吳湃 吳坤河 劉海燕 張斗星 胡安群★

乙型病毒性肝炎（簡(jiǎn)稱乙肝）是一種在我國(guó)比較高發(fā)的傳染病，它是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）持續(xù)感染引起。根據(jù)基因組序列異質(zhì)性，HBV可分為8種基因型（A型～H型）［1］。各種基因型HBV對(duì)于藥物的效果及患者的預(yù)后有一定的差異［2］。因此，有必要對(duì)患者感染的HBV進(jìn)行基因分型。據(jù)報(bào)道，各種基因型HBV在全球不同地區(qū)的分布呈現(xiàn)不同的流行病學(xué)特點(diǎn)［3］。我國(guó)感染的HBV主要以B型和C型為主，其中B型以Ba型為主。HBV在我國(guó)北方以C型為主，而在南方則為B型較高［4］。

對(duì)HBV感染進(jìn)行監(jiān)測(cè)及病情評(píng)估，對(duì)于患者的治療方案選擇與療效非常重要。在臨床實(shí)踐中，HBV DNA、乙型肝炎E抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）、乙肝病毒前S1蛋白抗原（Pre-S1 antigen，PreS1）是反映HBV感染狀態(tài)和預(yù)后的重要指標(biāo)［5］。而這3個(gè)指標(biāo)在不同基因型HBV感染患者血液中的表現(xiàn)的研究，在國(guó)內(nèi)外研究尚少，并存在一定的爭(zhēng)議。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)并比較HBV DNA含量、HBeAg、PreS1抗原在不同基因型HBV感染患者中的差異，為乙型病毒性肝炎的個(gè)體化與有效診療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 患者與標(biāo)本采集

隨機(jī)選取2017年1月份至8月份在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院住院的慢性乙肝患者共226例，其中男153例，女73例，年齡17～73歲。所有患者均符合2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］；乙型肝炎病毒表面抗原定性實(shí)驗(yàn)為陰性結(jié)果或乙型肝炎病毒表面抗原定量結(jié)果低于0.05 IU/mL的患者均不納入本研究。本研究嚴(yán)格保密患者的個(gè)人信息與隱私，遵守安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院對(duì)醫(yī)學(xué)倫理方面的相關(guān)規(guī)定。于患者入院第二天清晨，采集空腹血清用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2 材料與方法

1.2.1 試劑

病毒基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自于天根生物（北京）有限公司，巢式PCR選用日本takara生物公司的Pyrobest DNA polymerase試劑盒，50 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（50 bp～400 bp）購(gòu)自于北京莊盟生物公司，引物由上海生工生物公司合成。HBV DNA熒光定量PCR試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因公司生產(chǎn)，HBeAg體外檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于廈門英科新創(chuàng)科技公司，乙肝病毒前Sl抗原體外檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于上海阿爾法生物技術(shù)公司。

1.2.2 HBV DNA基因分型檢測(cè)

先按照病毒基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書操作流程，提取患者血液標(biāo)本中的乙型肝炎病毒DNA基因組；然后采用巢式PCR技術(shù)進(jìn)行兩輪擴(kuò)增及檢測(cè)，引物設(shè)計(jì)如表1。第一輪PCR擴(kuò)增之引物針對(duì)HBV保守序列設(shè)計(jì)，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 2 min，94℃ 變性 30 s，58℃ 退火 30s，72℃延伸2.5 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃ 延伸10 min。第二輪PCR擴(kuò)增之引物針對(duì)人群中HBV主要類型（B、C亞型）特異基因序列設(shè)計(jì)，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 2 min，94℃變性 30 s，55℃ 退火30 s，72℃ 延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳分析，50 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)作為為電泳參照。

1.2.3 HBV DNA定量檢測(cè)

HBV DNA定量檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，使用美國(guó)ABI 7300型熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)?；颊哐褐蠬BV DNA含量≥1 000 IU/mL則判斷為陽(yáng)性。

