艾顯輝，趙金艷，于 釗，閆學春，田麗紅，梁 洋

( 1.東北林業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.哈爾濱工業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150001; 3.中國水產(chǎn)科學研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150040 )

在脊椎動物中，肌肉的生長除了受生肌決定因子家族成員(包括MyoD、Myogenin、Myogenin M 和MRF4等)以及一些負調控因子如肌肉生長抑制素(MSTN)的調控外[1]，一些微小RNA(MicroRNA或miRNA)也通過對各自靶基因的作用協(xié)同參與肌肉的發(fā)生和分化過程[2-3]。富含在心肌和骨骼肌組織中的RNA被稱為肌相關微小RNAs(myomiRs)，在龐大的myomiRs家族中，微小RNA-1(miR-1)和微小RNA-206(miR-206)具有共同的種子序列，屬于同一個基因家族，在骨骼肌中特異表達。研究顯示，在小鼠成肌細胞(C2C12)中過表達miR-1和miR-206，有明顯促分化作用；在肌肉疾病和功能紊亂模型試驗中，miR-1和miR-206也有明顯改變，說明二者與肌肉生長發(fā)育及肌肉相關疾病關系密切[4]。

miR-1和miR-206靶基因定位及其功能在小鼠等模式生物中研究較為深入而透徹，c-Met、HDAC4、pax7、pax3等均已確定是兩者共同的靶基因[5-6]，另有研究顯示，在小鼠中間隙連接蛋白基因Cx43也是miR-1和miR-206的靶基因[7]。目前在小鼠基因組中發(fā)現(xiàn)20種間隙連接蛋白(Cx)基因，在人類基因組中存在21種間隙連接蛋白[8-9]，其中Cx43基因是最重要的間隙連接蛋白基因之一。胚胎發(fā)育早期，Cx43基因在肌纖維中有廣泛表達，顯示能夠促進成肌細胞的分化、融合。體內試驗中，當肌肉受損后，肌衛(wèi)星細胞通過誘導增殖分化來應對肌肉的損傷，此時在增殖的肌衛(wèi)星細胞中Cx43基因的表達會迅速上調，并一直持續(xù)到肌細胞發(fā)生融合[10-11]。體外細胞試驗中也呈現(xiàn)這一趨勢，加入庚醇、辛醇等Cx43基因的抑制劑后，成肌細胞不能再正常分化，即使再加入生肌調節(jié)因子MRF4等也無法使肌細胞恢復分化[12]，說明細胞間隙連接通訊對于體外肌細胞的分化融合是必不可少的。

魚類是重要的脊椎動物，地球上存在的魚類超過30 000種，約占脊椎動物總物種的50%，但魚類miRNA的研究相對滯后[13]。目前尚未見關于黑龍江鯉(Cyprinuscarpio)肌肉中miR-1和miR-206對Cx43基因調控的報道。因此，筆者以黑龍江鯉為試驗材料，自已經(jīng)測序完成的鯉魚功能基因組數(shù)據(jù)庫中調取肌肉生長相關基因Cx43，通過熒光素酶報告系統(tǒng)，在細胞水平分析miR-1和miR-206對靶基因的調控，通過整體原位雜交等方法探明胚胎早期Cx43基因的表達情況，為探明鯉魚肌肉發(fā)育中miRNA的調控機理，優(yōu)化黑龍江鯉品質，提高其生產(chǎn)性能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用鯉魚精子、卵子及鯉魚成體均由中國水產(chǎn)科學院黑龍江水產(chǎn)研究所提供。NIH-3T3細胞實驗室自存。

組織獲?。盒迈r黑龍江鯉處死，首先取出腦部組織，然后腹部解剖，取心、肝胰臟、腎、脾、鰓、腸、皮、紅肌和白肌等組織，迅速將取出的組織放入預凍的凍存管中(凍存管事先做好標記)，凍存管放入液氮中冷凍，所有組織取出后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取

