竇 勇，任虹燁，吳 琳，閆永芳，陳家宇，周文禮

( 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384 )

威氏海鏈藻(Thalassiosiraweissflogii)是一種典型的中心綱浮游硅藻，其細(xì)胞壁由無定型二氧化硅構(gòu)成，具有精致的納米分級結(jié)構(gòu)，而且細(xì)胞殼體多孔，比表面積大，光學(xué)和機(jī)械加工性能良好，在制備新型納米原料與器件(如微型傳感器、微過濾器、生物載體等)時(shí)具有獨(dú)特優(yōu)勢[1-3]，此外威氏海鏈藻還可以應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，作為魚蝦的開口餌料[4]，而且威氏海鏈藻生長速度快、易于培養(yǎng)、遺傳性狀穩(wěn)定，因此被看做一種非常有開發(fā)應(yīng)用前景的資源微藻。

本研究綜合考察了不同氮源與氮磷比條件下威氏海鏈藻的生長速率、葉綠素a含量以及PSⅡ光化學(xué)活性，探討了氮源和氮磷比對威氏海鏈藻生命活動(dòng)的影響作用，以期為威氏海鏈藻的集約化、規(guī)?；囵B(yǎng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種來源與培養(yǎng)條件

試驗(yàn)所用威氏海鏈藻由衛(wèi)星海洋動(dòng)力學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，采用f/2培養(yǎng)基，鹽度30，培養(yǎng)溫度22 ℃，光暗比12 h∶12 h，光照度3300 lx。培養(yǎng)期間每日定時(shí)搖瓶6次，防止微藻細(xì)胞附壁、下沉。選取處于對數(shù)生長期的威氏海鏈藻進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 氮源作用試驗(yàn)

以f/2培養(yǎng)基中的氮、磷濃度為基準(zhǔn)(總氮0.8824 mol/L，總磷0.0367 mol/L)，以NaH2PO4為磷源，分別以NaNO3、NaNO2、NH4Cl、(NH2)2CO作為外加氮源。按1∶1的接種比例將威氏海鏈藻(初始密度均為0.6×104個(gè)/mL)接種于250 mL三角瓶中，液體總量為150 mL。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行，試驗(yàn)重復(fù)3次。在試驗(yàn)的第2、4、6、8 d取樣分析。

1.2.2 氮磷比作用試驗(yàn)

以f/2培養(yǎng)基中的氮、磷濃度為基準(zhǔn)(總氮0.8824 mol/L，總磷0.0367 mol/L)，以NaNO3和NaH2PO4作為氮源和磷源，分別固定培養(yǎng)基中總氮和總磷濃度不變，設(shè)置氮磷比4∶1、8∶1、12∶1、16∶1和20∶1的試驗(yàn)組(表1)，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行。氮磷比分別通過添加NaNO3和NaH2PO4進(jìn)行調(diào)節(jié)。在試驗(yàn)的第2、4、6、8 d取樣分析。

表1 不同氮磷比條件下氮、磷初始濃度

1.3 分析指標(biāo)與測定方法

1.3.1 威氏海鏈藻細(xì)胞密度測定

使用XB-K-25型血球計(jì)數(shù)板(25×16 mm)在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)威氏海鏈藻細(xì)胞密度。

1.3.2 葉綠素a含量測定

吸取2 mL藻液置于離心管中，在4 ℃下以12 000 r/min離心5 min，用移液槍吸去上清液，加入80%丙酮對藻泥進(jìn)行再懸浮，然后用錫箔完全包裹離心管，在暗處置于55 ℃水浴中30 min，再于4 ℃下以12 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，并用80%丙酮定容至5 mL，使用UV-1240紫外—可見分光光度計(jì)測定663 nm吸光度(OD663)，然后根據(jù)下列公式計(jì)算葉綠素(chl-a)質(zhì)量濃度[12]：

