魏洪波 石 拓 崔 毅 張權(quán)威 杜麗紅 陳啟欣 謝希賢，2，3 陳 寧，2，3，4*

（1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 天津300457 2 代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室 天津300457 3 中國輕工業(yè)微生物工程重點實驗室 天津300457 4 天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心 天津300457）

L-纈氨酸作為必需氨基酸之一，在醫(yī)藥、食品添加等方面用途十分廣泛。從飼料添加劑、食品添加劑等到多肽類藥物纈氨酸霉素的合成和復(fù)合氨基酸的配制，L-纈氨酸的需求越來越大，工業(yè)應(yīng)用對L-纈氨酸產(chǎn)品質(zhì)量的要求越來越高。實時監(jiān)控L-纈氨酸發(fā)酵過程，保證發(fā)酵的順利進(jìn)行就顯得尤為重要。L-纈氨酸發(fā)酵過程中，pH、溫度、溶氧和攪拌轉(zhuǎn)速等因素都會對細(xì)胞代謝產(chǎn)生影響[1-4]，而菌體細(xì)胞的代謝變化也會影響發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率和利用率。對于細(xì)胞內(nèi)部微觀代謝流變化的計算方法主要為代謝流分析（Metabolic flux analysis）。代謝流分析是一種通過建立細(xì)胞內(nèi)部代謝物合成與消耗的代謝模型，計算細(xì)胞內(nèi)部代謝流量分布的技術(shù)[5-7]。利用代謝流分析技術(shù)能更好地了解細(xì)胞代謝情況，及時對發(fā)酵條件作出調(diào)整，提高發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率和利用率。

導(dǎo)致代謝流分析無法快速實時應(yīng)用到發(fā)酵過程監(jiān)控的主要原因在于對發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物組分的檢測方法較為復(fù)雜。發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物的傳統(tǒng)檢測方法主要包括：氨基酸分析儀檢測、液相色譜分析與氣相色譜分析以及生物信息傳感器等。這些方法不僅對樣品的要求較高（很多需要衍生處理，樣品處理不達(dá)標(biāo)往往無法準(zhǔn)確測出樣品參數(shù)，同時對儀器造成一定損傷），而且對于樣品的分析時間長，無法滿足對發(fā)酵過程中組分的實時定量，因而無法快速地帶入代謝流模型中進(jìn)行代謝流分析計算，從而不能夠及時對發(fā)酵條件作出調(diào)整，影響發(fā)酵效果，增加發(fā)酵失敗的幾率[8-10]。近紅外光譜分析系統(tǒng)可以結(jié)合多元校正模型，實現(xiàn)對多組分的同時測定，而且分析時對發(fā)酵樣品無損傷，能夠?qū)崿F(xiàn)快速、準(zhǔn)確、安全的檢測。

發(fā)酵過程傳統(tǒng)的控制方法，主要是根據(jù)發(fā)酵過程控制器參數(shù)的變化來調(diào)整發(fā)酵控制的條件。這種方法缺乏對細(xì)胞內(nèi)部狀態(tài)的分析監(jiān)測，同時由于控制器或電極等硬件出現(xiàn)不靈敏或損壞等問題，導(dǎo)致發(fā)酵過程控制不及時、不正確等問題，無法實時準(zhǔn)確地監(jiān)測發(fā)酵過程。利用近紅外光譜結(jié)合代謝流模型可以快速、準(zhǔn)確地分析L-纈氨酸發(fā)酵過程代謝流分布，不僅彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測方法對于代謝物濃度檢測的不足，還可以實現(xiàn)對多組分快速準(zhǔn)確的同時測定，快速分析發(fā)酵過程中細(xì)胞內(nèi)部的代謝流分布，從而實時準(zhǔn)確監(jiān)控整個發(fā)酵過程，為L-纈氨酸發(fā)酵過程自動化控制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

Antaris II 近紅外分析儀，ThermoFisher Scientific 公 司；TQ Analyst 光譜分析軟件，ThermoFisher Scientific 公司；OPUS 7.0 近紅外分析軟件，德國Bruker 儀器公司；高效液相色譜，日本島津公司（SHIMADZU，LC-20AT）。

1.2 菌種

L-纈氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌 （C.glutamicum）XV，由天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院代謝工程實驗室選育并保藏。中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏編號CGMCC No.1.15672。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 斜面培養(yǎng)基 葡萄糖5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂25 g/L，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，pH 7.0～7.2。