分別取適量鯉魚胚胎，利用液氮充分研磨，加入Trizol使其充分裂解，10 000 r/min離心5 min，取上清液，分別以氯仿和異丙醇抽提、沉淀RNA，后以75%乙醇充分洗滌沉淀。用適量無RNA酶的去離子水溶解沉淀，變性凝膠電泳檢測RNA含量，測量總RNA量和純度，再將總RNA利用PolyA聚合酶加尾，利用接頭引物(Ambion)反轉錄成cDNA。

1.2.2 基因克隆及探針的制備

參照斑馬魚(Daniorerio)MyoD和Cx43基因的cDNA序列，設計簡并引物(表1)，同時設計Cx43基因片段的突變引物，以鯉魚肌肉cDNA為模版，進行PCR擴增。將克隆結果送測序公司進行測序并按照說明書進行標記探針的制備。

表1 引物序列

1.2.3 雙螢光素酶載體的構建與鑒定

根據(jù)表1所設計引物，PCR擴增得Cx43基因片段和Cx43-mut基因片段，膠回收后，利用hindⅢ和mluⅠ(紐英倫生物技術北京有限公司)進行雙酶切，同時雙酶切熒光素酶載體PMIR，將酶切后的目的片段進行檢測，正確后用T4 DNA連接酶，16 ℃過夜連接。連接檢測正確后進行轉化，并提取質粒進行雙酶切和測序鑒定。

1.2.4 細胞培養(yǎng)與轉染

1.2.4.1 細胞的復蘇與傳代培養(yǎng)

NIH-3T3細胞實驗室自存。自液氮中取出后置于37 ℃水浴中快速融化，轉移細胞懸液至15 mL離心管，加入5倍體積預熱到37 ℃的合成培養(yǎng)基，1000 r/min離心5 min，棄上清液，加入3 mL合成培養(yǎng)基，溫和吹打使其混勻，轉移到60 mm培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37 ℃，5%CO2、95%空氣。每日觀察細胞狀態(tài)。培養(yǎng)基配方：DMEM高糖培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清(ES-FBS，BI公司，貨號04-002-1A)，添加1%雙抗和1% GlutaMAX(100×)。

當復蘇培養(yǎng)細胞匯合度達到約80%時，棄去舊培養(yǎng)基，緩慢加入2 mL PBS,對細胞進行2遍清洗；棄去PBS，加入0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA的消化液500 μL，1～2 min后待大部分細胞變圓自底部脫落，再加入1.5 mL合成培養(yǎng)基終止消化；水平離心機離心(1000 r/min，5 min)，棄上清液，按1∶3比例傳代培養(yǎng)。

1.2.4.2 細胞轉染

轉染前1 d將細胞接種于不含抗生素的培養(yǎng)基中，細胞轉染密度60%～70%匯合。按照Lipofectamine 2000說明書程序轉染細胞：

溶液A：每孔240 μL減血清培養(yǎng)基(Opti-MEM)+10 μL lipofectamine 2000，靜置5 min。

溶液B：每孔240 μL Opti-MEM培養(yǎng)基+2.5 μg質粒(總體積250 μL，與A液相同)。

溶液C：將A、B兩管緩慢混合，室溫下靜置20 min。

將溶液C逐滴均勻加入孔中，輕輕晃動培養(yǎng)板混勻，置37 ℃細胞培養(yǎng)箱中保溫4～6 h。之后更換為含有雙抗的培養(yǎng)基，37 ℃，5%的CO2中培養(yǎng)，48 h后檢測轉染水平。

1.2.4.3 雙熒光素酶檢測

細胞轉染48 h后棄去舊培養(yǎng)基，用預冷的1×PBS輕輕洗滌細胞2～3次；24孔板中加入1×ULB(通用裂解液)200 μL，水平搖床室溫搖15 min使細胞充分裂解；離心(10 000 r/min)3 min，取10 μL細胞裂解液于1.5 mL EP管，加50 μL螢火蟲熒光素酶底物，熒光光度儀測定螢火蟲熒光素酶的活性值F，再加50 μL海腎酶底物，檢測海腎熒光素酶發(fā)光值R，記錄F值、R值和比值。