1.3.3 PSⅡ光化學(xué)活性測定

使用德國Walz公司生產(chǎn)的IMAGING-PAM調(diào)制脈沖熒光儀測定PSⅡ光化學(xué)活性。向比色杯中依次加入3 mL蒸餾水和15 μL藻液，混勻，將樣品暗適應(yīng)15 min，讀取Fv/Fm和ETR數(shù)值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan方法進(jìn)行多重比較，顯著性水平α=0.05。處理組間沒有相同字母的表示差異顯著(P<0.05)，有相同字母的表示差異不顯著(P>0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源對威氏海鏈藻的影響

2.1.1 氮源對威氏海鏈藻細(xì)胞密度的影響

試驗(yàn)前4 d 威氏海鏈藻細(xì)胞密度變化緩慢，而且在試驗(yàn)大多數(shù)時(shí)間不同氮源對威氏海鏈藻細(xì)胞密度沒有顯著影響(P>0.05)，僅在第6 d以(NH2)2CO作為氮源的試驗(yàn)組細(xì)胞密度顯著高于NaNO3組(P<0.05)，此時(shí)(NH2)2CO組平均細(xì)胞密度為3.67×104個(gè)/mL，是細(xì)胞密度最低的NaNO3組的3.17倍(圖1)。

圖1 不同氮源對威氏海鏈藻細(xì)胞密度的影響

2.1.2 氮源對威氏海鏈藻葉綠素a質(zhì)量濃度的影響

試驗(yàn)初期不同氮源對威氏海鏈藻葉綠素a質(zhì)量濃度的影響并不顯著(P>0.05)，至第4 d時(shí)，(NH2)2CO組葉綠素a質(zhì)量濃度顯著高于NaNO3和NaNO2組(P<0.05)，第6 d，(NH2)2CO組微藻細(xì)胞葉綠素a質(zhì)量濃度顯著高于其他試驗(yàn)組(P<0.05)，此時(shí)(NH2)2CO組平均葉綠素a質(zhì)量濃度為279.25 mg/L，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)微藻葉綠素a質(zhì)量濃度呈現(xiàn)(NH2)2CO>NH4Cl>NaNO2>NaNO3的規(guī)律(圖2)。

圖2 不同氮源對威氏海鏈藻葉綠素a質(zhì)量濃度的影響

2.1.3 氮源對威氏海鏈藻PSⅡ光化學(xué)活性Fv/Fm的影響

試驗(yàn)早期威氏海鏈藻Fv/Fm并未受不同氮源的顯著影響(P>0.05)，至第4 d時(shí)，(NH2)2CO組微藻Fv/Fm達(dá)到0.58并顯著高于其他試驗(yàn)組(P<0.05)，至第6 d時(shí)，(NH2)2CO組Fv/Fm接近NaNO2組且均顯著高于NaNO3組(P<0.05)，至試驗(yàn)結(jié)束NaNO2組Fv/Fm達(dá)最高為0.60且顯著高于NaNO3組(P<0.05)(圖3)。

圖3 不同氮源對威氏海鏈藻 Fv/Fm的影響

2.1.4 氮源對威氏海鏈藻PSⅡ光化學(xué)活性ETR的影響

試驗(yàn)初期不同氮源對威氏海鏈藻ETR的影響不顯著(P>0.05)，至第4 d時(shí)，(NH2)2CO組微藻ETR達(dá)34.67且顯著高于其他試驗(yàn)組(P<0.05)，隨著試驗(yàn)進(jìn)行，NaNO3和NH4Cl組微藻ETR變化緩慢，至第6 d時(shí)，(NH2)2CO組微藻ETR最高為51.33且顯著高于NaNO3和NH4Cl組(P<0.05)，而試驗(yàn)結(jié)束時(shí)NaNO2組ETR最高為32.66且顯著高于NaNO3和NH4Cl組(P<0.05)(圖4)。