1.3.2 種子培養(yǎng)基 玉米漿10 mL/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖30 g/L，豆粕水解液10 mL/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，VH0.1 mg/L，L-Met 0.6 g/L，L-leu 0.2 g/L，L-Ile 0.2 g/L，味精10 g/L。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 玉米漿30 mL/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖80 g/L，豆粕水解液20 mL/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，F(xiàn)eSO4·H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，VH10 mg/L，L-Met 0.5 g/L，L-leu 0.2 g/L，L-Ile 0.2 g/L，味精10 g/L。

1.4 發(fā)酵條件

1.4.1 種子培養(yǎng)條件 將活化好的纈氨酸生產(chǎn)菌在超凈臺中劃取一定量到種子液體培養(yǎng)基中，液體總量為1 500 mL，平均置于5 個三角瓶中，用12 層紗布封口，培養(yǎng)溫度32 ℃，培養(yǎng)時間14 h。

1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)條件 發(fā)酵培養(yǎng)采用30 L 發(fā)酵罐進(jìn)行，將1 500 mL 種子培養(yǎng)基接入罐中，發(fā)酵溫度維持在32 ℃，發(fā)酵周期38～42 h。在整個發(fā)酵過程中控制pH 值在7.0 上、下波動。做兩批發(fā)酵試驗，發(fā)酵條件均相同。當(dāng)菌體到達(dá)產(chǎn)酸期時，分別將溶氧控制在20%和10%，以保證樣品的多樣性和代表性。

1.5 L-纈氨酸發(fā)酵過程各組分濃度近紅外模型的建立[11]

1.5.1 近紅外模型建立步驟 L-纈氨酸發(fā)酵過程各組分濃度近紅外模型建立步驟：1） 建模所需樣品的選擇 選擇一個能夠平均分布且能代表整個總體的樣本集合；2） 原始近紅外光譜的獲得 將發(fā)酵液樣品放入近紅外掃描儀掃描獲得原始近紅外光譜；3） 原始光譜預(yù)處理 利用近紅外分析軟件選擇合適的光譜預(yù)處理條件對原始近紅外光譜進(jìn)行處理，以減少噪聲等因素的影響；4）近紅外模型的建立 利用偏最小二乘的方法建立近紅外模型；5） 對建立的模型進(jìn)行驗證。

1.5.2 近紅外模型的建立 利用近紅外掃描儀在波數(shù)范圍4 000·10 000 cm-1處采集發(fā)酵液近紅外光譜。采集時將發(fā)酵液倒入2 mm 的石英比色皿中，放入近紅外掃描儀中掃描。通常情況下每次掃描樣品前需進(jìn)行背景采集。將采集的光譜利用近紅外軟件分析，并與樣品的化學(xué)值一一對應(yīng)，用近紅外軟件優(yōu)化后建立近紅外模型。

1.6 L-纈氨酸代謝流分析模型的建立[12-14]

根據(jù)發(fā)酵液中測定的氨基酸和有機(jī)酸，建立L-纈氨酸發(fā)酵過程的代謝網(wǎng)絡(luò)模型。建立原則：1）忽略穩(wěn)定期的細(xì)胞濃度變化；2） NADPH 供需平衡，即消耗的NADPH 與產(chǎn)生的NADPH 相等；3）由于存在大量“無效”循環(huán)，因此不考慮ATP 總量的平衡；4） 無分支點的中間反應(yīng)及按照固定比例進(jìn)行的反應(yīng)可簡化為一個反應(yīng)方程。

2 結(jié)果與討論

近紅外光譜結(jié)合代謝流分析快速檢測L-纈氨酸發(fā)酵過程的代謝流分布方法的原理如圖1所示。為了更好地監(jiān)控L-纈氨酸發(fā)酵過程，從L-纈氨酸生產(chǎn)菌發(fā)酵過程出發(fā)，利用近紅外光譜結(jié)合代謝流分析技術(shù)，建立一種快速分析L-纈氨酸發(fā)酵過程細(xì)胞內(nèi)部代謝狀態(tài)的方法。該方法只需通過對L-纈氨酸發(fā)酵液進(jìn)行近紅外掃描，帶入建立好的近紅外及代謝流模型，通過分析計算快速、準(zhǔn)確地反映細(xì)胞代謝狀態(tài)，根據(jù)細(xì)胞代謝狀態(tài)快速控制及調(diào)整發(fā)酵條件，達(dá)到實時監(jiān)控L-纈氨酸發(fā)酵過程的目的。

圖1 近紅外光譜結(jié)合代謝流分析實時監(jiān)測L-纈氨酸發(fā)酵過程原理Fig.1 The principle of NIR combined with metabolic flux model to monitoring the L-valine fermentation process in real time