1.2.5 RT-PCR

依照Takara PrimeScript產(chǎn)品的使用說明，用1 μg總RNA作為模板反轉錄，反轉錄引物為oligo-dT。PCR使用的基因特異性引物與Cx43探針合成引物相同。

1.2.6 鯉魚整體原位雜交

雜交第1 d：將受精后6、12、24 h和48 h的鯉魚胚胎分別依次放入裝有75%、50%和25%的1.5 mL無核糖核酸酶的EP管中復水，H2O2對鯉魚胚胎進行漂洗，蛋白酶K消化，4% PFA固定胚胎，加入含有探針的雜交液，70 ℃雜交箱中雜交過夜。

雜交第2 d：將雜交過夜的胚胎經(jīng)溶液Ⅰ(50%甲酰胺，5×SSC pH=4.5，1% SDS)洗滌3次，溶液Ⅱ(0.5 mol NaCl，10 mmol Tris-Cl pH=7.5，1% Tween20)洗滌3次，溶液Ⅲ(50%甲酰胺pH=4.5，2×SSC)洗滌3次，每次洗滌均為30 min。洗滌后的胚胎利用馬血清封閉90 min，之后置于裝有地高辛抗體的TBST溶液中(1∶2000)，放4 ℃冰箱中搖床洗滌16 h以上。

武戲自然就熱鬧些，武將們負旌旗持鋒刀，八字步一步高過一步，鏗鏘鏗鏘鏗鏘鏘。伴樂的那幾個老頭禿頭皺臉的，手底下忙著拉胡打鼓，頭也跟著不停地晃，恣意得很!

雜交第3 d：用TBST溶液(8 mg/mL NaCl，0.2 mg/mL KCl，25 mmol/L Tris-HCl pH=7.5，1% Tween20)對胚胎進行徹底洗滌，放于4 ℃冰箱中搖床洗滌過夜。

雜交第4 d：室溫下用NTMT(100 mmol NaCl，100 mmol Tris-HCl(pH 9.5)，50 mmol MgCl2, 1% Tween20和2 mmol左旋咪唑)對胚胎進行搖床洗滌，3次/5 min。將胚胎移至裝有顯色液的培養(yǎng)皿中避光顯色(-4 ℃冰箱)，顯色完成后用PBS溶液對胚胎進行洗滌以終止顯色，50%甘油透化30 min，觀察拍照。

2 結 果

2.1 鯉魚肌肉中miR-1和miR-206靶基因預測及分析

通過Targetscan軟件進行預測，結合前期閱讀資料，在斑馬魚中尋找到Cx43基因是miR-1和miR-206潛在的靶基因(圖1)。將鯉魚Cx43基因與斑馬魚序列進行比對，結果顯示，鯉魚Cx43基因的3′UTR區(qū)能夠和斑馬魚Cx43基因絕大部分匹配，且有6位堿基能與miR-1和miR-206種子序列完全匹配(圖2)。

2.2 PMIR-Cx43熒光素酶報告載體的構建

根據(jù)以上分析結果，在鯉魚Cx43基因3′-UTR區(qū)設計引物(表1)，以提取的鯉魚肌肉cDNA為模板，進行PCR擴增。結果顯示，擴增條帶大約為500 bp，與理論值445 bp相符(圖3)；將目的片段與克隆載體連接送去測序，測序結果與Cx43基因理論值匹配(通過DNAMAN比對)(圖4)。

2.3 PMIR-Cx43熒光素酶報告載體的鑒定

將上述含有Cx43基因3′-UTR區(qū)的克隆載體和熒光素酶載體PMIR通過酶切、連接、轉化獲取重組質粒DNA，再用hindⅢ和mluⅠ雙酶切鑒定。結果表明，酶切后得到的約500 bp的Cx43基因3′-UTR片段與預期大小相符(圖5)。

圖1 斑馬魚Cx43基因miRNA結合位點預測結果

圖2 斑馬魚和鯉魚Cx43基因序列比對結果

圖3 PCR結果1:DL2000 DNA Marker; 2:PCR產(chǎn)物.