圖4 不同氮源對威氏海鏈藻ETR的影響

2.2 氮磷比對威氏海鏈藻的影響

2.2.1 氮磷比對威氏海鏈藻細(xì)胞密度的影響

在固定總氮不變的條件下，各試驗(yàn)組的威氏海鏈藻細(xì)胞密度隨培養(yǎng)時(shí)間延長呈不斷上升的趨勢(圖5a)。試驗(yàn)初期各處理組微藻細(xì)胞密度差異不大，但在第4 d氮磷比4∶1組細(xì)胞密度增幅最大為5.33×104個(gè)/mL，且顯著高于其他處理組(P<0.05)，此后氮磷比8∶1、12∶1、16∶1組的細(xì)胞密度增幅加快，至第6 d氮磷比4∶1組的細(xì)胞密度僅顯著高于氮磷比20∶1組(P<0.05)，至試驗(yàn)結(jié)束各處理組威氏海鏈藻細(xì)胞密度無顯著差異(P<0.05)。

在固定總磷不變的條件下，培養(yǎng)期間各試驗(yàn)組細(xì)胞密度變化幅度較小且維持在較低水平(1.50×104～1.83×104個(gè)/mL)，而且不同氮磷比對威氏海鏈藻的細(xì)胞密度均無顯著影響(P>0.05)(圖5b)。

試驗(yàn)期間固定總氮各組威氏海鏈藻細(xì)胞密度和變化幅度均顯著高于固定總磷各組，固定總氮各組的平均細(xì)胞密度是固定總磷各組的1.51倍。

2.2.2 氮磷比對威氏海鏈藻葉綠素a質(zhì)量濃度的影響

在固定總氮不變的條件下，各試驗(yàn)組的威氏海鏈藻葉綠素a質(zhì)量濃度隨時(shí)間延長不斷上升(圖6a)。試驗(yàn)前4 d氮磷比4∶1組葉綠素a質(zhì)量濃度均顯著高于其他處理組(P<0.05)，至第6 d氮磷比4∶1組微藻葉綠素a質(zhì)量濃度顯著高于氮磷比8∶1、12∶1和20∶1組(P<0.05)，但與氮磷比16∶1組差異并不顯著(P>0.05)，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)氮磷比4∶1組葉綠素a質(zhì)量濃度達(dá)572.34 mg/L且顯著高于其他處理組(P<0.05)，16∶1組的葉綠素a水平顯著高于12∶1和20∶1組(P<0.05)，而氮磷比12∶1和20∶1組的葉綠素a質(zhì)量濃度最低分別為306.23 mg/L和306.73 mg/L，僅為氮磷比4∶1組的53.50%。

在固定總磷不變的條件下，培養(yǎng)期間各試驗(yàn)組威氏海鏈藻葉綠素a質(zhì)量濃度變化幅度較小且維持在較低水平(66.25～174.28 mg/L)，在大多數(shù)時(shí)間點(diǎn)各處理組葉綠素a質(zhì)量濃度差異并不顯著(P>0.05)，僅在第6 d氮磷比4∶1和8∶1組的微藻葉綠素a質(zhì)量濃度顯著高于氮磷比20∶1組(P<0.05)(圖6b)。

試驗(yàn)前4 d時(shí)固定總氮各組威氏海鏈藻葉綠素a水平與固定總磷的各組差別不大，此后隨試驗(yàn)延續(xù)固定總氮組葉綠素a質(zhì)量濃度逐漸高于固定總磷組，整個(gè)試驗(yàn)期間固定總氮各組的平均葉綠素a質(zhì)量濃度為固定總磷各組的1.99倍。

圖5 氮磷比對威氏海鏈藻細(xì)胞密度的影響a.固定總氮，b.固定總磷.下同.

