唐慶強(qiáng)，曹曉鋼，夏林兵，陳錦麗，張鳳珍，羅順玉，王丹紅*

（1.三明海關(guān)，福建 三明 365000；2.拉薩海關(guān)，西藏 拉薩 850001；3.杭州海關(guān)，浙江 杭州 310016；4.福州海關(guān)，福建 福州 350001）

香菇具有高蛋白、低脂肪以及食藥兼用的特點(diǎn)，被聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織推薦為健康食品，經(jīng)常食用能夠增強(qiáng)人體免疫力，此外香菇還具有防癌抗癌、降低血壓和膽固醇的作用[1]。為滿足消費(fèi)需求并且降低成本，人工栽培香菇的原料已從單純椴木、木屑等轉(zhuǎn)向棉籽殼、玉米芯、秸桿、麥麩等農(nóng)林副產(chǎn)品，同時(shí)會(huì)加入一定量的石灰、石膏、過(guò)磷酸鈣等添加劑[2]，甚至?xí)褂玫焦I(yè)廢料（如廢紙漿、煙草莖稈、酒糟等），這些原料由于來(lái)源不同，砷的含量也明顯不同。香菇的生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)吸收和富集培養(yǎng)料中的重金屬[3]，從而導(dǎo)致砷元素從培養(yǎng)料中向香菇子實(shí)體中遷移。砷的化合物形態(tài)主要包括有機(jī)砷和無(wú)機(jī)砷兩大類，無(wú)機(jī)砷包括亞砷酸鹽（As(III)）和砷酸鹽（As(V)），有機(jī)砷包括一甲基砷酸鹽（monomethylated arsenic，MMA）、二甲基砷酸鹽（dimethylated arsenic，DMA）、砷甜菜堿（arsenobetaine，AsB）、砷膽堿和砷糖等[4-5]。不同形態(tài)的砷毒性差異明顯，砷糖、AsB等有機(jī)砷幾乎沒(méi)有毒性，而無(wú)機(jī)砷的毒性卻很高。國(guó)際癌癥研究中心已將無(wú)機(jī)砷及其化合物確認(rèn)為I級(jí)致癌物質(zhì)，并將MMA和DMA列為潛在的致癌物質(zhì)[6]。近年來(lái)關(guān)于香菇中檢出砷等重金屬元素的報(bào)道[7-12]不斷增加，對(duì)于砷的形態(tài)分析[13-28]也不斷增多，但對(duì)香菇中無(wú)機(jī)砷的吸收富集規(guī)律方面報(bào)道較少，更缺乏對(duì)香菇培養(yǎng)料中無(wú)機(jī)砷臨界值的研究。

本實(shí)驗(yàn)在兩個(gè)生長(zhǎng)年份中向香菇培養(yǎng)料中添加不同含量的As(III)和As(V)標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用高效液相色譜聯(lián)用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography coupled with inductivity coupled plasma mass spectrometry，HPLC-ICP-MS）[29]檢測(cè)香菇及其培養(yǎng)料中5 種形態(tài)砷含量，并研究香菇對(duì)培養(yǎng)料中As(III)和As(V)的吸收富集規(guī)律和臨界值，以期為香菇生產(chǎn)質(zhì)量安全控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

As(III)、As(V)標(biāo)準(zhǔn)溶液（（999±5）μg/mL）美國(guó)Inorganic Ventures公司；MMA（C）、DMA（C2H7AsO2）、AsB（C5H11AsO2） 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或優(yōu)級(jí)純；實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》中規(guī)定的一級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備

Altus A-10型HPLC儀、NexION 300D型ICP-MS儀美國(guó)PerkinElmer公司；3-18K高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；VERSASTAR型酸度計(jì) 美國(guó)Thermo Scientific公司；MS3D S25型漩渦振蕩儀 德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 香菇栽培條件及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

室內(nèi)溫度25～26 ℃，室外為自然氣溫，采用高棚層架袋栽培方式。

初步實(shí)驗(yàn)：第一年度進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)。將As(III)、As(V)標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋至合適濃度后，在培養(yǎng)基拌料時(shí)加入香菇培養(yǎng)料中并充分拌勻。設(shè)置0、0.3、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/kg 7 個(gè)添加量范圍較大的實(shí)驗(yàn)組，每組各投入24 kg培養(yǎng)料，分裝成12 個(gè)菌袋，7 組共84 個(gè)菌袋。

