留試驗(yàn)，本研究結(jié)果可為氟啶胺在大蔥和小蔥上的安全合理使用技術(shù)、膳食攝入風(fēng)險評估和食品安全限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)地點(diǎn)和蔥品種：北京市順義區(qū)木林鎮(zhèn)榮各莊村的試驗(yàn)蔥品種為‘北京高腳白’；山東省淄博市周村區(qū)南郊鎮(zhèn)柳行村的試驗(yàn)蔥品種為‘章丘大蔥’；內(nèi)蒙古烏蘭察布市涼城縣麥胡圖鎮(zhèn)麥勝七隊的試驗(yàn)蔥品種為‘春蔥一號’；江蘇省南京市溧水區(qū)百馬鎮(zhèn)江蘇省農(nóng)科院試驗(yàn)基地的試驗(yàn)蔥品種為‘小香蔥’；四川省彭州市濛陽鎮(zhèn)四川省農(nóng)科院植物高技術(shù)育種試驗(yàn)基地的試驗(yàn)蔥品種為小蔥；浙江省杭州市余杭區(qū)倉前鎮(zhèn)羊鍋林的試驗(yàn)蔥品種為‘四季小蔥’。

甲酸（色譜純，純度89.5%）、氟啶胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.6%） 百靈威科技有限公司；乙腈（色譜純，純度大于99.9%） 美國賽默飛世爾公司；氟啶胺39.5%（500 g/L）懸浮劑 日本石原產(chǎn)業(yè)株式會社；純凈水 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；0.22 μm濾膜 美國Waters公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity-Xevo TQD超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜（配備MassLynx V 4.1數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)）、Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美國Waters公司；2 mL凈化劑管（內(nèi)裝有無水硫酸鎂150 mg、N-丙基乙二胺50 mg、石墨化炭黑50 mg、十八烷基碳50 mg） 天津博納艾杰爾科技有限公司；2094樣品均質(zhì)機(jī) 丹麥FOSS公司；1/100 000和1/100電子天平 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；UMV-2多管漩渦混合器 北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；TDZ5-WS臺式低速離心機(jī)、H1650-W高速離心機(jī)湖南湘儀儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 田間試驗(yàn)

于2017年進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計參照NY/T 788—2004《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[29]進(jìn)行，分為最終殘留試驗(yàn)和消解動態(tài)試驗(yàn)2 個部分。試驗(yàn)均設(shè)空白對照區(qū)、高劑量試驗(yàn)區(qū)、低劑量試驗(yàn)區(qū)、消解動態(tài)試驗(yàn)區(qū)。采樣方法、樣品制備、貯存等按照《農(nóng)藥登記殘留田間試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》[30]執(zhí)行。

1.3.2 消解動態(tài)試驗(yàn)

消解動態(tài)試驗(yàn)僅在山東和四川兩地進(jìn)行。動態(tài)試驗(yàn)小區(qū)面積50 m2，另設(shè)清水噴霧對照區(qū)，各處理間設(shè)保護(hù)隔離區(qū)。于蔥苗長至20 cm高時開始施藥，施藥劑量為375 g/hm2（以有效成分計，下同），兌水噴霧蔥全株，每畝用水量約30～50 L，分別于施藥后1 h和1、3、7、14、21、28、35 d采用隨機(jī)的方法在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)采集樣品。小區(qū)邊行和每行距離兩端0.5 m內(nèi)不采樣。

1.3.3 最終殘留試驗(yàn)

設(shè)兩個施藥劑量：低劑量（250 g/hm2）和高劑量（375 g/hm2）。各設(shè)2 次施藥和3 次施藥兩個處理，每個處理設(shè)3 次重復(fù)，每小區(qū)15 m2。按照試驗(yàn)設(shè)計時間開始第1次施藥，施藥間隔期為7 d。采樣時間為距離最后一次施藥間隔5、7、10、14 d。另設(shè)清水空白對照，各處理間設(shè)保護(hù)帶。

