柳 萌 劉瑞玲 郜海燕* 吳偉杰 孫 健 吳曉蒙 周劍忠 李 斌

（1 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310021 2 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 南寧530007 3 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083 4 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 南京210014 5 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 沈陽(yáng)110866）

藍(lán)莓（Vaccinium corymbosum），杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium.spp.），富含花色苷、維生素C 等營(yíng)養(yǎng)成分[1]，具有良好的保健作用。藍(lán)莓在貯藏期間極易受到病原真菌的侵染，使得藍(lán)莓行業(yè)發(fā)展受到嚴(yán)重限制，它的主要致病菌為灰霉菌[2-5]?；颐咕˙otrytis cinerea）是一種空氣傳播的植物病原菌[6]，在入侵宿主表面時(shí)分泌，減小表面疏水性，分解蠟質(zhì)層的蛋白（主要為角質(zhì)酶、絲氨酸酯酶、脂肪酶和其它非特異性酯酶[7]等胞外酶）及代謝物，為其它致病因子提供入口[8]，最終引起果實(shí)腐爛。近10年關(guān)于灰霉菌胞外酶與發(fā)病機(jī)理的相關(guān)性研究主要集中于果膠酶及細(xì)胞壁降解酶。

脂肪酶（三酰甘油?；饷?，EC 3.1.1.3）在自然界中主要催化三酰甘油酯的水解，可在非水相條件下催化酯化、酯交換、醇解和酸解等反應(yīng)[9]。擬南芥中的酯酶基因AtCXE8 在真菌感染后高度表達(dá)[10]。在一些谷物、果蔬貯藏期間使用脂肪酶抑制劑，其發(fā)病率顯著降低，貯藏期得到延長(zhǎng)，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)禾谷鐮刀菌的脂肪酶基因FGL1 被抑制后毒力顯著降低[11]。這些結(jié)果均表明脂肪酶在植物-病原菌相互作用過(guò)程中的重要性?；颐咕陌庵久赋蔀椴珊蟊ｕr技術(shù)的可能關(guān)鍵控制點(diǎn)。

本文針對(duì)藍(lán)莓采后病原菌灰霉分泌的胞外脂肪酶，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件提高其產(chǎn)率，并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究，為灰霉菌胞外酶的后續(xù)研究，藍(lán)莓采前病害防治及采后品質(zhì)保護(hù)提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：實(shí)驗(yàn)室保藏菌株，從自然發(fā)病的"燦爛"藍(lán)莓中分離獲得。

PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g、葡萄糖10 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 000 mL?；A(chǔ)培養(yǎng)基：KH2PO4200 g、MgSO45 g、KCl 5 g、蒸餾水1 000 mL。發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖30 g/L，氯化鉀0.5 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，硝酸鈉2 g/L，Mg-SO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L。

棕櫚酸對(duì)硝基苯酯及阿拉伯膠，阿拉丁；磷酸氫二鈉、碳酸鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 設(shè)備與儀器

水浴鍋；臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Thermo 公司；超凈工作臺(tái)，蘇靜集團(tuán)安泰有限公司；恒溫?fù)u床，上海智能分析儀器制造有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，松下健康醫(yī)療器械株氏會(huì)社；Cintra404 紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)，澳大利亞GBC 科技儀器公司。

1.3 酶活力測(cè)定

采用橄欖油乳化法[12]及棕櫚酸-對(duì)硝基苯酯法測(cè)定[13]。

1.4 發(fā)酵條件的確定

1.4.1 發(fā)酵時(shí)間的確定 灰霉菌在PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d 后，用打孔器在菌落邊緣打下直徑約1 cm 的菌餅，接種到液體培養(yǎng)基中，在25 ℃下160 r/min 震蕩培養(yǎng)[14]。分別培養(yǎng)48，60，72，84，96，108 h，研究不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)灰霉菌產(chǎn)脂肪酶的影響。

1.4.2 發(fā)酵溫度的確定 以液體培養(yǎng)基為基質(zhì)，分別置于20，25，30，35，40 ℃的搖床中，以160 r/min 振蕩培養(yǎng)96 h，研究不同發(fā)酵溫度對(duì)灰霉菌產(chǎn)脂肪酶的影響。