精密實(shí)驗(yàn)：在初步實(shí)驗(yàn)獲得結(jié)果中，As(III)和As(V)的臨界值在0.35 mg/kg附近。在此基礎(chǔ)上，于第二年度在臨界值附近進(jìn)行精密實(shí)驗(yàn)，使用與初步實(shí)驗(yàn)相同的標(biāo)準(zhǔn)溶液添加方式，設(shè)置0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38 mg/kg 6 個(gè)As(III)和As(V)添加量實(shí)驗(yàn)組，每組各投入24 kg培養(yǎng)料，分裝成12 個(gè)菌袋，6 組共72 個(gè)菌袋。

1.3.2 5 種形態(tài)砷和總砷含量的測(cè)定

如南宋．梁楷《李白行吟圖》畫唐朝大詩(shī)人李白，未畫任何背景，也不講究人體比例，只在表現(xiàn)人物精神上下功夫，寥寥幾筆，便意溢神足，使李白灑脫飄逸的形象躍然紙上。

取部分接種栽培后第2、60、99天的培養(yǎng)料樣品、初步實(shí)驗(yàn)和精密實(shí)驗(yàn)第一潮出菇時(shí)的香菇子實(shí)體。采用GB 5009.11—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》[30]中方法測(cè)定香菇及培養(yǎng)料中總砷含量，用本課題組前期建立的HPLC-ICP-MS方法[29]測(cè)定香菇及培養(yǎng)料中5 種形態(tài)砷的含量，并觀察記錄不同添加量下各菌袋香菇的產(chǎn)量。稱取4.0 g香菇子實(shí)體或香菇培養(yǎng)料，加入38 mL純水，漩渦混勻后在70 ℃水浴中超聲提取40 min，加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%乙酸溶液沉淀蛋白，于冰箱中4 ℃靜置10 min，于4 ℃高速離心機(jī)中以18 000 r/min離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm水系濾膜后上機(jī)測(cè)定。色譜柱：Dionex IonPac AS19（250 mm×4.0 mm，3.5 μm）陰離子交換柱；Dionex IonPac AS19（50 mm×4.0 mm，3.5 μm）陰離子保護(hù)柱；流動(dòng)相：A相為10 mmol/L乙酸鈉、3 mmol/L硝酸鉀、2 mmol/L磷酸二氫鈉、0.2 mmol/L乙二胺四乙酸鐵鈉，用氨水調(diào)節(jié)至pH 10.7；B相為無(wú)水乙醇；等度洗脫，A相體積分?jǐn)?shù)99%；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：50 μL；ICP-MS功率：1 350 W；以高純氬氣為載氣；泵速20 r/min；駐留時(shí)間：1 000 ms；采集質(zhì)荷比m/z75；采集模式：標(biāo)準(zhǔn)模式。

1.3.3 富集系數(shù)及減產(chǎn)率的計(jì)算

以各添加量下香菇與培養(yǎng)料中As(III)或As(V)含量之比計(jì)算富集系數(shù)。以各添加量下香菇子實(shí)體的產(chǎn)量與未添加As(III)和As(V)時(shí)產(chǎn)量之比計(jì)算香菇的減產(chǎn)率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Empower 3軟件處理檢測(cè)結(jié)果和數(shù)據(jù)，用Excel軟件處理遷移規(guī)律數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇及培養(yǎng)料中5 種形態(tài)砷的HPLC-ICP-MS圖譜分析

圖 1 5 種形態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC-ICP-MS圖Fig. 1 HPLC-ICP-MS chromatogram of five arsenic standards

圖 2 培養(yǎng)料樣品（A）和鮮香菇樣品（B）的HPLC-ICP-MS圖Fig. 2 HPLC-ICP-MS chromatograms of As species in culture medium (A) and fresh Lentinus edodes fruit bodies (B)