1.3.4 樣品采集、制備與保存方法

采用隨機(jī)的方法在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)10 個以上的采樣點(diǎn)采集不少于1.0 kg的大蔥或小蔥樣品，裝入樣本容器中包扎妥當(dāng)，帶回實(shí)驗(yàn)室及時處理。樣品用不銹鋼刀切成1 cm左右的碎塊，在不銹鋼盆里充分混勻，四分法分取150～200 g樣品兩份，分別裝入封口樣品容器中，貼上標(biāo)簽后于冰柜內(nèi)－20 ℃低溫保存，待用。

1.3.5 氟啶胺含量的分析

1.3.5.1 樣品的前處理

提取：稱取樣品10 g（準(zhǔn)確至0.01 g）置于50 mL聚四氟乙烯試管中，加入20 mL乙腈溶液，漩渦振蕩提取3 min，再加入3.0 g氯化鈉，漩渦振蕩1 min，4 000 r/min離心5 min，待凈化。

凈化：將1.5 mL提取液轉(zhuǎn)入2 mL分散凈化管中，漩渦振蕩1 min，離心1 min，上清液過0.22 μm濾膜后，轉(zhuǎn)入預(yù)切口進(jìn)樣小瓶待分析。

1.3.5.2 檢測條件

液相色譜條件：Acquity UPLC BEH C18不銹鋼柱，柱溫35 ℃，樣品室溫度15 ℃，進(jìn)樣量3.0 μL。流動相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈，流速0.3 μL/min。流動相梯度洗脫程序：0～3 min，流動相A由90%線性變化至10%；3～4 min，流動相A保持10%；4～5 min，流動相A由10%線性變化至90%。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子電離，毛細(xì)管電壓3.20 kV，離子源溫度150 ℃，去溶劑溫度400 ℃；去溶劑氣和錐孔氣均為高純液氮，去溶劑氣流速為700 L/h，錐孔氣流速為50 L/h；碰撞氣為高純氬氣；采用多反應(yīng)離子對監(jiān)測模式，以定量離子對、定性離子對和保留時間進(jìn)行定性，以峰形好、干擾小、響應(yīng)高的定量離子對進(jìn)行定量。氟啶胺的定量離子對、定性離子對、錐孔電壓、碰撞電壓、保留時間見表1。

表 1 檢測氟啶胺的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 UPLC-MS-MS conditions for fluazinam

1.3.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和添加回收率測定

取200 μL 1 000 mg/L氟啶胺母液，用乙腈定容到20 mL，配制成質(zhì)量濃度為5.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用系列稀釋法配制質(zhì)量濃度為0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列。

取空白大蔥或小蔥樣品，按照1.3.5.1節(jié)方法進(jìn)行試驗(yàn)，凈化后的樣品為大蔥或小蔥基質(zhì)。用凈化后的大蔥或小蔥基質(zhì)稀釋氟啶胺母液，配制成質(zhì)量濃度為5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為母液，用系列稀釋法配制質(zhì)量濃度為0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的大蔥或小蔥基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

添加回收率測定：稱取空白大蔥和小蔥樣品，添加一定量的氟啶胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，設(shè)定0.01、0.05、0.5 mg/kg 3 個添加量，每個添加量設(shè)置5 個重復(fù)，另設(shè)空白對照樣品（不添加氟啶胺）。

1.3.5.4 定量分析

本研究中檢測限（limit of detection，LOD）按照3 倍信噪比計算。

采用外標(biāo)法定量，即用氟啶胺標(biāo)準(zhǔn)品（加入一定量的基質(zhì)）配成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以氟啶胺標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝ax＋b，其中y為定量離子對的色譜峰面積，x為氟啶胺標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，a為直線斜率，b為直線截距。本試驗(yàn)中采集的大蔥或小蔥樣品的氟啶胺殘留量按式（1）計算。

式中：C表示氟啶胺殘留量/（mg/kg）；V為提取溶液體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)（matrix effects，ME）按式（2）計算。