1.5 培養(yǎng)基的確定

1.5.1 碳源種類對(duì)灰霉菌產(chǎn)脂肪酶的影響 添加1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）牛肉膏作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的氮源，分別以蔗糖、乳糖、無(wú)水葡萄糖、無(wú)水碳酸鈉及橄欖油作為碳源，培養(yǎng)5 d 后置于發(fā)酵培養(yǎng)基中，按確定的最佳發(fā)酵溫度及時(shí)間培養(yǎng)，測(cè)定酶活力來(lái)確定最佳碳源[15]。以接種灰霉菌菌餅的發(fā)酵液為試驗(yàn)組，不接種菌餅的為對(duì)照組。

1.5.2 氮源種類對(duì)灰霉菌產(chǎn)脂肪酶的影響 添加1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）橄欖油作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源，分別以牛肉膏、硫酸銨、蛋白胨、酵母粉及尿素作為氮源，發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定酶活力來(lái)確定最佳氮源。

1.5.3 初始pH 對(duì)灰霉菌產(chǎn)脂肪酶的影響 分別添加1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）牛肉膏和1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）橄欖油作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的氮源和碳源，將初始培養(yǎng)基的pH 設(shè)定為5.0，6.0，7.0，8.0，9.05 個(gè)梯度，發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定酶活力，確定最佳初始pH。

1.6 粗酶酶學(xué)性質(zhì)研究

灰霉菌經(jīng)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)及液體培養(yǎng)基發(fā)酵得到發(fā)酵液。將發(fā)酵液在4 ℃，10 000 r/min 離心10 min，得到上清液。在冰浴條件下，取10 mL 上清液加入飽和度為85%的硫酸銨。4 ℃下靜置過(guò)夜后以10 000 r/min 的速度離心30 min，棄上清液，沉淀用10 mL 20 mmol/L PB 緩沖溶液（pH 7.0）溶解。將上述溶解在PB 緩沖溶液中的粗酶液轉(zhuǎn)移到透析袋中，期間更換2～3 次緩沖溶液，透析24 h，所得液體即灰霉菌脂肪酶粗酶液，用于后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)研究。

1.6.1 酶反應(yīng)最適pH 及酸堿耐受性 在50 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH4.0～8.0）和50 mmol/L 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH9.0～10.0）中測(cè)定不同反應(yīng)pH 下的酶活力，最高酶活力設(shè)為100%。在不同pH 緩沖液中，28 ℃水浴處理1 h，測(cè)定殘余酶活力，確定pH 穩(wěn)定性，設(shè)定pH7.0 時(shí)的殘余酶活力為100%[16]。

1.6.2 酶作用最適溫度及熱穩(wěn)定性 取1 mL 粗酶液，調(diào)節(jié)pH 至酶反應(yīng)最適pH，分別于25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80 ℃中 反 應(yīng)10 min，測(cè)定酶活力，以確定該酶的最適反應(yīng)溫度。取粗酶液分別置于40，50，60，70，80 ℃的水浴環(huán)境中，期間每隔10 min 測(cè)定酶活力，持續(xù)1 h，以確定該酶的熱穩(wěn)定性。以最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，每組重復(fù)3 次。

1.6.3 有機(jī)溶劑耐受性能 取1 mL 粗酶液，分別加入甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、異丙醇、丙酮、二甲苯、三氯甲烷，將有機(jī)溶劑的體積分?jǐn)?shù)設(shè)置3 個(gè)水平，分別為10%，30%，50%，加入等量蒸餾水的粗酶液為對(duì)照組，28 ℃搖床處理1 h，測(cè)定殘余酶活力[17]。

1.6.4 金屬離子對(duì)脂肪酶粗酶活力的影響 取5 mL 粗酶液，分別加入終濃度為10 mmol/L 的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe3+。以加入等量蒸餾水的粗酶樣品為對(duì)照，28 ℃搖床處理1 h，測(cè)定殘余酶活力。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

