吳春艷，任思宇，汪開(kāi)毓，蒲華靖

( 1.重慶三峽職業(yè)學(xué)院，重慶 萬(wàn)州 404155； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130； 3.重慶市開(kāi)州區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，重慶 開(kāi)州 405400 )

不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)是一類短棒狀的革蘭氏陰性短桿菌，屬奈瑟氏菌科，廣泛分布于自然環(huán)境中[1]。此前，該菌通常被認(rèn)為是一類低毒力的條件性致病菌，主要引起人類的皮膚組織感染與尿路感染；近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)它們具有多重藥物抗藥性和強(qiáng)烈的宿主抵抗力，常在醫(yī)院內(nèi)，尤其是在重癥監(jiān)護(hù)病房中導(dǎo)致獲得性肺炎、腦膜炎及敗血癥的發(fā)生，成為了醫(yī)療過(guò)程中難以解決的難題[2]。目前，在醫(yī)療領(lǐng)域不動(dòng)桿菌的研究集中在毒力因子與耐藥性機(jī)理上；在水生動(dòng)物中，人們重在關(guān)注該菌感染后的臨床癥狀與治療時(shí)的藥物選擇，如王世震等[3]進(jìn)行了短須裂腹魚(yú)(Schizothoraxwangchiachii)感染不動(dòng)桿菌后的診斷與防治研究，毛芝娟等[4]進(jìn)行了匙吻鱘(Polyodomspathula)不動(dòng)桿菌感染的耐藥性分析，陸文浩等[5]進(jìn)行了銀鯽(Carassiusauratusgibelio)不動(dòng)桿菌感染的分離鑒定與藥物敏感性分析，丁利等[6]進(jìn)行了烏龜(Mauremysnigricans)不動(dòng)桿菌感染的分離鑒定與藥敏分析。而對(duì)養(yǎng)殖的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)因不動(dòng)桿菌感染發(fā)病的案例卻鮮有報(bào)道。

近幾年，虹鱒已成為我國(guó)冷水魚(yú)養(yǎng)殖的重要種類，尤其在冷水資源豐富的西南地區(qū)，該魚(yú)的養(yǎng)殖發(fā)展迅速。在重慶，虹鱒的養(yǎng)殖集中在渝東北及渝東南片區(qū)，尤其以彭水、石柱及開(kāi)縣、城口的養(yǎng)殖最成規(guī)模，養(yǎng)殖模式為集約化的流水養(yǎng)殖。因該魚(yú)對(duì)水溫與水質(zhì)環(huán)境要求苛刻，養(yǎng)殖中疾病頻發(fā)，給從業(yè)者造成了嚴(yán)重的困擾[7]。筆者在進(jìn)行重慶地區(qū)名特優(yōu)魚(yú)類疾病調(diào)查的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，開(kāi)州區(qū)譚家鎮(zhèn)的泰旭農(nóng)業(yè)有限公司虹鱒養(yǎng)殖基地，于2016—2018年期間發(fā)生持續(xù)性的虹鱒死亡，臨床表現(xiàn)為，食欲下降，離群獨(dú)游，鰓有大量的黏液及附著物，鰭條蛀蝕脫落，尾鰭基部充血、出血，并伴有嚴(yán)重的腸道炎癥。筆者對(duì)此次發(fā)病進(jìn)行了病原的分離，并對(duì)病原菌進(jìn)行了生理生化鑒定，16S rRNA及rpoB基因的序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析，及耐藥性的觀察與組織病理?yè)p傷的研究，以助于探明病因及病程發(fā)展規(guī)律，為防治虹鱒不動(dòng)桿菌病積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

病魚(yú)取自重慶市開(kāi)州區(qū)譚家鎮(zhèn)泰旭農(nóng)業(yè)冷水魚(yú)養(yǎng)殖基地，體質(zhì)量為0.4～2.1 kg；健康魚(yú)購(gòu)自重慶市萬(wàn)州區(qū)漁灃生態(tài)漁業(yè)有限公司，體質(zhì)量為80～120 g。藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；綿羊血采自重慶三峽職業(yè)學(xué)院竹園農(nóng)場(chǎng)經(jīng)檢疫合格的健康綿羊；細(xì)菌生化微量鑒定管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 病原菌分離純化

無(wú)菌條件下，用接種環(huán)挑取發(fā)病虹鱒的肝、腎與潰爛處的組織，劃線接種于LB平板上，20 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，挑取單一的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，獲得純化菌株K180411。

1.3 回歸感染試驗(yàn)