式中：B表示基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；A表示溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)|ME|＜10%時，基質(zhì)效應(yīng)可以忽略，用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線定量即可；當(dāng)10%＜|ME|＜50%時，有基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)或減弱現(xiàn)象，用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量可適當(dāng)消除基質(zhì)效應(yīng)對定量結(jié)果的影響；當(dāng)|ME|＞50%時，基質(zhì)效應(yīng)對定量的干擾較大，應(yīng)優(yōu)化樣品預(yù)處理方法使|ME|＜50%。

農(nóng)藥的消解趨勢用一級反應(yīng)動力學(xué)方程（式（3））計算。

式中：Ct表示時間t時的農(nóng)藥殘留量/（mg/kg）；Co表示施藥后作物上的原始沉積量/（mg/kg）；k表示消解系數(shù)；t表示施藥后時間/d。

半衰期（t1/2）表示農(nóng)藥殘留量消解一半所需要的時間，按式（4）計算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)效應(yīng)

表 2 氟啶胺在不同基質(zhì)中的線性方程、相關(guān)系數(shù)、ME和LODTable 2 Calibration equations, correlation coefficients, ME and LOD for fluazinam in different substrates

如表2所示，氟啶胺在0.002～0.5 mg/L范圍內(nèi)能均呈現(xiàn)出很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999。氟啶胺在大蔥和小蔥基質(zhì)中的ME分別為2.5%和6.2%，均小于10%，說明基質(zhì)效應(yīng)可以忽略，用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線定量即可。

2.2 定量分析方法的準(zhǔn)確度、靈敏度和精密度

表 3 氟啶胺在大蔥和小蔥中的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations of fluazinam spiked into green Chinese onion and shallot

氟啶胺在大蔥和小蔥中的添加量分別為0.01、0.05、0.5 mg/kg時，回收率數(shù)據(jù)如表3所示。結(jié)果表明，氟啶胺在大蔥中的回收率為81.4%～107.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%～4.6%；氟啶胺在小蔥中的回收率為99.0%～111.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～3.1%，滿足農(nóng)藥殘留分析的要求。

2.3 氟啶胺在大蔥和小蔥上的消解動態(tài)分析結(jié)果

圖 1 氟啶胺在大蔥（A）和小蔥（B）上的消解曲線Fig. 1 Degradation curves of fluazinam in green Chinese onion (A) and shallot (B)

如圖1所示，氟啶胺在山東大蔥上的原始沉積量為1.313 mg/kg，其消解規(guī)律符合一級動力學(xué)模型，消解方程為C＝2.286 8e－0.593t，相關(guān)系數(shù)r＝0.956 6，7 d消解率約為96.1%，半衰期t1/2＝1.2 d。氟啶胺在四川小蔥上的原始沉積量為3.265 mg/kg，其消解規(guī)律符合一級動力學(xué)模型，消解方程為C＝3.587 3e－0.08t，相關(guān)系數(shù)r＝0.977 9，35 d消解率約為94.4%，半衰期t1/2＝8.7 d。

氟啶胺39.5%懸浮劑噴霧在大蔥和小蔥上原始沉積量和降解半衰期差異明顯，大蔥上的原始沉積量遠(yuǎn)小于小蔥，且在大蔥上降解比在小蔥快，這主要與大蔥和小蔥地上部分生物量不同有關(guān)[31-32]。

2.4 氟啶胺在大蔥和小蔥中的最終殘留量分析結(jié)果

于北京、山東、內(nèi)蒙古試驗(yàn)點(diǎn)共采集144 個大蔥樣品，江蘇、四川、浙江試驗(yàn)點(diǎn)共采集144 個小蔥樣品（不包括空白樣品），氟啶胺在大蔥和小蔥上的最終殘留情況見表4。

表 4 氟啶胺在大蔥和小蔥上的最終殘留量Table 4 Final residues of fluazinam in Chinese green onion and shallot

