莫大超 李君久 彭亮 劉志遠(yuǎn) 王杰云 袁積汝

胃潰瘍屬于消化性潰瘍的一種，是一類發(fā)生于胃部的粘膜損傷。作為一類發(fā)生于消化道的常見病和多發(fā)病，胃潰瘍病程較長且較易反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重的影響了患者的生活質(zhì)量［1-3］。既往的流行病學(xué)研究表明包含胃潰瘍在內(nèi)的消化性潰瘍是一類遺傳和環(huán)境共同作用的復(fù)雜疾病，遺傳學(xué)因素可以解釋其39%的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［3］。既往研究表明包含幽門螺旋桿菌感染、吸煙、飲酒以及多個(gè)易感基因均對胃潰瘍的發(fā)生和發(fā)展造成一定影響［4-6］。一項(xiàng)基于日本人群的大樣本全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）提示位于PSCA基因上的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)rs2294008與消化性潰瘍的疾病狀態(tài)存在顯著性的關(guān)聯(lián)［7］。然而由于不同群體遺傳背景的差異，這一研究結(jié)果在中國人群中的有效性尚待驗(yàn)證。本課題采用候選基因的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)研究策略，以中國漢族人群作為研究對象，對覆蓋PSCA基因的若干SNP位點(diǎn)與胃潰瘍的潛在關(guān)聯(lián)進(jìn)行研究，在中國人群中評估該基因相關(guān)SNP對胃潰瘍發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的貢獻(xiàn)情況。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

研究對象主要包括胃潰瘍病例組和健康對照組，所有個(gè)體均來自于東莞東華醫(yī)院普外科就診患者。兩組受試者均為東莞及其周邊地區(qū)漢族居民，且無血緣關(guān)系。所有受試者均接受胃鏡檢查，并在胃鏡檢查期間取出了兩個(gè)活組織檢查樣本。胃潰瘍患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①反復(fù)上腹部疼痛或不適，②胃鏡提示胃潰瘍病變，③胃鏡病理活檢提示良性病變。本研究對象的排除標(biāo)準(zhǔn)包括：①受試者服用過非甾體抗炎藥、鉍鹽和抗生素，②罹患胃部腫瘤、增加胃酸分泌的疾病、腎衰竭，③存在器官移植的情況。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得每位受試個(gè)體的書面知情同意。受試者的基本臨床數(shù)據(jù)通過詢問病史獲得（年齡、吸煙和飲酒情況）。胃潰瘍組688例，其中男372例，女316例，平均年齡（46.4±13.5歲）；健康對照組1 442例，其中男783例，女659例，平均年齡（46.5±14.2歲）。

1.2 方法

1.2.1 幽門螺旋桿菌感染狀態(tài)

利用快速尿素酶試驗(yàn)與組織病理學(xué)檢查（吉姆薩染色和抗幽門螺桿菌IgG抗體檢測）判斷所有參與者的幽門螺桿菌感染狀態(tài)。使用直接酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（130226，鄭州博賽生物有限公司）在所有參與者的血清樣品中檢測抗幽門螺桿菌IgG抗體，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.2 DNA的提取

依據(jù)DNA提取試劑盒（Genomic DNA kit，Axygen Scientific Inc.，CA，USA）中的說明書，從外周血白細(xì)胞中提取了基因組DNA，并將所提取的DNA儲(chǔ)存在-80℃的環(huán)境下備用。

1.2.3 SNP選擇與基因分型

利用千人基因組數(shù)據(jù)庫中的北京漢族人群數(shù)據(jù)，選取PSCA基因內(nèi)最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）≥0.02且雜合度≥0.2的SNPs位點(diǎn)，共計(jì)63個(gè)。對這63個(gè)SNPs以r2≥0.7為條件進(jìn)行標(biāo)簽SNP的遴選，總計(jì)11個(gè)標(biāo)簽 SNPs（rs2978974，rs184389994，rs117340570，rs2978977，rs146194718，rs10956997，rs587606222，rs117919141，rs13262164，rs2294008，rs2976391）被納入本研究的后續(xù)分析。本研究使用高通量Sequenom MassARRAY平臺(tái)（Sequenom，San Diego，CA，USA）對選擇的標(biāo)簽SNP進(jìn)行基因分型，并使用Sequenom Typer 4.0軟件處理結(jié)果。本研究中每個(gè)標(biāo)簽SNP的基因分型成功率均大于99%，整體基因分型成功率也大于99%。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