選取暫養(yǎng)15 d后，健康無(wú)病癥的虹鱒進(jìn)行浸泡感染，試驗(yàn)分為正常組與處理組(處理組刮下魚(yú)體尾柄處的部分鱗片)。正常組100尾，共設(shè)4個(gè)小組(Z1、Z2、Z3與對(duì)照組)，除對(duì)照組不設(shè)平行外，每個(gè)小組為30尾，分成3個(gè)平行組。處理組與正常組的設(shè)置一致，編號(hào)為C1、C2、C3與對(duì)照組。處理組中C1、C2、C3試驗(yàn)組菌液密度依次為8×106、4×106、1×106cfu/mL，正常組中Z1、Z2、Z3試驗(yàn)組菌液密度與處理組一致，也依次為8×106、4×106、1×106cfu/mL，對(duì)照組均為曝氣后的自來(lái)水。養(yǎng)殖水體控制為溫度20 ℃，pH 7.0～7.5，溶解氧>5 mg/L。試驗(yàn)過(guò)程中禁止投喂飼料，觀察并記錄虹鱒的健康狀況，對(duì)發(fā)病及死亡個(gè)體進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.4 病原菌的生理生化特性鑒定和基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》與文獻(xiàn)[8]，對(duì)菌株K180411進(jìn)行生化鑒定。將菌株K180411接種于用綿羊血細(xì)胞制作的血平板上，觀察菌株的溶血特性。用LB液體培養(yǎng)基沖洗收集純化的菌株K180411，提交至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行PCR擴(kuò)增和16S rRNA與rpoB測(cè)定，序列結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，并采用MEGA 7.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建與分析。16S rRNA、rpoB基因的擴(kuò)增引物分別為5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′/3′-TACGGCTACCTTG TTACGAC-5′[9]、5′-CCTTCATGACCTGGAAYG GNTA-3′/3′-TCCAGGATCTGNCCNACRTTC AT-5[10]。

1.5 自然發(fā)病魚(yú)類臨床癥狀與病理?yè)p傷研究

取發(fā)病魚(yú)類鰓絲、潰瘍組織、及體表黏液附著物進(jìn)行壓片觀察，并采集自然發(fā)病虹鱒的肝、腸、脾與鰓等組織，固定于4%的中性福爾馬林溶液中，采用蘇木精—伊紅染色法進(jìn)行組織病理學(xué)研究。

1.6 藥敏試驗(yàn)

采用比濁法將菌株K180411制成密度為1.0×107cfu/mL的菌液，涂布接種于LB平板上，用滅菌后的鑷子將藥敏紙片粘貼于平板表面，20 ℃恒溫培養(yǎng)36 h，測(cè)量平板上的抑菌圈，判斷該細(xì)菌的藥物敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離與回歸感染

從自然發(fā)病虹鱒的肝、腎及體表潰爛處均分離到了一株優(yōu)勢(shì)菌株，編號(hào)為K180411。20 ℃培養(yǎng)24 h后，可見(jiàn)菌落在LB平板上形成直徑約為1 mm的半透明菌落；鏡下觀察，菌體呈雙球狀，革蘭氏染色陰性，細(xì)菌大小為(0.9～1.6) μm×(1.3～2.2) μm。

回歸感染中，C1處理組在第10 d開(kāi)始發(fā)病，C2、C3處理組分別在13、17 d表現(xiàn)出癥狀，對(duì)照組未出現(xiàn)變化，感染及死亡情況見(jiàn)表1。病檢結(jié)果顯示，回歸感染發(fā)病魚(yú)類癥狀與自然發(fā)病魚(yú)類一致。在回歸感染的虹鱒肝與體表潰爛處分離到與菌株K180411理化性質(zhì)一致的菌株，表明該菌對(duì)虹鱒具有致病性。Z3正常組在第9 d有1尾魚(yú)表現(xiàn)出癥狀，其余各組均未出現(xiàn)病變，可能是在試驗(yàn)魚(yú)轉(zhuǎn)運(yùn)、處理過(guò)程中因操作的原因?qū)е聯(lián)p傷而引起的。

2.2 病原菌生化特性鑒定系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株K180411接種于5%的脫纖維綿羊血平板，24 h后菌落周圍形成典型的β溶血環(huán)(圖1)。生化特性檢測(cè)顯示，菌株枸櫞酸鹽反應(yīng)陽(yáng)性，無(wú)法水解七葉苷，不能利用麥芽糖、葡萄糖、精氨酸，硝酸鹽還原反應(yīng)為陰性等。除溶血特性外，其余指標(biāo)與Laurent等[8]報(bào)道的的烏爾新不動(dòng)桿菌(A.ursingii)一致(表2)。