圖4 Cx43基因3′-UTR測序結果

圖5 重組質粒 PCR檢測結果1:DL2000 DNA Marker; 2:PCR產(chǎn)物.

2.4 PMIR-Cx43-mut熒光素酶報告載體的構建

另外設計Cx43基因的突變引物(表1)，擴增成功后連接克隆載體測序檢測，結果顯示突變體構建成功(圖6)。隨后構建熒光素酶報告載體PMI-Cx43-mut，分別用PCR和酶切檢測片段大小，與理論值約447 bp相符(圖7)。

2.5 miR-1和miR-206對靶基因Cx43調控作用分析

在3T3細胞中，通過檢測熒光素表達變化驗證miRNAs對靶基因表達的調控作用。利用脂質體將PMIR-Cx43載體、突變載體與合成的miRNAs，陰性對照及海腎熒光素酶載體共轉染3T3細胞，海腎熒光素酶的活性為內參，轉染后48 h檢測熒光素酶的活性。由圖8可知，與對照組相比，miR-1和miR-206均能下調pMIR-Cx43-3′UTR的熒光素酶活性，其中miR-206下調明顯。突變組miR-1熒光水平與對照組基本持平，miR-206組略低于對照組。

圖6 Cx43基因突變測序結果

圖7 PMI-Cx43-mut載體鑒定結果a.1,DL2000 DNA Marker; 2～7,PCR產(chǎn)物；8,陰性對照. b.1,DL2000 DNA Marker; 2,酶切產(chǎn)物.

圖8 miR-1和miR-206對Cx43基因3′UTR的調控作用NS代表差異不顯著； **代表差異顯著(P<0.01).

2.6 Cx43基因在鯉魚胚胎不同時期的表達

對鯉魚胚胎發(fā)育6、12、24 h和48 h時期的Cx43表達情況進行分析，RT-PCR結果顯示，不同時期的鯉魚胚胎中Cx43的表達有明顯差異。6 h胚胎中已經(jīng)開始表達但表達量較低，隨后表達量開始上調。當胚胎發(fā)育到24 h時，達到最高峰，此后表達呈現(xiàn)下降趨勢。MyoD基因作為陽性對照，Cx43基因表達趨勢與其有相似性(圖9)。

圖9 鯉魚胚胎發(fā)育不同時期RT-PCR結果

2.7 原位雜交分析Cx43基因在鯉魚胚胎中表達情況

3 討 論

在模式動物小鼠和斑馬魚中，發(fā)現(xiàn)多種與肌肉發(fā)育相關的miRNA，這些富含在心肌和骨骼肌組織中的miRNAs被稱為myomiRs，這些myomiRs通過對靶基因的調控而促進肌肉的發(fā)生、肌細胞的分化以及肌肉再生等過程[2-3]。其中miR-206和miR-1在骨骼肌中特異表達，且具有共同的種子序列，Cx43、c-Met、HDAC4、pax7、pax3等均是兩者共同的靶基因，但目前在黑龍江鯉肌肉中miR-206和miR-1對Cx43基因的調控尚未見報道。

圖10 Cx43基因在12 h鯉魚胚胎中的表達情況a.側面觀察; b.背面觀察； c.腹側觀察; d.MyoD基因. 標尺為100 μm.

圖11 Cx43基因在24、48 h鯉魚胚胎中表達情況a.24 h陰性胚胎； b.24 h Cx43基因表達情況； c.24 h MyoD基因表達情況； d.48 h陰性胚胎； e.48 h Cx43基因表達情況； f.48 h MyoD基因表達情況. 標尺為100 μm.