所有指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果為3 次平行試驗(yàn)的平均值。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 23軟件進(jìn)行差異顯著性分析 （P<0.05，表示差異顯著），圖片繪制采用GraphPad Prism 5 處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰霉菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)灰霉菌產(chǎn)脂肪酶的影響 發(fā)酵時(shí)間對(duì)灰霉菌產(chǎn)胞外脂肪酶的影響如圖1所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的加長(zhǎng)，脂肪酶活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。培養(yǎng)至48 h 時(shí)，灰霉菌胞外脂肪酶活力較低，僅為0.25 IU/mL；當(dāng)培養(yǎng)至60 h 時(shí)，灰霉菌胞外脂肪酶活力較培養(yǎng)48 h 時(shí)顯著升高（P＜0.05）；培養(yǎng)72 h 和84 h 的脂肪酶活均顯著高于48 h 的，稍高于培養(yǎng)60 h 時(shí)的且無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；在培養(yǎng)至96 h 時(shí)，脂肪酶活達(dá)到培養(yǎng)期間最高值，顯著高于培養(yǎng)84 h（P<0.05）；然后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，脂肪酶活力下降，在108 h 時(shí)脂肪酶活未檢出。96 h 為產(chǎn)酶最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)灰霉菌產(chǎn)脂肪酶的影響 發(fā)酵溫度對(duì)灰霉菌產(chǎn)胞外脂肪酶的影響如圖2所示。隨著發(fā)酵溫度的增加，脂肪酶的酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵溫度為20 ℃時(shí)，胞外脂肪酶活為0.5 IU/mL；25 ℃時(shí)，脂肪酶活為0.67 IU/mL，顯著高于20 ℃培養(yǎng)時(shí)的酶活；隨著發(fā)酵溫度的增加，胞外酶活力持續(xù)增加，在35 ℃時(shí)酶活達(dá)到最高值，然而與25 ℃、30 ℃培養(yǎng)時(shí)均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；當(dāng)40℃培養(yǎng)時(shí)，灰霉菌胞外脂肪酶活較35 ℃培養(yǎng)時(shí)顯著下降，并顯著低于20 ℃培養(yǎng)時(shí)的脂肪酶活（P＜0.05）。25，30 ℃和35 ℃培養(yǎng)的脂肪酶活雖顯著高于20 ℃，但它們之間無(wú)顯著性差異?？紤]到25 ℃更適合灰霉菌生長(zhǎng)繁殖[18]，因此選擇25 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)灰霉菌產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of fermentation time on lipase production by Botrytis cinerea

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)灰霉菌產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on lipase production by Botrytis cinerea

2.1.3 碳源種類對(duì)灰霉菌產(chǎn)脂肪酶的影響 不同碳源對(duì)灰霉菌產(chǎn)胞外脂肪酶的影響如圖3所示。分別以橄欖油和蔗糖作碳源時(shí)，灰霉菌胞外脂肪酶活力較高，顯著高于以乳糖、無(wú)水葡萄糖、無(wú)水碳酸鈉作為碳源時(shí)的脂肪酶活（P＜0.05）。橄欖油作為碳源培養(yǎng)時(shí)脂肪酶活稍高于蔗糖，然而兩者間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；以乳糖和無(wú)水碳酸鈉分別作為碳源的酶活力相近，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；而以無(wú)水葡萄糖為碳源培養(yǎng)時(shí)，基本無(wú)酶活性?？紤]到橄欖油在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中既作為碳源又是脂肪酶的誘導(dǎo)物，不僅有利于菌體生長(zhǎng)，提高脂肪酶水解活力，還可使脂肪酶的合成活力顯著增加[19]。選擇橄欖油作為最佳產(chǎn)酶碳源。

2.1.4 氮源種類對(duì)灰霉菌產(chǎn)脂肪酶的影響 以牛肉膏、硫酸銨、蛋白胨、酵母粉和尿素分別作為氮源對(duì)灰霉菌進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果如圖4所示。以蛋白胨作為氮源培養(yǎng)灰霉菌時(shí)，脂肪酶活力最高，并顯著高于其余4 種氮源（P<0.05）；其次是以尿素作為氮源培養(yǎng)時(shí)的脂肪酶活；以牛肉膏和酵母粉作為氮源培養(yǎng)時(shí)，脂肪酶活較低，均顯著低于以蛋白胨和尿素作為氮源培養(yǎng)時(shí)的脂肪酶活 （P＜0.05），而以牛肉膏和酵母粉培養(yǎng)時(shí)，二者無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；以硫酸銨為氮源培養(yǎng)時(shí)酶活最低，基本無(wú)酶活性。最終選擇蛋白胨作為培養(yǎng)基最優(yōu)氮源。

2.1.5 培養(yǎng)基初始pH 對(duì)灰霉菌產(chǎn)脂肪酶的影響 在不同初始pH 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，脂肪酶活的變化情況如圖5所示。在pH 5.0～7.0 范圍，脂肪酶活隨著培養(yǎng)基中初始pH 值的增加而增加，pH 7.0 是最佳產(chǎn)酶酸堿度。當(dāng)培養(yǎng)基的pH 值逐漸趨于堿性時(shí)，脂肪酶活顯著下降（P＜0.05）。這些結(jié)果表明灰霉菌在中性及偏弱酸性的環(huán)境下有利于產(chǎn)酶。

