孫平 向澤棟 董丹華 高鵬

摘? ? ? 要： 以懸鈴木成熟的球果為原料，通過單因素和正交試驗(yàn)對(duì)超聲波輔助提取懸鈴木總黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化;并通過考察總黃酮對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基的清除率來評(píng)價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果表明，懸鈴木總黃酮的最佳提取條件如下：乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1∶25（g/mL），超聲時(shí)間30 min，超聲溫度60 ℃，在此優(yōu)化條件下，總黃酮的含量為21.82 mg/g。總黃酮質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，具有較強(qiáng)的清除自由基能力，清除DPPH自由基和ABTS自由基為85.38%和98.84%。

關(guān)? 鍵? 詞：懸鈴木;球果;超聲輔助提取;總黃酮;抗氧化活性

中圖分類號(hào)：R284.2? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A? ? ? ?文章編號(hào)： 1671-0460（2019）10-2214-05

Abstract： Using the mature cones of Platanus as raw material， on the basis of single factor tests， the optimum conditions of ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids were optimized by orthogonal tests. Meanwhile， the antioxidant activity of total flavonoids from Platanus was evaluated by DPPH and ABTS+ scavenging capacity. The results showed that the optimal extraction conditions of total flavonoids were as follows： the ethanol volume 60%， the ratio of water to raw material 1：25（g/mL），the ultrasonic temperature 60 ℃， the time 30 min. Under these conditions， the total flavonoids content was 21.82 mg/g. When the total concentration of flavonoids was 20 μg/mL， the scavenging rate of total flavonoids on DPPH and ABTS+ were 85.38% and 98.84%， which indicated that the total flavonoids of Platanus had strong antioxidant activity.

Key words： Platanus; Cones; Ultrasonic-assisted extraction; Total flavonoids; Antioxidant activity

懸鈴木為懸鈴木科（Platanaceae）落葉大喬木，亞洲、歐洲和北美洲為其主要栽種地區(qū)[1]。我國引入栽培主要是一球、二球和三球懸鈴木三種，其中雜交種二球懸鈴木[2]是我國的主要栽培品種。懸鈴木被稱為“行道樹之王”，可以凈化空氣微小顆粒、隔音防噪和降低地面溫度，并且在民間還使用樹皮治療腹瀉、牙痛[3]等疾病。經(jīng)現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，懸鈴木擁有多種化學(xué)成分，如黃酮、多酚、三萜、糖苷、有機(jī)酸及其衍生物等[4-6]，并且分離出新型骨架成分[7]。

此外還從懸鈴木的不同組織器官中提取分離出具有抗氧化、抗炎、細(xì)胞毒性、抑菌活性、抑制小鼠妊娠、抗腫瘤、抗HIV、保護(hù)肝腎、解偶聯(lián)[4，8-13]等生物活性物質(zhì)。但在4-6月份，懸鈴木成熟球果開始脫落，在外力作用下果毛四處飛散，造成過敏和炎癥[14]和環(huán)境污染。目前對(duì)懸鈴木的研究主要集中在樹皮和葉子上，對(duì)球果尤其是成熟的球果研究較少。因此，通過超聲輔助溶劑提取法提取懸鈴木中的總黃酮成分，并應(yīng)用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，探究懸鈴木總黃酮對(duì)DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力。根據(jù)提取工藝優(yōu)化結(jié)果和抗氧化能力分析，可以為懸鈴木總黃酮的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)，還為其活性成分和藥理作用的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1? 實(shí)驗(yàn)部分

1.1? 實(shí)驗(yàn)材料

懸鈴木球果 采自山東中醫(yī)藥大學(xué)校內(nèi);蘆丁對(duì)照品（純度≥98%） 購自上海源葉生物;DPPH、ABTS 購自上海麥克林公司;乙醇 購自天津市四通化工廠;維生素C（Vc） 購自國藥集團(tuán);其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

1.2? 實(shí)驗(yàn)儀器

KQ-500E型超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司;DFY-600C高速粉碎機(jī) 無錫久平儀器有限公司;XS105DU電子天平 梅特勒-托利多集團(tuán);752型紫外可見分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