3.1 miR-1和miR-206對Cx43基因的調控

研究顯示，Cx43作為一種重要的間隙連接蛋白，在小鼠等模式動物中受到miR-1和miR-206的調控，在胚胎發(fā)育早期的肌纖維中有廣泛表達，能夠促進成肌細胞的分化、融合[14]。Anderson等[15]利用小鼠C2C12細胞研究miR-206和miR-1對Cx43基因的調控作用時發(fā)現(xiàn)，在細胞融合過程中Cx43基因高表達，但分化后表達明顯下調，說明了myomiRs通過調控細胞間信息交流通道的關鍵蛋白Cx43蛋白的表達來促進細胞融合。李積永[16]通過研究大鼠骨骼肌運動性微損傷時發(fā)現(xiàn)，miR-206能通過調節(jié)Cx43基因的表達而促進大鼠腓腸肌的運動性損傷修復。另有研究顯示，在人血管平滑肌細胞中，miR-206與Cx43基因形成調控網(wǎng)絡來影響其增殖和發(fā)育[17]。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在小鼠、大鼠、人、狗、牛和雞中Cx43的種子序列完全保守[18-19]，本試驗前期利用生物信息學分析在斑馬魚中也發(fā)現(xiàn)了miR-206和miR-1結合位點，進一步分析鯉魚Cx43基因，發(fā)現(xiàn)鯉魚3′UTR區(qū)域與斑馬魚Cx43基因絕大部分匹配，且有6位堿基與miR-1和miR-206種子序列完全匹配，因此預測，在鯉魚中Cx43基因也能被二者調控。為進一步檢測該結果，克隆了鯉魚Cx43基因3′UTR區(qū)并構建熒光素酶報告載體與突變載體，利用脂質體轉染小鼠成纖維3T3細胞，結果表明，miR-1和miR-206均能下調含有Cx43 3′UTR序列載體的熒光素酶活性，其中miR-206作用明顯，miR-1對其抑制作用較弱。該結果與Anderson等[15]在小鼠中發(fā)現(xiàn)的作用機制相似，暗示在鯉魚中Cx43基因也是miR-206和miR-1的靶基因。

3.2 黑龍江鯉胚胎期Cx43基因表達模式

胚胎原位雜交方法可以分析mRNA在不同發(fā)育時期組織中的表達情況，是研究胚胎基因表達的常用技術，而地高辛所標記的探針具有較高靈敏度，有助于探討目的基因的調控機制[20-21]。本試驗利用胚胎整體原位雜交方法，MyoD基因作為陽性對照，研究鯉魚不同發(fā)育時期胚胎Cx43基因表達時發(fā)現(xiàn)，受精12 h后，Cx43基因在胚胎的眼周、頭部以及心臟部位表達，同時在近軸細胞和神經(jīng)管一直延伸至胚胎的尾牙部分表達顯著；當胚胎發(fā)育至24 h時，Cx43基因主要集中在神經(jīng)管、背部近軸細胞以及胚胎的體節(jié)中，且表達量最高，隨后呈現(xiàn)下降趨勢；至胚胎發(fā)育48 h在體軸和近軸細胞以及體節(jié)等處幾乎觀察不到基因表達。該結果與前期在鯉魚胚胎早期發(fā)育過程中MyoD基因的表達模式[22]類似，也有研究顯示，Cx43基因主要在小鼠早期胚胎中高表達，因此推測，在鯉魚中Cx43基因對成肌分化早期有重要調控作用。

另外，原位雜交結果顯示，Cx43基因始終在胚胎頭部、眼部高表達，由于該基因在腦、心臟等部位分布廣泛，尤其在神經(jīng)元中，是神經(jīng)膠質細胞等完成功能主要依賴的蛋白之一，因此幾乎在所有胚胎時期的腦中Cx43基因始終表達明顯[23]。

綜上，該研究在黑龍江鯉肌肉中探索了miRNA-206和miRNA-1和對Cx43的調控作用，并利用其胚胎進行Cx43基因表達差異性研究，為進一步探討鯉魚肌肉發(fā)育的調控機制，以及改良鯉魚肌肉品質提供了理論基礎。