北京、山東和內(nèi)蒙古的所有大蔥樣品氟啶胺最終殘留量為＜0.010～0.400 mg/kg，采收間隔期5、7、10、14 d時，其最高殘留量分別為0.308、0.400、0.118、0.045 mg/kg，殘留量中值分別為0.139、0.068、0.012、0.015 mg/kg。江蘇、四川和寧夏的所有小蔥樣品氟啶胺最終殘留量為0.100～5.738 mg/kg，采收間隔期5、7、10、14 d時，其最高殘留量分別為5.738、5.018、3.334、4.909 mg/kg，殘留量中值分別為3.347、2.006、1.502、1.030 mg/kg。

本試驗(yàn)中，氟啶胺在大蔥上使用后的殘留量遠(yuǎn)低于小蔥，與氟啶胺在大蔥和小蔥上的消解趨勢基本吻合。大蔥的植株個體大、生長快、生物稀釋作用強(qiáng)。等量的氟啶胺噴霧到大蔥上后，其在大蔥上的原始沉積量低于小蔥，多次施藥后，其最終殘留量比小蔥低。理論上，隨著施藥次數(shù)增多、施藥量增加、采收間隔期縮短，大蔥和小蔥上氟啶胺的殘留濃度會逐漸增加[33]。但是在蔥的種植過程中，因?yàn)槭[的品種、植株大小、種植地的氣候條件、土壤質(zhì)地、有機(jī)質(zhì)含量、微生物群落等差異，導(dǎo)致不同試驗(yàn)地點(diǎn)的樣品中氟啶胺的殘留量不同，且其殘留量的增減規(guī)律與理論值有一定差距，符合農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際情況[34-35]。

歐盟、日本、韓國規(guī)定氟啶胺在蔥上的最大殘留限量分別為0.01、0.1、3.0 mg/kg，中國、國際食品法典委員會、美國、加拿大和澳大利亞均未規(guī)定氟啶胺在蔥上的食品安全限量標(biāo)準(zhǔn)。參照韓國的限量標(biāo)準(zhǔn)，采收間隔為14 d時，氟啶胺在大蔥上的殘留量是安全的，江蘇和四川收獲的小蔥樣品中氟啶胺的殘留量是安全的，但是寧夏的小蔥樣品中氟啶胺的殘留量高于3.0 mg/kg，食用不安全。參照歐盟的限量標(biāo)準(zhǔn)，我國大蔥和小蔥上氟啶胺的殘留都不安全。參照日本的限量標(biāo)準(zhǔn)，大部分大蔥和小蔥樣品中氟啶胺的殘留都不安全。大蔥和小蔥是我國傳統(tǒng)的調(diào)味品蔬菜，在日常烹飪中經(jīng)常會用到，但是它們作為膳食的攝入量并不大，完全依據(jù)國外的限量標(biāo)準(zhǔn)評判氟啶胺在大蔥和小蔥上的殘留安全性可能并不合適[36]，我國應(yīng)加快制定氟啶胺在大蔥和小蔥上的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，保障食品安全。

3 結(jié) 論

本研究建立了氟啶胺在大蔥和小蔥上的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，方法的靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度符合農(nóng)藥殘留分析的要求。開展了氟啶胺39.5%懸浮劑在大蔥和小蔥上的消解動態(tài)和最終殘留試驗(yàn)，結(jié)果表明，氟啶胺在大蔥和小蔥上的消解速度很快，降解半衰期分別為1.2 d和8.7 d。低劑量（250 g/hm2）和高劑量（375 g/hm2）施藥2～3 次，施藥間隔7 d，采收間隔期5、7、10、14 d時，收獲的大蔥中氟啶胺的殘留量為＜0.010～0.308 mg/kg，小蔥中氟啶胺的殘留量為0.100～5.738 mg/kg。我國未制定氟啶胺在大蔥和小蔥上的食品安全限量標(biāo)準(zhǔn)，歐盟、日本、韓國規(guī)定氟啶胺在蔥上的限量標(biāo)準(zhǔn)分別為0.01、0.1、3.0 mg/kg。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，參照國外的限量標(biāo)準(zhǔn)評判氟啶胺在大蔥和小蔥上的殘留安全性過于嚴(yán)格，我國應(yīng)加快制定氟啶胺在大蔥和小蔥上的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。