如圖1、2所示，AsB、DMA、As(III)、MMA和As(V) 5 種形態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液得到良好分離，表明該方法能夠應(yīng)用于培養(yǎng)料和鮮香菇中。

2.2 香菇對(duì)培養(yǎng)料中As(III)和As(V)的富集規(guī)律

2.2.1 初步實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

表 1 香菇對(duì)培養(yǎng)料中As(III)和As(V)的富集規(guī)律（初步實(shí)驗(yàn)）Table 1 Absorption and accumulation of As(III) and As(V) from culture medium in Lentinus edodes (in the first year)

從表1可知，在沒(méi)有添加任何外源性砷的培養(yǎng)料和香菇子實(shí)體中檢出了As(III)和As(V)，這表明培養(yǎng)料本身就含有部分的砷元素。隨著外源砷元素添加量的增加，培養(yǎng)料和香菇子實(shí)體中的As(III)和As(V)含量也隨之升高，但添加量達(dá)到5 mg/kg以上時(shí)，所有的菌袋均無(wú)法正常生長(zhǎng)出香菇，這表明在香菇生長(zhǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)料中外源添加的砷元素會(huì)不斷向香菇子實(shí)體中遷移，而且隨著外源砷元素添加量的增加，其對(duì)香菇的生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用。各添加量下As(III)和As(V)的富集系數(shù)范圍分別為0.36～0.84和0.82～7.53，香菇子實(shí)體中的As(III)含量均小于培養(yǎng)料中的含量，這表明香菇子實(shí)體對(duì)培養(yǎng)料中的砷元素雖有一定的吸附能力，但不是很強(qiáng)，這與徐麗紅等[31]的研究結(jié)果相似。

在初步實(shí)驗(yàn)設(shè)定的添加量下，As(III)和As(V)從培養(yǎng)料向香菇子實(shí)體中遷移的規(guī)律可以用以下方程表示，As(III)：y＝－0.365 2x2＋0.761 1x＋0.04，R2＝0.975 9；As(V)：y＝－0.823 9x2＋2.553 8x－0.069 9，R2＝0.971 3（x、y分別為培養(yǎng)料和香菇子實(shí)體中的As(III)或As(V)含量）（圖3）。

由于現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)香菇中As(III)、As(V)或無(wú)機(jī)砷的限量做出規(guī)定，只有GB 2762—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》[32]規(guī)定食用菌中總砷含量不得高于0.5 mg/kg。從表1可知，當(dāng)As(III)和As(V)的添加量為0.3 mg/kg時(shí)，香菇子實(shí)體中的總砷含量為0.427 mg/kg，與GB 2762—2017限量要求十分接近，據(jù)此可以估算出培養(yǎng)料中As(III)和As(V)的臨界添加量在0.35 mg/kg附近。

圖 3 香菇對(duì)培養(yǎng)料中As(III)（A）和As(V)（B）的遷移規(guī)律（初步實(shí)驗(yàn)）Fig. 3 Absorption and accumulation of As(III) (A) and As(V) (B) from culture medium in Lentinus edodes (in the first year)

2.2.2 精密實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

表 2 香菇對(duì)培養(yǎng)料中As(III)和As(V)的富集規(guī)律（精密實(shí)驗(yàn)）Table 2 Absorption and accumulation of As(III) and As(V) from culture medium in Lentinus edodes (in the second year)

根據(jù)初步實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果，為獲得更準(zhǔn)確的遷移規(guī)律臨界值，于第二年度開(kāi)展精密實(shí)驗(yàn)。從表2可以看出，所有培養(yǎng)料均生長(zhǎng)出了香菇子實(shí)體，各添加量下As(III)和As(V)的富集系數(shù)范圍分別為0.57～0.63和1.11～1.18，香菇中As(III)和As(V)含量之和占總砷的比例為92.41%～96.47%，表明香菇中的總砷絕大多數(shù)來(lái)源于添加的As(III)和As(V)，可進(jìn)一步研究培養(yǎng)料中As(III)和As(V)向香菇遷移的臨界值。由表2可知，當(dāng)培養(yǎng)料中As(III)和As(V)的添加量達(dá)0.33 mg/kg時(shí)，香菇子實(shí)體中總砷的含量為0.497 mg/kg，與限量要求的0.5 mg/kg極為接近，因此，可認(rèn)為0.33 mg/kg為培養(yǎng)料中添加As(III)和As(V)的臨界值。

