曾玉梅 杜娟 陳應(yīng)智 儲(chǔ)兵

膀胱癌是常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率高居惡性腫瘤的第9位［1］。其中膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BUC）發(fā)病率居全球男性惡性腫瘤的第6位［2］，具有多灶發(fā)生及易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，如能早期發(fā)現(xiàn)并治療，能明顯降低患者的死亡率，因此尋找與膀胱尿路上皮癌有關(guān)的生物學(xué)標(biāo)記物意義重大。GATA 結(jié)合蛋白3（GATA-bindingprotein 3，GATA3）是一種具有較強(qiáng)的特異性細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞凋亡等過(guò)程，且僅在膀胱癌中高表達(dá)，而在腎癌和前列腺癌中不表達(dá)或低表達(dá)［3］；細(xì)胞角蛋白 20（cytokeratin 20，CK20）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)可以用于早期診斷尿路上皮癌并判斷其預(yù)后的腫瘤標(biāo)記物，其陽(yáng)性表達(dá)報(bào)道不一［4］。本研究擬采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)BUC進(jìn)行GATA3、CK20的檢測(cè)，探討兩者在BUC組織中的陽(yáng)性表達(dá)情況及臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集本院病理科2015年1月至2016年7月膀胱活檢和手術(shù)切除標(biāo)本共計(jì)105例，其中BUC 89例，尿路上皮良性病變16例，BUC病例中男性66例，女性23例；年齡34～79歲，中位年齡57歲；其病理分級(jí)按世界衛(wèi)生組織（World Health Organize，WHO）分類標(biāo)準(zhǔn)［5］分為低級(jí)別和高級(jí)別，25例患者為低級(jí)別，64例患者為高級(jí)別；其中無(wú)肌層浸潤(rùn)的膀胱尿路上皮癌52例，有肌層浸潤(rùn)的尿路上皮癌37例。16例良性病變中腺性膀胱炎12例，內(nèi)翻性乳頭狀瘤4例。

1.2 方法

所有標(biāo)本經(jīng)10%中性緩沖液甲醛固定，石蠟標(biāo)本切片3 μm，常規(guī)脫蠟至水化；抗原修復(fù)；高壓鍋120℃保壓8 min，自來(lái)水緩沖10 min，冷卻至室溫；3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫10 min；分別加入即用型GATA3和CK20鼠源單克隆抗體（購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司）；于37℃培養(yǎng)箱孵育1 h；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH 7.4）沖洗3次，每次3 min；滴加Envision兩步法試劑盒二抗（購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），37℃培養(yǎng)箱孵育15 min；PBS（pH 7.4）沖洗3次，每次 3 min；DAB 顯色 2 min，Mayer蘇木素復(fù)染，逐級(jí)乙醇脫水，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

光鏡下觀察，GATA3以細(xì)胞核著色為陽(yáng)性表達(dá)，CK20以細(xì)胞膜著棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性結(jié)果。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，判斷標(biāo)準(zhǔn)：＞10%～25%為弱陽(yáng)性（1+），＞25%～50%為中度陽(yáng)性（2+），＞50%為強(qiáng)陽(yáng)性（3+）。GATA3以無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性表達(dá)率≤10%為陰性，CK20以無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞或僅有傘細(xì)胞表達(dá)為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GATA3在膀胱組織中的表達(dá)

GATA3在良性病變及膀胱尿路上皮癌中均有表達(dá)，分別為100%及85.4%，而在尿路上皮癌的組織中，GATA3在高級(jí)別、有肌層浸潤(rùn)及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率均高于低級(jí)別、無(wú)肌層浸潤(rùn)及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1，圖 1。

圖1 尿路上皮良性病變、低級(jí)別及高級(jí)別膀胱尿路上皮癌組織中GATA3的陽(yáng)性表達(dá)Figure 1 Positive expression of GATA3 in benign lesions of urinary tract，low grade and high grade BUC

2.2 CK20在膀胱組織中的表達(dá)

CK20在良性病變的尿路上皮僅表達(dá)在傘細(xì)胞，在尿路上皮癌中則呈100%陽(yáng)性表達(dá)，在低級(jí)別和高級(jí)別膀胱尿路上皮癌中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為40.0%、71.9%，在浸潤(rùn)性和非浸潤(rùn)性的膀胱尿路上皮癌中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為86.5%、51.9%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤中陽(yáng)性表達(dá)率分別為92.3%、62.9%，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2、圖2。