圖3 不同碳源對(duì)灰霉菌產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of different carbon sourceson lipase production of Botrytis cinerea

圖4 不同氮源對(duì)灰霉菌產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of different nitrogen sourceson lipase production of Botrytis cinerea

圖5 不同培養(yǎng)基初始pH 對(duì)灰霉菌產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effects of different initial pH of media on lipase production of Botrytis cinerea

2.2 灰霉菌胞外脂肪酶的粗酶性質(zhì)

2.2.1 溫度對(duì)脂肪酶粗酶活力及穩(wěn)定性的影響在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下獲得脂肪酶粗酶液，在25～80 ℃范圍，每隔5 ℃測(cè)定同一酶液的酶活性，結(jié)果如圖6a 所示。脂肪酶粗酶的相對(duì)酶活力在25～40 ℃之間隨溫度的升高而增大，40 ℃時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著溫度的上升相對(duì)酶活力逐漸降低。溫度對(duì)脂肪酶粗酶穩(wěn)定性的影響如圖6b 所示?；颐咕a(chǎn)脂肪酶在40 ℃條件下處理60 min，相對(duì)酶活仍保持在50%以上，說(shuō)明脂肪酶在此溫度下穩(wěn)定性較好。70 ℃處理40 min，相對(duì)酶活也保持在50%以上，之后隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)酶活快速下降。80 ℃條件下處理30 min，相對(duì)酶活力下降到40%以下。以上結(jié)果表明脂肪酶在40～70℃之間具有較高的酶活性，灰霉菌所產(chǎn)脂肪酶屬于中度耐熱脂肪酶。

圖6 溫度對(duì)脂肪酶粗酶酶活（a）及穩(wěn)定性（b）的影響Fig.6 Effect of temperature on the activity （a） and stability （b）of crude lipase from Botrytis cinerea

2.2.2 pH 對(duì)脂肪酶粗酶活力及穩(wěn)定性的影響pH 對(duì)脂肪酶粗酶活力的影響如圖7a 所示。在pH4～10 的范圍，相對(duì)酶活力隨著pH 的增加而逐漸增大，pH 9.0 時(shí)相對(duì)酶活力最高，隨后逐漸降低。pH 對(duì)脂肪酶粗酶穩(wěn)定性的影響如圖7b 所示。脂肪酶粗酶在pH 5.0～10.0 范圍比較穩(wěn)定，當(dāng)pH值低于5.0 時(shí)，酶活性受到較大的影響，推斷灰霉菌的胞外脂肪酶可能為堿性酶。

圖7 pH 對(duì)脂肪酶粗酶酶活（a）及穩(wěn)定性（b）的影響Fig.7 Effect of pH on the activity （a） and stability （b） of crude lipase from Botrytis cinerea

2.2.3 灰霉菌脂肪酶粗酶的有機(jī)溶劑耐受性能灰霉菌胞外脂肪酶對(duì)不同有機(jī)溶劑的耐受能力如表1所示。極性強(qiáng)的有機(jī)溶劑容易奪取酶分子的結(jié)合水而降低酶的活性或使酶完全失活。異丙醇、甲醇、乙腈、乙醇和丙酮等極性強(qiáng)的有機(jī)溶劑，與空白組相比脂肪酶活降低。而在極性較弱的乙酸乙酯和二甲苯中脂肪酶處于激活狀態(tài)。有機(jī)溶劑的激活作用可從多方面解釋，比如誘導(dǎo)形成有利的蛋白質(zhì)構(gòu)象，增加α-螺旋的比例，促進(jìn)底物進(jìn)入活性中心，改變底物-水界面等[20-22]。值得注意的是，脂肪酶在三氯甲烷這一極性較弱的有機(jī)溶劑中被顯著抑制。在單一的有機(jī)溶劑中，隨著添加量的增加，脂肪酶粗酶的酶活逐漸降低，這可能是因?yàn)橛袡C(jī)溶劑添加量越高，游離酶越容易聚集，導(dǎo)致單一酶與底物接觸受阻而影響反應(yīng)速率。

表1 灰霉菌胞外脂肪酶對(duì)不同有機(jī)溶劑的耐受能力Table 1 Effect of organic solvents on the stability of crude lipase from Botrytis cinerea