2.1 L-纈氨酸原始近紅外光譜

圖2為L-纈氨酸發(fā)酵過程中發(fā)酵液樣品的原始近紅外光譜圖。從整個樣品集的峰型來看，樣品峰型比較集中。由于在5 000～6 500 cm-1波數(shù)范圍光譜峰型較規(guī)則，因此首選此波長范圍建立校正模型。

2.2 L-纈氨酸發(fā)酵液中各組分濃度近紅外模型

2.2.1 樣品的劃分 在發(fā)酵過程共收集180 個發(fā)酵液樣品，其中校正集144 個，檢驗集36 個。兩者濃度范圍、平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差如表1所示。從濃度范圍看，模型校正集與外部檢驗集的濃度范圍在模型建立要求范圍。從平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差的數(shù)值來看，模型校正集和外部檢驗集的數(shù)值差別較小，說明樣品間的差異較小，有利于建立模型。

圖2 L-纈氨酸發(fā)酵樣品的近紅外光譜Fig.2 NIR spectra of samples of L-valine fermentation

表1 發(fā)酵液中主要產(chǎn)物濃度參數(shù)Table 1 Parameters of main products concentration in the fermentation broth samples

2.2.2 L-纈氨酸發(fā)酵液各組分濃度校正模型 利用近紅外軟件自動優(yōu)化的功能，對發(fā)酵液樣品原始近紅外光譜進(jìn)行自動優(yōu)化，結(jié)果見表2。優(yōu)化的波數(shù)范圍為5 000～6 550 cm-1。在此波數(shù)范圍比較幾種光譜預(yù)處理方法的優(yōu)劣。其決定因素主要為RMSECV 值，通常選擇RMSECV 值最小的光譜預(yù)處理方法作為最優(yōu)方法，同時兼顧RPD 及決定系數(shù)（R2）的影響。

表2 L-纈氨酸發(fā)酵近紅外模型自動優(yōu)化后5 000～6 550 cm-1 范圍不同光譜預(yù)處理方法結(jié)果比較Table 2 Comparison of different spectral pretreatment methods after automatic optimization in L-valine concentration model at 5 000-6 550 cm-1

從表2參數(shù)可以看出，在波數(shù)5 000～6 550 cm-1范圍，比較幾種預(yù)處理方法的優(yōu)劣，根據(jù)近紅外軟件優(yōu)化結(jié)果，得出L-纈氨酸、葡萄糖、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-異亮氨酸和乳酸的近紅外濃度最優(yōu)模型。其中各物質(zhì)決定系數(shù)R2均大于0.9，說明模型具有較好的準(zhǔn)確性。

L-纈氨酸發(fā)酵過程主要產(chǎn)物濃度模型RMSECV 與維數(shù)關(guān)系如圖3所示。維數(shù)主要影響模型的擬合度，維數(shù)過少使模型的擬合度降低，而維數(shù)過多則易出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象?？梢钥闯觯髂Ｐ途S數(shù)均在7～9 之間，此時RMSECV 值均為最小或接近最小。

圖3 L-纈氨酸發(fā)酵主要產(chǎn)物濃度模型RMSECV 與維數(shù)關(guān)系Fig.3 RMSECV versus the numbers of latent variables in the model of main products concentration in L-valine fermentation

對上述建立的各組分模型進(jìn)行交叉檢驗，如圖4所示，反映發(fā)酵樣品中校正集各組分濃度的實際值和預(yù)測值關(guān)系；圖5所示檢驗集各組分濃度的實際值和預(yù)測值關(guān)系。

圖4 校正集中L-纈氨酸發(fā)酵主要產(chǎn)物濃度實際值與預(yù)測值的關(guān)系Fig.4 Predicted values versus experimental values based on the calibration set and of main products concentration in L-valine fermentation

圖5 檢驗正集中L-纈氨酸發(fā)酵主要產(chǎn)物濃度實際值與預(yù)測值的關(guān)系Fig.5 Predicted values versus experimental values based on the validation set and of main products concentration in L-valine fermentation

從圖4和圖5可以看出，各模型校正集與檢驗集中產(chǎn)物濃度實際值與預(yù)測值線性關(guān)系較好，樣品均勻分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線的兩側(cè)，異常樣品或誤差較大樣品已被剔除。結(jié)合表2各物質(zhì)濃度模型參數(shù)，表明所建各產(chǎn)物濃度模型均具有良好的預(yù)測能力。

2.3 L-纈氨酸合成途徑的代謝流分析

2.3.1 構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)模型 根據(jù)L-纈氨酸合成途徑中各步酶促反應(yīng)的化學(xué)計量平衡式和各代謝節(jié)點處的化合物平衡關(guān)系[15-17]，建立L-纈氨酸生物合成的簡化代謝網(wǎng)絡(luò)圖6。