1.2.4 HBeAg檢測(cè)

HBeAg檢測(cè)采用一步法雙抗體夾心ELISA法，嚴(yán)格按照HBeAg體外檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，并根據(jù)說(shuō)明書給出的公式計(jì)算出臨界值（Cut-off value）及判讀結(jié)果。

1.2.5 PreS1抗原檢測(cè)

Prs1抗原檢測(cè)采用兩步法雙抗體夾心ELISA法，嚴(yán)格按照乙肝病毒前Sl抗原體外檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，并根據(jù)說(shuō)明書給出的公式計(jì)算出臨界值及判斷結(jié)果。

表1 巢式PCR檢測(cè)HBV基因型的引物Table 1 Primers for detection of HBV genotypes by nested PCR

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

本研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析運(yùn)用SPSS 20.0版本軟件包。計(jì)數(shù)資料采用百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表示差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 患者感染的HBV基因分型結(jié)果

選擇兩對(duì)引物（HBV保守序列引物、B或C亞型特異性引物），運(yùn)用巢式PCR技術(shù)對(duì)226例乙型病毒性肝炎患者血清進(jìn)行基因型檢測(cè)分析。其中，B基因型引物的陽(yáng)性擴(kuò)增片段產(chǎn)物為279 bp，C基因型引物的陽(yáng)性擴(kuò)增片段產(chǎn)物為120 bp，與理論上目標(biāo)基因產(chǎn)物片段大小一致。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，B基因型占比為58.0%（131例/總數(shù)226例），C基因型占41.1%（93例/226例），其他基因型占0.9%（2例/226例），HBV以B、C基因型為主。

2.2 B、C基因型患者中的HBV DNA表達(dá)情況

采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)乙肝病毒患者HBV DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，B基因型患者中HBV DNA陽(yáng)性率為57.2%（75/131）；C基因型患者中HBV DNA陽(yáng)性率為63.4%（59/93）?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示，HBV DNA陽(yáng)性率在B型患者和C型患者中無(wú)顯著性差異，見表2。

表2 B、C基因型患者中的HBV DNA表達(dá)情況Table 2 Expression of HBV DNA in genotype B，C infected patients

2.3 B、C基因型患者的PreS1抗原表達(dá)情況

采用雙抗體夾心ELISA法的兩步法對(duì)乙肝病毒患者PreS1抗原進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B基因型患者中PreS1抗原陽(yáng)性率為48.1%（63/131）；C基因型患者中Pres1抗原陽(yáng)性率為48.4%（45/93）。卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示，PreS1抗原陽(yáng)性率在B型患者和C型患者中差異不顯著（P＞0.05），見表3。

表3 B、C基因型患者的PreS1抗原表達(dá)情況Table 3 Expression of PreS1 in genotype B，C infected patients

2.4 B、C基因型患者中的HBeAg表達(dá)情況

采用雙抗體夾心ELISA法的兩步法對(duì)乙肝病毒患者中的HBeAg抗原進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B基因型患者中HBeAg陽(yáng)性率為32.1%（42/131）；C基因型患者中HBeAg陽(yáng)性率為46.2%?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示，HBeAg陽(yáng)性率在B型患者和C型患者中差異顯著（P＜0.05），見表4。

表4 B、C基因型患者中的HBeAg表達(dá)情況Table 4 Expression of HBeAg in genotype B，C infected patients

3 討論

控制患者體內(nèi)HBV病毒復(fù)制是乙型病毒性肝炎治療的一個(gè)重要策略。干擾素和核苷酸類抑制物是目前常規(guī)的乙肝抗病毒藥物，而這兩類藥物在不同基因型患者中的治療效果有一定差異［7-9］，這很可能是由于不同基因型患者產(chǎn)生的耐藥突變率各異［10-12］。因此，乙肝患者的基因分型對(duì)乙肝的診斷和治療中有重要的指導(dǎo)意義。本研究針對(duì)各基因型HBV基因設(shè)計(jì)特異性引物，并應(yīng)用巢式PCR技術(shù)對(duì)安徽安慶地區(qū)慢性乙型病毒性肝炎患者進(jìn)行基因分型檢測(cè)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)慢性乙肝患者的HBV感染是以B基因型（占58.0%）與C基因型（占41.1%）為主，其他基因型較少見。該調(diào)查結(jié)果與同行在我國(guó)中部地區(qū)的調(diào)查報(bào)道一致，這為該地區(qū)的乙肝疫情的預(yù)防政策制定及患者診療的藥物選擇提供了重要的依據(jù)［3］。