在精密實(shí)驗(yàn)的添加量范圍下，As(III)和As(V)從培養(yǎng)料向香菇子實(shí)體中遷移的規(guī)律可以用以下方程表示，As(III)：y＝－1.138 9x2＋0.921 6x－0.004，R2＝0.973 4；As(V)：y＝－9.024 3x2－4.388 1x＋0.838 7，R2＝0.971 6（x、y分別為培養(yǎng)料和香菇子實(shí)體中As(III)或As(V)含量）（圖4）。

圖 4 香菇對(duì)培養(yǎng)料中As(III)（A）和As(V)（B）的遷移規(guī)律（精密實(shí)驗(yàn)）Fig. 4 Absorption and accumulation of As(III) (A) and As(V) (B) from culture medium in Lentinus edodes (in the second year)

2.3 培養(yǎng)料中As(III)和As(V)含量隨時(shí)間變化情況及對(duì)香菇產(chǎn)量的影響

從初步實(shí)驗(yàn)中可以看出，培養(yǎng)料中外源添加的砷元素會(huì)不斷向香菇子實(shí)體中遷移，對(duì)香菇的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，從而降低香菇產(chǎn)量，甚至使其出現(xiàn)絕收的情況。從表1、2中可以看出，香菇子實(shí)體對(duì)培養(yǎng)料中As(III)和As(V)中的富集系數(shù)并不高，特別是對(duì)于As(III)，香菇子實(shí)體中的含量均小于添加量和培養(yǎng)料中含量。為進(jìn)一步研究培養(yǎng)料在不同生產(chǎn)階段As(III)和As(V)含量的變化，取初期（接種后2 d）、菌絲瘤結(jié)期（接種后60 d）、轉(zhuǎn)色期（接種后99 d）3 個(gè)階段的培養(yǎng)料，分析其中As(III)、As(V)含量的變化。

表 3 不同時(shí)期培養(yǎng)料中As(III)和As(V)含量及香菇減產(chǎn)率Table 3 Contents of As(III) and As(V) in culture medium at different cultivation times and reduction in mushroom yield

從表3中可以看出，隨著栽培時(shí)間的延長(zhǎng)，各添加量培養(yǎng)料中As(III)的含量持續(xù)下降，在第60天的菌絲瘤結(jié)期時(shí)已經(jīng)下降到第2天時(shí)的一半以下，到第99天時(shí)更是下降到了2%左右。結(jié)合培養(yǎng)料中As(III)向香菇子實(shí)體中富集系數(shù)不高的情況來(lái)看，減少的As(III)并沒(méi)有完全轉(zhuǎn)移到香菇子實(shí)體中去，可能是轉(zhuǎn)化成了其他形態(tài)的砷，或是受香菇生長(zhǎng)環(huán)境的影響而發(fā)生了降解，各添加量培養(yǎng)料中As(V)的含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)整體增長(zhǎng)的趨勢(shì)，結(jié)合香菇子實(shí)體對(duì)培養(yǎng)料中As(V)的富集情況來(lái)看，培養(yǎng)料中的As(V)有向香菇中遷移的趨勢(shì)，但遷移程度不高；因此，培養(yǎng)料中增加的As(V)可能來(lái)自于轉(zhuǎn)化后的As(III)。

栽培2～60 d各添加量下As(III)和As(V)總量整體下降，但到90 d時(shí)整體穩(wěn)定并略有上升，這表明在2～60 d時(shí)As(III)和As(V)整體上是向菌絲中遷移的，而到60 d后，菌絲富集達(dá)到飽和，As(III)繼續(xù)向As(V)轉(zhuǎn)換，但二者總量保持穩(wěn)定。