圖6 氮磷比對威氏海鏈藻葉綠素a質(zhì)量濃度的影響

2.2.3 氮磷比對威氏海鏈藻PSⅡ光化學(xué)活性Fv/Fm的影響

在固定總氮不變的條件下，隨著試驗(yàn)延續(xù)威氏海鏈藻的Fv/Fm呈不斷下降的趨勢，而氮磷比對微藻Fv/Fm的影響并不顯著(P>0.05)(圖7a)。

在固定總磷不變的條件下，威氏海鏈藻的Fv/Fm呈逐漸上升的趨勢(圖7b)。試驗(yàn)初期氮磷比對微藻Fv/Fm的影響并不顯著(P>0.05)，第4 d氮磷比4∶1組微藻Fv/Fm僅為0.35且顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05)，試驗(yàn)第6 d氮磷比12∶1組微藻Fv/Fm最低為0.46且顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05)，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)各處理組Fv/Fm未呈現(xiàn)顯著差異(P>0.05)。

試驗(yàn)期間固定總氮各組威氏海鏈藻Fv/Fm的變化趨勢與固定總磷各組恰好相反，但是固定總氮各組的平均Fv/Fm水平與固定總磷各組十分接近，分別為0.48和0.45。

圖7 氮磷比對威氏海鏈藻 Fv/Fm的影響

2.2.4 氮磷比對威氏海鏈藻PSⅡ光化學(xué)活性ETR的影響

在固定總氮不變的條件下，隨著試驗(yàn)延續(xù)威氏海鏈藻的ETR呈不斷下降的趨勢，而氮磷比對各試驗(yàn)組ETR的影響并不顯著(P>0.05)(圖8a)。

在固定總磷不變的條件下，威氏海鏈藻的ETR呈逐漸上升的趨勢(圖8b)。試驗(yàn)初期不同試驗(yàn)組微藻的ETR差異并不顯著(P>0.05)，第4 d氮磷比4∶1組微藻ETR最低僅為13.67且顯著低于氮磷比16∶1組(P<0.05)，試驗(yàn)第6 d氮磷比12∶1和16∶1組 ETR接近且顯著低于氮磷比8∶1組(P<0.05)，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)氮磷比4∶1組微藻ETR水平最低為22.67且顯著低于氮磷比8∶1、16∶1和氮磷比20∶1組(P<0.05)。