大量研究已證實(shí)，HBV DNA、HBeAg、PreS1抗原是評(píng)估患者體內(nèi)乙肝病毒感染狀況、病情進(jìn)展及治療效果的重要指標(biāo)，在臨床患者診療中應(yīng)用廣泛［5］。本研究檢測(cè)了不同HBV基因型患者中這3個(gè)指標(biāo)的表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示，C基因型HBV感染的患者血液HBeAg陽(yáng)性率明顯高于B基因型患者，而血液中HBV DNA陽(yáng)性率與PreS1抗原陽(yáng)性率在B型與C型患者中沒(méi)有明顯差異，本研究結(jié)果與秦望森等報(bào)道的結(jié)果一致［13-14］。

HBV DNA含量檢測(cè)是反映乙肝病毒在患者體內(nèi)復(fù)制狀況的最直接指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)在不同HBV基因組HBV DNA陽(yáng)性率沒(méi)有顯著差別，這與以往同行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的［15-16］。但據(jù)報(bào)道，C基因型患者中HBV DNA高拷貝者（≥100 000 IU/mL）比例明顯比B基因型要高［17］，這提示C型HBV患者有更高的病毒復(fù)制［18］。但國(guó)內(nèi)也有乙肝病毒高拷貝組在B型和C型中沒(méi)有明顯差異的報(bào)道［19］，這可能與研究對(duì)象選取范圍的差異有關(guān)。

PreS1抗原在HBV感染的最早期即可出現(xiàn)，因而可以起到早期診斷的作用。它與HBV DNA檢出率高度吻合，隨HBeAg消失而消失，可作為病毒清除與病毒轉(zhuǎn)陰的指標(biāo)。PreS1抗原陽(yáng)性的患者具有更大的病毒傳染性，它能反映HBV病毒復(fù)制和傳染性的指標(biāo)［19］。本研究結(jié)果顯示，PreS1抗原在不同HBV基因型中無(wú)顯著性差別，與HBV DNA檢測(cè)結(jié)果一致。

HBeAg是乙肝病毒核心顆粒中的一種可溶性蛋白質(zhì)。它的出現(xiàn)往往遲于HBsAg，而消失卻早于HBsAg。它在乙肝活動(dòng)期檢出率升高，表明肝細(xì)胞有較嚴(yán)重的損傷，患者有很強(qiáng)的傳染性。因此，它是一個(gè)反映乙肝病情進(jìn)展及病毒傳染性的血清學(xué)標(biāo)志物［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，C基因型HBV患者比B基因型有更高的HBeAg陽(yáng)性率，與國(guó)內(nèi)同行的研究報(bào)道一致［14］。這提示C基因型HBV患者可能病毒復(fù)制活動(dòng)更活躍，病情更嚴(yán)重，療效與預(yù)后更差。

因此，在安徽安慶地區(qū)等我國(guó)中部地區(qū)慢性乙肝患者的衛(wèi)生防治政策上，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注HBV主要基因型（B與C型）的防治。HBV DNA含量與PreS1抗原檢測(cè)，對(duì)準(zhǔn)確評(píng)估病毒復(fù)制情況及患者的病情非常有幫助。而C基因型HBV感染患者具有高HBeAg陽(yáng)性率、高傳染性及及嚴(yán)重的病情發(fā)展，更應(yīng)引起高度重視及采取有效的診治措施。