圖1 菌株K180411的溶血特性觀察

表1 K180411回歸感染試驗(yàn)結(jié)果

表2 K180411表型特征與已報(bào)道的烏爾新不動(dòng)桿菌的比較

16S rRNA與rpoB基因擴(kuò)增，分別得到1468 bp與921 bp的PCR產(chǎn)物(圖2)，將生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序的結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，用Mega 7.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。16S rRNA結(jié)果顯示，菌株K180411與新生兒重癥病房中分離的不動(dòng)桿菌屬未命名菌株NR116070同源關(guān)系最近，與已命名的烏爾新不動(dòng)桿菌MH113156親緣關(guān)系最近(圖3)。rpoB的結(jié)果顯示菌株K180411與烏爾新不動(dòng)桿菌KJ789099的親緣關(guān)系最近(圖4)。據(jù)此，綜合生化特性鑒定、16S rRNA及rpoB基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，鑒定此次發(fā)病病原菌為烏爾新不動(dòng)桿菌。

圖2 菌株K180411的16S rRNA與rpoB基因PCR擴(kuò)增a.16S RNA； b.ropB基因； M.Marker

圖3 菌株K180411的16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖4 菌株K180411的rpoB基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 自然發(fā)病虹鱒的病理學(xué)檢查與病理?yè)p傷研究

發(fā)病虹鱒精神沉郁，游動(dòng)遲緩，漂浮于水面。體表出現(xiàn)大量的褪色斑(圖5a)，胸鰭基部及尾鰭基部肌肉出血明顯，尾鰭腐爛嚴(yán)重，肉眼可見(jiàn)骨條(圖5b)；脾發(fā)黑腫大(圖5c)；腸道嚴(yán)重充血，腸壁組織炎癥明顯，呈半透明狀(圖5d)。顯微鏡下檢查自然發(fā)病魚(yú)類的鰓絲、黏液及潰瘍?cè)罱M織，未見(jiàn)寄生蟲(chóng)和真菌。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)鰓組織損傷明顯，鰓小片上皮細(xì)胞腫脹脫落，甚至出現(xiàn)鰓小片斷裂，暴露出鰓絲軟骨(圖5e)；腸腔中可見(jiàn)壞死脫落的腸道組織，黏膜層結(jié)構(gòu)大面積缺失，僅局部可見(jiàn)殘余的腸絨毛，黏膜下層水腫、裸露，組織間隙增寬，結(jié)締組織變性紅染呈均質(zhì)無(wú)結(jié)構(gòu)狀(圖5f)；肝細(xì)胞脂肪變性嚴(yán)重，局灶性壞死明顯(圖5g)；脾竇內(nèi)充滿紅細(xì)胞(圖5h)。

圖5 自然發(fā)病虹鱒病理學(xué)檢查與組織學(xué)研究a.病魚(yú)體表出現(xiàn)褪色斑(箭頭)；b.尾鰭蛀蝕，尾柄處糜爛(箭頭)，基部充血(星標(biāo))；c.脾發(fā)黑腫大(箭頭)；d.腸炎明顯，腸組織充血，變薄呈半透明狀(箭頭)；e.鰓小片上皮細(xì)胞腫脹脫落(箭頭)，組織間隙增寬(星標(biāo))；f.柱狀上皮細(xì)胞腫脹脫落(星標(biāo))，腸絨毛斷裂、黏膜下層裸露(箭頭)；g.肝細(xì)胞局灶性壞死(星標(biāo))；h.脾竇充血，脾組織水腫(箭頭).

2.4 藥敏試驗(yàn)

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明(表3)，烏爾新不動(dòng)桿菌K180411對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、左氧氟沙星、恩諾沙星及卡那霉素敏感，對(duì)磺胺異噁唑、鏈霉素、青霉素、阿莫西林、氨芐西林、氟苯尼考、多西環(huán)素耐藥。