2? 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 懸鈴木總黃酮提取

懸鈴木球果干燥后粉碎并過24目篩。取約1.0 g樣品，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，按照不同的考察因素對(duì)總黃酮進(jìn)行超聲輔助溶劑提取，離心取得上清液，制得總黃酮提取液。

2.2? 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用硝酸鈉-亞硝酸鋁比色法測(cè)定懸鈴木總黃酮含量，精密稱定20 mg蘆丁對(duì)照品，用60%乙醇配置成0.20 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。準(zhǔn)確吸取0.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25 mL量瓶中，加入1.0 mL 5 %亞硝酸鈉溶液、1.0 mL 10%硝酸鋁溶液，震蕩均勻后放置5 min，再加10.0 mL 4%氫氧化鈉溶液，用60%乙醇加至刻度線，震蕩均勻后放置15 min[15]。以蘆丁試劑空白作為參比液，在505 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，根據(jù)蘆丁濃度和吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3? 單因素試驗(yàn)

采用2.1下法提取懸鈴木總黃酮，提取條件為：料液比1∶20 g/mL、超聲時(shí)間30 min、超聲溫度60 ℃、使用不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（40、50、60、70、80%）提取，測(cè)定總黃酮的提取率;乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲時(shí)間30 min、超聲溫度60 ℃、根據(jù)總黃酮的提取率考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL）的影響;乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶20 g/mL、超聲溫度60 ℃、使用不同超聲時(shí)間（20、25、30、35、40 min）提取，測(cè)定總黃酮的提取率;乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶20 g/mL、超聲時(shí)間30 min、使用不同超聲溫度（40、50、60、70、80 ℃）提取，測(cè)定總黃酮的提取率。

2.4? 正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，L9（34）正交試驗(yàn)見表1。

2.5? 抗氧化活性測(cè)定

將懸鈴木總黃酮配制成0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20μg/mL質(zhì)量濃度，以Vc為對(duì)陽性照，分別測(cè)定其對(duì)DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率，評(píng)價(jià)其抗氧化活性。

2.5.1? 懸鈴木總黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[16，17]的測(cè)定方法并稍加修改。配制50μg/mL的DPPH乙醇溶液，取1與1 mL不同濃度的樣品溶液或Vc溶液充分混勻，室溫下暗處放置30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。計(jì)算公式如下：

DPPH自由基清除率=1-（A1-A2）/A0

式中： A1 —樣品組吸光度;

A2 —樣品本底吸光度（以等體積無水乙醇代替DPPH溶液）;

A0 —空白對(duì)照組吸光度（以等體積蒸餾水代替樣品溶液）。

2.5.2? 懸鈴木總黃酮對(duì)ABTS+自由基清除能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[18，19]的測(cè)定方法并稍加修改。配制7 mmol/mL的ABTS+溶液，室溫下與等體積的4.9 mmol/mL過硫酸鉀溶液混合后暗處放置12 h，制成ABTS+儲(chǔ)備液，用pH=7.4的磷酸緩沖液稀釋儲(chǔ)備液20倍制成ABTS+工作液。取不同濃度的樣品溶液和Vc溶液1 mL，加入2.0 mL的ABTS+工作液，震搖均勻后常溫暗處放置10 min，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。計(jì)算公式如下：

ABTS+自由基清除率=1-（A1-A2）/A0

式中： A1 —樣品組吸光度;

A2 —樣品本底吸光度（以等體積蒸餾水代替ABTS+溶液）;

A0 —空白對(duì)照組吸光度（以等體積蒸餾水代替樣品溶液）。

2.6? 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次，采用GraphPad Prism 8.0.2對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（mean±SD）。

3? 結(jié)果分析

3.1? 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁為對(duì)照品，根據(jù)蘆丁濃度和吸光度的測(cè)定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。線性回歸方程為Y=11.95X+0.005 7，R2=0.999 4，其中Y為吸光度，X為蘆丁濃度。