通過對L-纈氨酸發(fā)酵代謝網(wǎng)絡(luò)簡圖及反應(yīng)速率方程組的分析，只要得到4 種代謝物的反應(yīng)速率，就可將其化學(xué)值帶入反應(yīng)速率方程組中求解。通過計算得出每個代謝物的代謝流量。通過上述建立的近紅外校正模型，可快速、準(zhǔn)確測定表3中4 種代謝物的濃度，通過計算得到各物質(zhì)的反應(yīng)速率。

2.3.2 L-纈氨酸合成的代謝流量計算 通過上述分析可知，只要得到4 種代謝物的反應(yīng)速率，就可得出通過每個代謝物的代謝流量。兩批平行發(fā)酵試驗，前期菌體生長時發(fā)酵條件控制一致，在24～34 h 菌體產(chǎn)酸期，將發(fā)酵過程的溶氧分別控制在10%和20%。通過采集不同溶氧條件下的發(fā)酵液，并掃描得到對應(yīng)近紅外光譜，代入上述近紅外校正模型，即可快速、準(zhǔn)確的測定其中4 種代謝產(chǎn)物的濃度。利用上述方法測定不同時間4 種代謝產(chǎn)物濃度，即可計算出表3中不同溶氧條件下4 種代謝產(chǎn)物積累或消耗速率。

表3 發(fā)酵中、后期代謝產(chǎn)物變化速率及代謝流量Table 3 Variation rate and metabolic flux of metabolites during the middle and late period

L-纈氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸期的代謝流分布利用MATLAB 軟件線性規(guī)劃并計算得到，結(jié)果見圖7。圖中數(shù)值為20%溶氧條件下通過各代謝節(jié)點的代謝流量，其中“（·）”中的數(shù)值為10%溶氧條件下通過各代謝節(jié)點的代謝流量。

圖6 L-纈氨酸生物合成代謝網(wǎng)絡(luò)簡圖Fig.6 Stoichiometric model of L-valine biosynthesis

圖7所示，在發(fā)酵條件溶氧控制為20%時，L-纈氨酸發(fā)酵代謝流第1 步反應(yīng)的代謝流量為100，說明此時葡萄糖的消耗較快，而代謝產(chǎn)物乳酸的代謝流量值6.49，其合成的速率比較慢。此時代謝流量主要集中在TCA 循環(huán)，菌體獲得大量的能量來維持自身細(xì)胞生長；當(dāng)溶氧條件控制在10%時，相比于溶氧20%的條件下，雖然葡萄糖的消耗速率沒有明顯的變化，但是通過乳酸的代謝流量為8.83，明顯高于20%溶氧條件下的6.49，說明此時乳酸積累速率加快，菌體維持自身生長代謝所需能量通過無氧呼吸來提供。發(fā)酵過程中為了避免乳酸的大量積累，此時應(yīng)采取提高溶氧的發(fā)酵控制措施。綜上，采用近紅外光譜分析結(jié)合代謝流分析，能夠及時獲取胞內(nèi)代謝流分布的數(shù)據(jù)，快速、準(zhǔn)確地了解發(fā)酵過程菌體內(nèi)部的代謝狀態(tài)，從而實時監(jiān)測發(fā)酵動態(tài)，及時調(diào)整發(fā)酵條件，確保發(fā)酵過程的順利進(jìn)行。

圖7 發(fā)酵產(chǎn)酸期L-纈氨酸合成的代謝流分布Fig.7 The flux distribution of L-valine biosynthesis during acid producing period

3 結(jié)論

利用近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合偏最小二乘（PLS）的方法構(gòu)建了L-纈氨酸發(fā)酵過程中幾種主要代謝原料及代謝產(chǎn)物物濃度預(yù)測模型。通過對原始近紅外光譜的分析預(yù)處理，以及對模型的優(yōu)化，結(jié)果表明所建模型預(yù)測能力良好。結(jié)合代謝流模型對不同發(fā)酵條件下L-纈氨酸合成的代謝途徑進(jìn)行分析，計算出不同溶氧條件下的代謝流分布?？梢钥焖俚玫讲⒎治龀鯨-纈氨酸發(fā)酵過程中通過EMP、HMP 和TCA 等重要節(jié)點或產(chǎn)物的代謝流量，并及時調(diào)整發(fā)酵條件。綜上，通過近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合代謝流模型能夠快速地對L-纈氨酸發(fā)酵過程中的代謝流分布作出準(zhǔn)確分析，及時檢測到細(xì)胞內(nèi)部的微觀代謝流量變化。本方法能夠較好地預(yù)測和監(jiān)控發(fā)酵過程。