2.2.4 金屬離子對(duì)脂肪酶粗酶活力的影響 不同金屬離子對(duì)脂肪酶粗酶酶活的影響不同。金屬離子對(duì)酶活性的發(fā)揮產(chǎn)生影響，它們可與酶活性中心的相關(guān)基團(tuán)作用，改變酶的構(gòu)象，從而影響酶的活性[23]。在Na+、K+、Cu2+等6 種金屬離子中，與空白組相比，Na+和Fe3+顯著激活脂肪酶活，這一特性與根霉Rhizopus ZM-10 所產(chǎn)脂肪酶相符[24]，而與黑曲霉Aspergillus niger F044 不符[25]。K+、Cu2+、Ca2+、Mg2+顯著抑制脂肪酶活。大量文獻(xiàn)報(bào)道，Cu2+和Ca2+能夠促進(jìn)脂肪酶活[26-28]，而在本試驗(yàn)中Cu2+和Ca2+抑制了灰霉菌的胞外脂肪酶活，這一特性與黑曲霉Aspergillus niger Li-38[29]和黃青霉Penicillium chrysogenum J23[30]所產(chǎn)的脂肪酶相符，可見(jiàn)同一金屬離子對(duì)不同來(lái)源的脂肪酶的影響不同。

圖8 金屬離子對(duì)脂肪酶粗酶酶活的影響Fig.8 Effects of metal ionson the activity of crude lipase from Botrytis cinerea

3 結(jié)論與討論

脂肪酶是藍(lán)莓采后病原菌灰霉（Botrytis cinerea）的致病因子之一。通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)其培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得出的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基為：橄欖油1%、蛋白胨1%，pH 7.0，發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度25 ℃、培養(yǎng)時(shí)間96 h。

本研究發(fā)現(xiàn)，在40 ℃、pH 9.0 的條件下，該灰霉菌胞外脂肪酶具有最佳的酶活力，這與米雁等[31]的研究結(jié)果相似，脂肪酶的最適反應(yīng)溫度范圍為38～45 ℃。此外，微生物脂肪酶屬于中性或堿性脂肪酶[32]。雷建平等[33]在對(duì)源于黑曲霉或假絲酵母的脂肪酶進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)它們的最適pH 范圍在8～9。本研究中來(lái)源于藍(lán)莓的灰霉菌胞外脂肪酶的最適pH 值為9，表明灰霉菌所產(chǎn)的脂肪酶為弱堿性脂肪酶[33]。對(duì)胞外脂肪酶的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，結(jié)果表明：該酶在溫度40～70 ℃，pH 5～10 的范圍較穩(wěn)定。這表明灰霉菌的胞外脂肪酶對(duì)溫度和pH 值具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，能在中、高溫和弱酸到強(qiáng)堿環(huán)境中保持穩(wěn)定。有機(jī)相中脂肪酶的催化反應(yīng)是非水相酶催化反應(yīng)的一個(gè)重要方面[34]。本研究中灰霉菌胞外脂肪酶在乙酸乙酯和二甲苯中處于激活狀態(tài)，而在異丙醇、甲醇、乙腈、乙醇、丙酮和三氯甲烷中處于被抑制狀態(tài)，其中在三氯甲烷中被抑制的效果最顯著。根據(jù)Log P 規(guī)則，有機(jī)溶劑的極性越低，酶在有機(jī)溶劑中的活性越強(qiáng)，然而三氯甲烷極性較弱卻顯著抑制酶活，這表明有機(jī)溶劑的Log P 值并非是影響酶在有機(jī)溶劑中發(fā)揮活性的唯一因素。從果實(shí)貯藏的應(yīng)用而言，可考慮采用乙醇對(duì)藍(lán)莓采后進(jìn)行保鮮處理，適當(dāng)提高乙醇濃度效果更佳。不同金屬離子對(duì)酶活力的影響不同，金屬離子可能是酶的組成部分，也有可能是酶的激活劑或抑制劑[35]，因此金屬離子的存在對(duì)胞外脂肪酶的穩(wěn)定性影響較大。不同真菌所產(chǎn)脂肪酶對(duì)金屬的耐受性不同，如Fe3+和Mg2+能促進(jìn)根霉的脂肪酶活而抑制曲霉的脂肪酶活[36]。對(duì)灰霉菌胞外脂肪酶的金屬耐受性進(jìn)行研究表明：Na+、Fe3+對(duì)粗酶活力具有激活作用，k+、Ca2+、Mg2+、Cu2+對(duì)其有輕微抑制作用。缺鈣、鎂元素的藍(lán)莓植株易感病[37]，可適當(dāng)通過(guò)肥料補(bǔ)充藍(lán)莓植株的鈣、鎂含量，提高其對(duì)灰霉病的抗病性。