3 討論

GATA3是一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的尿路上皮癌的診斷標(biāo)記物［6-7］，是細(xì)胞分化成熟的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在人體多種惡性腫瘤組織中異常表達(dá)，在多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和分化中起作用［8-9］，并與腫瘤的分級(jí)和預(yù)后關(guān)系密切［10-11］。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化方法檢測(cè)105例膀胱尿路上皮腫瘤GATA3的表達(dá)，其中良性病變中的尿路上皮細(xì)胞100.0%出現(xiàn)GATA3的陽(yáng)性表達(dá)，膀胱尿路上皮癌中85.4%表達(dá)GATA3（圖1）。以上結(jié)果與Hiroshi等［12］的研究結(jié)果接近：GATA3在良性病變和尿路上皮癌中均高表達(dá)，大多數(shù)（98%）膀胱上皮良性病變的細(xì)胞表達(dá)GATA3，而在小部分（14%）尿路上皮癌中表達(dá)缺失。因此，本研究認(rèn)為，GATA3可作為一個(gè)有用的免疫組化標(biāo)記，區(qū)分尿路上皮癌與其他泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，如前列腺癌與腎細(xì)胞癌。但GATA3表達(dá)的特異性在其他類型的組織，如上皮其他變種癌、尿道腫瘤、轉(zhuǎn)移性尿路上皮腫瘤，還需進(jìn)一步研究。此外，在尿路上皮癌中，GATA3在高級(jí)別、有肌層浸潤(rùn)及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率均高于低級(jí)別、無(wú)肌層浸潤(rùn)及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤，由此可見(jiàn)，GATA3陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤相比GATA3陰性表達(dá)的腫瘤，具有更高的疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)，可作為膀胱尿路上皮癌的獨(dú)立預(yù)后判斷因子，此結(jié)論與Wilson等［13］的研究基本吻合。而 Nandi等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在高級(jí)別浸潤(rùn)性尿路上皮癌中GATA3高表達(dá)，其與腫瘤浸潤(rùn)程度密切相關(guān)，并且與一些預(yù)后較好的指標(biāo)相關(guān)，與本研究的觀點(diǎn)有分歧，因此還需要更多的臨床隨訪資料論證。

表2 CK20表達(dá)與膀胱腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 2 Relationship between expression of CK20 and clinicopathological parameters of bladder tumor

圖2 尿路上皮良性病變、低級(jí)別及高級(jí)別膀胱尿路上皮癌組織中CK20的陽(yáng)性表達(dá)Figure 2 Positive expression of CK20 in benign lesions of urinary tract，low grade and high grade BUC

角蛋白20（CK20）是角蛋白家族（Cytokeratin，CK）中的一員，分布于上皮細(xì)胞的中間纖維絲，是構(gòu)成細(xì)胞骨架的重要物質(zhì)，具有嚴(yán)格的上皮特異分布［15］，既往研究［9］發(fā)現(xiàn) CK20 在膀胱尿路上皮病變中的表達(dá)具有較高的特異性和敏感性，但是否與BUC的分級(jí)與預(yù)后有關(guān)尚無(wú)明確結(jié)論。本研究和既往的研究［16］均發(fā)現(xiàn)CK20在膀胱尿路上皮病變中的表達(dá)具有較高的特異性和敏感性，而且有“僅表達(dá)在惡性尿路上皮”的特點(diǎn)，表達(dá)強(qiáng)度往往與膀胱尿路上皮癌的分級(jí)有明顯的關(guān)系。本研究顯示，CK20在膀胱組織中的表達(dá)情況與性別無(wú)關(guān)，在16例尿路上皮良性病變中，無(wú)一例出現(xiàn)CK20異常表達(dá)，而在BUC組織中總的陽(yáng)性表達(dá)率為61.7%，說(shuō)明CK20在BUC診斷中敏感性較強(qiáng)。在低級(jí)別和高級(jí)別膀胱尿路上皮癌中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為40.0%、71.9%，在浸潤(rùn)性和非浸潤(rùn)性的膀胱尿路上皮癌中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為86.5%、51.9%有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤中陽(yáng)性表達(dá)率分別為92.3%、62.9%，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明CK20表達(dá)與腫瘤分化程度和侵襲、轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，其可能原因是腫瘤細(xì)胞中間纖維絲合成活躍，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性強(qiáng)，導(dǎo)致其侵襲力及轉(zhuǎn)移力增強(qiáng)。因此CK20高表達(dá)提示腫瘤惡性程度高，發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性大，預(yù)后差。綜上，GATA3和CK20兩者的檢測(cè)可為評(píng)估BUC的生物學(xué)行為、判斷預(yù)后提供依據(jù)，聯(lián)合應(yīng)用兩者對(duì)指導(dǎo)BUC的治療可能具有重要價(jià)值，可作為膀胱活檢的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。