試驗(yàn)期間固定總氮各組威氏海鏈藻ETR的變化趨勢與固定總磷各組恰好相反，固定總氮各組的平均ETR水平是固定總磷各組的1.59倍。

圖8 氮磷比對威氏海鏈藻ETR的影響

3 討 論

3.1 氮源對威氏海鏈藻生長及生理代謝的影響

3.2 氮磷化學(xué)計(jì)量比對威氏海鏈藻生長及生理代謝的影響

Justic等[17]總結(jié)前人成果，提出了限制浮游植物生長的氮磷營養(yǎng)鹽化學(xué)計(jì)量比(摩爾比)閾值：氮磷比>16時(shí)為磷限制，氮磷比<16時(shí)為氮限制。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[18]，在室內(nèi)培養(yǎng)過程中假微型海鏈藻(T.pseudonana)吸收氮的速度快于磷，氮限制能強(qiáng)烈抑制細(xì)胞分裂和光合潛能(Fv/Fm)，而在磷限制時(shí)假微型海鏈藻仍可以進(jìn)行細(xì)胞分裂并能維持與對照組相同水平的Fv/Fm，這暗示氮素對假微型海鏈藻生長與光合作用的影響強(qiáng)于磷。另有學(xué)者指出[19]，最適合假微型海鏈藻生長的氮磷比為16∶1。但也有學(xué)者證實(shí)磷限制會(huì)影響威氏海鏈藻的大分子合成途徑，造成132種蛋白的豐富度發(fā)生顯著變化。以上結(jié)果說明，不同種類微藻生存策略和生理代謝機(jī)制的差異會(huì)顯著影響對氮磷營養(yǎng)鹽的吸收利用。有學(xué)者調(diào)查發(fā)現(xiàn)[20]，在膠州灣和桑溝灣海域，隨著氮磷比上升，海區(qū)初級生產(chǎn)力和葉綠素a水平均上升，微藻類群中硅藻比例提高而甲藻比例下降。而有學(xué)者通過試驗(yàn)證實(shí)[21]，在氮、磷限制條件下，東海原甲藻(P.donghaiense)和鏈狀亞歷山大藻(Alexandriumcatenella)細(xì)胞氮磷儲(chǔ)存能力和利用胞內(nèi)儲(chǔ)存氮磷進(jìn)行生長繁殖的潛力明顯高于中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)和尖刺擬菱形藻(Pseudo-nitzschiapungens)。本研究發(fā)現(xiàn)，在相同氮磷比條件下固定總氮的試驗(yàn)組威氏海鏈藻的生長指標(biāo)和光合活性均明顯高于固定總磷的處理組，這說明在相同氮磷比條件下提高氮磷營養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度有助于促進(jìn)威氏海鏈藻的生長性能與光合能力，而氮對威氏海鏈藻的生長和生理狀態(tài)的作用強(qiáng)于磷，這與劉皓等[22]的報(bào)道相符。有研究發(fā)現(xiàn)[23]，“總氮=10 mg/L+總磷=0.5 mg/L”的條件最適合水華微囊藻群體形成與發(fā)展(形成的群體最大可達(dá)900 個(gè))，而過高或過低的氮磷含量均不利于微囊藻細(xì)胞生長與聚集，另外氮限制和磷限制都可以促進(jìn)微囊藻胞外多糖合成有利于形成細(xì)胞集群。有研究發(fā)現(xiàn)[24]，氮限制顯著抑制了三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)的生長速率與光合活性，葉綠素a含量較氮充足時(shí)降低了73%，細(xì)胞PSⅡ光反應(yīng)中心部分關(guān)閉，F(xiàn)v/Fm下降為初始值的64%～71%，三角褐指藻的光抑制程度加劇且對高光的耐受性降低。本研究中氮磷比為4∶1試驗(yàn)組(固定總氮)的細(xì)胞密度和葉綠素a質(zhì)量濃度相對較高，這與王敏等[10]的結(jié)論一致，說明高于基準(zhǔn)值濃度的氮磷營養(yǎng)鹽可以抵消氮限制對威氏海鏈藻生長的影響，而氮磷比較大的試驗(yàn)組(固定總磷)Fv/Fm和ETR相對較低，暗示低于基準(zhǔn)值濃度的氮素不利于緩解氮限制造成的微藻光合效能下降。

本研究僅從現(xiàn)象層面描述了氮源形態(tài)和氮磷化學(xué)計(jì)量比對威氏海鏈藻生長及生理代謝的影響，但是卻引出了海洋微藻所具有的對營養(yǎng)鹽的差異化吸收和同化的問題，針對此類問題有學(xué)者已經(jīng)構(gòu)建了數(shù)學(xué)模型來描述營養(yǎng)鹽對海洋浮游植物生長的影響以及微藻對無機(jī)鹽類的吸收、同化模式，并對模型中的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了測定[25-26]。而隨著科技的進(jìn)步，放射性同位素示蹤、核磁共振、膜片鉗以及快速熒光動(dòng)力學(xué)等技術(shù)紛紛引入，為揭示海洋微藻對無機(jī)營養(yǎng)鹽的選擇性吸收和同化的機(jī)理提供了可靠的研究方法[27-28]。

4 結(jié) 論

(1)相較于無機(jī)氮源，(NH2)2CO更加有利于提高威氏海鏈藻細(xì)胞密度和葉綠素a質(zhì)量濃度，試驗(yàn)中(NH2)2CO處理組威氏海鏈藻最大細(xì)胞密度和葉綠素a質(zhì)量濃度分別達(dá)3.67×104個(gè)/mL和279.25 mg/L。

(2)在分別固定總氮和總磷不變的條件下，不同氮磷比處理組威氏海鏈藻的細(xì)胞密度、葉綠素a質(zhì)量濃度、Fv/Fm和ETR均呈現(xiàn)相反的變化趨勢。

(3)試驗(yàn)期間固定總氮各組威氏海鏈藻的平均細(xì)胞密度、平均葉綠素a質(zhì)量濃度和平均ETR水平均明顯高于固定總磷各組，而固定總氮各組的平均Fv/Fm水平與固定總磷各組十分接近。