添加As(III)和As(V)后的菌袋與未添加的菌袋相比均出現(xiàn)了不同程度的減產(chǎn)，減產(chǎn)率隨著添加量的增加而增加。從生長(zhǎng)情況來(lái)看，正常的香菇菌袋中的菌絲于40 d左右布滿全袋，60 d菌絲開(kāi)始出現(xiàn)瘤結(jié)并部分開(kāi)始轉(zhuǎn)色，到90 d左右轉(zhuǎn)色完成，120 d左右菌絲瘤結(jié)完畢進(jìn)入出菇階段；而添加了As(III)和As(V)標(biāo)準(zhǔn)溶液的菌袋在各個(gè)階段均出現(xiàn)了不同程度的生長(zhǎng)緩慢和生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，走絲、轉(zhuǎn)色、瘤結(jié)的時(shí)間比正常生長(zhǎng)的菌袋平均推遲3～10 d；而且當(dāng)添加的As(III)和As(V)含量大于5 mg/kg時(shí)，香菇的生長(zhǎng)被完全抑制，出現(xiàn)部分菌絲直接枯死、轉(zhuǎn)色不完全和無(wú)法瘤結(jié)等情況，菌袋已無(wú)法生長(zhǎng)出香菇。說(shuō)明培養(yǎng)料中添加As(III)和As(V)會(huì)對(duì)菌絲的生長(zhǎng)起到抑制作用，添加量越高影響程度越大，這可能與砷元素?fù)p傷了菌絲中的某些結(jié)構(gòu)、破壞了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，從而抑制了菌絲對(duì)生長(zhǎng)必需元素的吸收有關(guān)。

2.4 香菇中有機(jī)砷含量與As(III)和As(V)添加量的關(guān)系

表 4 As(III)和As(V)添加量對(duì)香菇中有機(jī)砷含量的影響Table 4 Contents of organic arsenic species in Lentinus edodes cultured with different amounts of As(III) and As(V) added

從表4可知，除MMA一直未檢出外，香菇子實(shí)體中的DMA和AsB兩種有機(jī)砷含量隨著培養(yǎng)料中添加的As(III)和As(V)總量的增長(zhǎng)而逐漸升高，均高于未添加As(III)和As(V)培養(yǎng)料中生長(zhǎng)出的香菇。由于本實(shí)驗(yàn)僅在培養(yǎng)料中添加了As(III)和As(V)這兩種無(wú)機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液，因此可認(rèn)為香菇子實(shí)體中增加的DMA和AsB主要來(lái)源于添加的無(wú)機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液，這可能是因?yàn)橄愎皆谏L(zhǎng)過(guò)程中將部分As(III)和As(V)轉(zhuǎn)化為有機(jī)砷。

3 結(jié) 論

通過(guò)向香菇培養(yǎng)料中添加不同含量的As(III)和As(V)標(biāo)準(zhǔn)溶液，研究香菇子實(shí)體對(duì)培養(yǎng)料中高毒無(wú)機(jī)砷的遷移規(guī)律。結(jié)果表明，香菇子實(shí)體對(duì)添加0.3～10 mg/kg As(III)和As(V)培養(yǎng)料中As(III)和As(V)的富集系數(shù)范圍分別為0.36～0.84和0.82～7.53；添加0.33～0.38 mg/kg As(III)和As(V)培養(yǎng)料中As(III)和As(V)遷移規(guī)律方程分別為y＝－1.138 9x2＋0.921 6x－0.004和y＝－9.024 3x2－4.388 1x＋0.838 7（x、y分別為培養(yǎng)料和香菇子實(shí)體中的As(III)或As(V)含量/（mg/kg））。根據(jù)GB 2762—2017對(duì)香菇子實(shí)體中總砷限量不超過(guò)0.5 mg/kg的要求，培養(yǎng)料中添加As(III)和As(V)的臨界值為0.33 mg/kg。培養(yǎng)料中As(III)和As(V)含量的增加會(huì)導(dǎo)致香菇子實(shí)體的減產(chǎn)甚至絕收。培養(yǎng)料中的As(III)含量隨著栽培時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，As(V)含量略有增加，而As(III)和As(V)的總量則保持相對(duì)穩(wěn)定。香菇子實(shí)體中的AsB、DMA等有機(jī)砷含量隨著As(III)和As(V)添加量的增加而升高，這可能和As(III)在香菇生長(zhǎng)時(shí)轉(zhuǎn)化為As(V)或有機(jī)砷有關(guān)。