3.2? 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1? 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖2可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)較小時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)增加會(huì)導(dǎo)致總黃酮提取率增加，在60%時(shí)黃酮提取率最大，之后呈現(xiàn)急劇下降趨勢(shì)。推測(cè)這是由于懸鈴木總黃酮極性較大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時(shí)，不利于溶解黃酮物質(zhì)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，會(huì)有部分多糖等水溶性雜質(zhì)溶出[20]。因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

3.2.2? 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖3可知，料液比的變化導(dǎo)致總黃酮提取率呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢(shì)，在1∶20 g/mL時(shí)黃酮提取率最大，之后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)。推測(cè)由于總黃酮在料液比1∶20 g/mL時(shí)基本溶出，繼續(xù)增加溶劑用量會(huì)使其他雜質(zhì)增加溶出，使黃酮提取率下降[21]因此選擇料液比為1∶20 g/mL。

3.2.3? 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖4可知，總黃酮提取率隨著超聲時(shí)間的增大呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢(shì)，在30 min時(shí)黃酮提取率最大，之后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)?？赡芤?yàn)檫^長(zhǎng)的超聲時(shí)間會(huì)破壞黃酮類化合物結(jié)構(gòu)，使其容易于分解， 而且超聲時(shí)間過長(zhǎng)溫度不好控制， 導(dǎo)致乙醇的揮發(fā)， 引起提取率的下降[22]。因此選擇超聲時(shí)間為30 min。

3.2.4? 超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖5可知，總黃酮提取率隨著超聲溫度的增大呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢(shì)，在30 min時(shí)黃酮提取率最大，之后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)?？赡苡捎跍囟仍黾訒?huì)使黃酮成分被破壞，而且也會(huì)增加雜質(zhì)溶出。因此選擇超聲溫度為60 ℃。

3.3? 正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

由表2正交試驗(yàn)結(jié)果分析可知，各提取工藝條件對(duì)總黃酮提取率影響程度不同，根據(jù)極差分析結(jié)果可知，對(duì)總黃酮提取率的影響主次順序?yàn)锳>B>C>D，即乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響最大，其次是料液比，超聲溫度對(duì)提取率的影響最小。懸鈴木總黃酮最佳提取工藝為A2B3C2D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶25 g/mL，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度60 ℃。對(duì)最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示為21.82 mg/g，大于正交試驗(yàn)結(jié)果中的最大含量21.39 mg/g，表明此提取方法重復(fù)性良好，提取率高，適用于提取懸鈴木總黃酮。

3.4? 對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

由圖6可知，總黃酮質(zhì)量濃度在0～20μg/mL范圍內(nèi)，隨著總黃酮質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除率隨之增加。當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為20μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到85.38%，陽性對(duì)照Vc為77.23%。以上結(jié)果表明懸鈴木總黃酮對(duì)DPPH自由基有良好的清除的能力。

3.5? 對(duì)ABTS+自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

由圖7可知，總黃酮質(zhì)量濃度在0～20μg/mL范圍內(nèi)，隨著總黃酮質(zhì)量濃度的增加，ABTS+自由基清除率隨之增加。當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為10μg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+自由基清除率達(dá)到98.38%，之后在總黃酮質(zhì)量濃度在10～20μg/mL之間，ABTS+自由基清除率保持相對(duì)穩(wěn)定。總黃酮質(zhì)量濃度在20μg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+自由基清除率達(dá)到98.38%，高于同濃度陽性對(duì)照Vc對(duì)ABTS+自由基清除率66.33%。以上結(jié)果說明懸鈴木總黃酮具有很高的清除ABTS+自由基的能力。

4? 結(jié) 論

通過單因素和正交試驗(yàn)，對(duì)懸鈴木總黃酮的超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化確定：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶25 g/mL、超聲時(shí)間30 min、超聲溫度60 ℃，懸鈴木總黃酮提取率為21.82 g/mg。

通過抗氧化試驗(yàn)，結(jié)果表明在0～20μg/mL范圍內(nèi)，懸鈴木總黃酮對(duì)DPPH自由基和ABTS+自由基清除率逐漸增加，總黃酮濃度在20μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基和ABTS+自由基清除率分別達(dá)到85.38%和98.84%，說明懸鈴木總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

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