表3 烏爾新不動(dòng)桿菌K180411藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

不動(dòng)桿菌是一大類的細(xì)菌種屬，被報(bào)道的已超過(guò)50種，且種間的生化特性差異巨大[11]，近幾年在水產(chǎn)上研究與報(bào)道的均為鮑曼不動(dòng)桿菌引起的疾病，而一些小眾的不動(dòng)桿菌感染卻未有報(bào)道。目前人們常使用Vitek 2 system、API與Phoenix等方法通過(guò)表型的差別以進(jìn)行不動(dòng)桿菌種間的鑒別，但效果大多不能令人滿意[12]，甚至出現(xiàn)不動(dòng)桿菌與產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)之間的混淆[1,13]，因此分子手段的鑒別至關(guān)重要。16S rRNA的比對(duì)分析是目前分類鑒定常用的依據(jù)之一， Chiu等[1,14]的研究證明，16S rRNA的比對(duì)分析在屬的層面上鑒定不動(dòng)桿菌具有可靠的正確率，但由于過(guò)于保守而無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確的種間鑒別[15]，因此rpoB、gyrB與recA基因常被用作種間的鑒別，尤其是rpoB基因，因其高度的可變性，被學(xué)界推薦為不動(dòng)桿菌種間鑒別最值得參考的基因[10,16-18]。本研究中，16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，菌株K180411與未命名的不動(dòng)桿菌NR116070的同緣關(guān)系最近。盡管菌株NR116070未被命名，但Alexandr Nemec等[19]認(rèn)為，菌株NR116070應(yīng)該被認(rèn)定為烏爾新不動(dòng)桿菌。rpoB基因的分析也表明，菌株K180411與已報(bào)道的烏爾新不動(dòng)桿菌在一個(gè)譜系。因此，綜合生化特性鑒定、16S rRNA及rpoB基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，鑒定此次發(fā)病病原菌為一株烏爾新不動(dòng)桿菌。根據(jù)資料顯示，本研究為國(guó)內(nèi)外首次對(duì)烏爾新不動(dòng)桿菌引起水產(chǎn)動(dòng)物感染發(fā)病的報(bào)道。另外，此次研究發(fā)現(xiàn)烏爾新不動(dòng)桿菌K180411與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的烏爾新不動(dòng)桿菌在溶血特性上有差別，說(shuō)明在烏爾新不動(dòng)桿菌種內(nèi)也存在著理化性質(zhì)的差異，這與Alexandr Nemec等[19]的研究結(jié)果一致。

研究表明，不動(dòng)桿菌是健康三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)與銀鯽腸道中常駐的優(yōu)勢(shì)菌群[20]，Omoloma等[21]也證實(shí)，在健康虹鱒腸道中不動(dòng)桿菌是常駐菌之一。這說(shuō)明當(dāng)水生動(dòng)物處于健康狀態(tài)時(shí)，大多數(shù)不動(dòng)桿菌不具致病性。其他領(lǐng)域的研究也發(fā)現(xiàn)，該菌的感染主要繼發(fā)于外傷、慢性疾病或免疫系統(tǒng)受損之后[22]。回歸試驗(yàn)的結(jié)果也表明，烏爾新不動(dòng)桿菌K180411可在魚(yú)體損傷之后引起發(fā)病，說(shuō)明對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物而言，體表?yè)p傷是該菌感染的一個(gè)重要途徑，這可能與不動(dòng)桿菌在外膜蛋白A等毒力因子的幫助下形成生物膜，增強(qiáng)了病菌的黏附力有關(guān)[23-25]。組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)病虹鱒腸道上皮組織大面積壞死脫落，鰓上皮組織嚴(yán)重?fù)p傷，并伴有肝組織彌漫性腫脹壞死，這與斑點(diǎn)叉尾(Ictaluruspunctatus)[26]感染不動(dòng)桿菌后肝臟受到嚴(yán)重?fù)p傷的結(jié)果相符。但遺憾的是，在已報(bào)道的不動(dòng)桿菌引起水產(chǎn)動(dòng)物疾病的資料中，均只進(jìn)行了臨床癥狀的描述，而未作組織病理學(xué)的研究[3-4,27]；因此，該病的發(fā)病機(jī)制與病理?yè)p傷過(guò)程尚需進(jìn)一步的探索。

近幾年，世界衛(wèi)生組織糾正了以前對(duì)不動(dòng)桿菌低毒力、低危害的認(rèn)知，而將其認(rèn)定為最危險(xiǎn)的致病菌之一[28]，因其具有復(fù)雜的耐藥機(jī)制，如青霉素結(jié)合蛋白、泵出系統(tǒng)、氨基糖苷類修飾酶系統(tǒng)及膜通透性改變等，使之對(duì)大多數(shù)抗生素具有天然的抗性[29]，且對(duì)很多敏感的藥物也能夠迅速的產(chǎn)生耐藥性[30]，導(dǎo)致治療非常困難。本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，恩諾沙星等藥品對(duì)烏爾新不動(dòng)桿菌K180411有效，但臨床治療期間，恩諾沙星的治療效果并不理想，這可能與其復(fù)雜的耐藥機(jī)制有關(guān)系。蔡香菊等[31]研究表明，黃芩、黃蓮與五倍子等中草藥及復(fù)方制劑對(duì)不動(dòng)桿菌有較好的殺菌作用，或許中草藥將會(huì)成為防治不動(dòng)桿菌疾病的重要途徑。