分別統(tǒng)計(jì)病例組和對照組基因型分布頻率，經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)后，用Plink軟件包進(jìn)行分析［8］。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析病例組和對照組基因型的分布差異，用比值比（OR）及95%CI表示相對危險(xiǎn)度。部分SNP由于計(jì)數(shù)資料稀疏性采用Fisher精確檢驗(yàn)。利用Haploveiw軟件繪制了本次研究所納入的候選SNP構(gòu)成的連鎖不平衡（LD）圖譜［9］。采用Bonferroni法對多重檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行校正，P＜0.005為差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PSCA基因11個(gè)SNPs的基因型頻率

本次研究所納入11個(gè)PSCA基因的相關(guān)SNP位點(diǎn)全部位于非編碼區(qū)。所選SNP的MAF均大于0.01，且在對照組中均處于哈迪溫伯格平衡狀態(tài)，見表1。

2.2 連鎖不平衡圖譜

11個(gè)SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡圖譜顯示這些位點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)關(guān)系較弱，最大的r2值為0.66存在于SNP rs587606222和rs117919141之間，見圖1。

2.3 PSCA基因rs2294008多態(tài)性與胃潰瘍易感性

遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)結(jié)果顯示PSCA基因SNP位點(diǎn)rs2294008的多態(tài)性與胃潰瘍易感性存在顯著性關(guān)聯(lián)（OR=0.73，P=4.78×10-5，見表 2）。該 SNP的 T等位基因在對照組中的分布頻率（26.2%）高于病例組（20.5%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.005）。T等位基因可能是胃潰瘍的保護(hù)性因子。其他10個(gè)SNP的基因型和等位基因在病例組和對照組中的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.005）。

2.4 性別、吸煙、飲酒狀態(tài)以及幽門螺旋桿菌感染情況與PSCA基因rs2294008多態(tài)性和胃潰瘍易感性的關(guān)系

對性別、吸煙、飲酒狀態(tài)以及幽門螺旋桿菌感染情況這四種非遺傳學(xué)因素的分層分析發(fā)現(xiàn)SNP rs2294008與胃潰瘍的易感性在除抽煙之外不同因素的亞組中均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其OR值在不同的亞組中基本保持一致（詳見表3）。抽煙的亞組內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)SNP rs2294008與胃潰瘍的易感性，可能的原因是病例和對照的樣本數(shù)過少導(dǎo)致的統(tǒng)計(jì)效力偏低所造成。

表1 11個(gè)所選SNP的基本信息及次等位基因頻率和哈迪溫伯格檢驗(yàn)結(jié)果Table 1 Basic information including minor allele frequency and results of Hardy-Weinberg equilibrium tests for 11 selected SNPs

圖1 PSCA基因11個(gè)SNPs的連鎖不平衡圖示Figure 1 Linkage disequilibrium plot made from 11 selected SNPs of gene PSCA

3 討論

PSCA基因可以編碼一類糖蛋白，這些糖蛋白可以由糖基磷脂酰肌醇錨定在細(xì)胞膜上［10-12］。既往研究表明PSCA基因在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平均較高，此外通過小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）對PSCA的表達(dá)進(jìn)行干擾后，細(xì)胞的生長也會(huì)受到顯著性的抑制［13-14］。這些研究提示PSCA基因所編碼的蛋白對與細(xì)胞的增殖過程中扮演了重要的角色。在胃潰瘍的發(fā)病過程中，表皮細(xì)胞的增殖情況起到了較大的作用［15-16］。此外，既往研究表明PSCA基因相關(guān)的多肽可以作為T細(xì)胞靶向位點(diǎn)對前列腺癌進(jìn)行免疫治療，而在細(xì)胞基質(zhì)中存在的PSCA蛋白往往要比依附于細(xì)胞表面的PSCA蛋白更容易的被水解［14］。由于SNP rs2294008的C等位基因在被研究中被發(fā)現(xiàn)是胃潰瘍的風(fēng)險(xiǎn)等位基因，因此我們推測其可能會(huì)通過加速PSCA蛋白的水解過程并通過CD4+或CD8+T細(xì)胞的激活誘發(fā)下游的一系列免疫反應(yīng)來提高包括胃潰瘍在內(nèi)的消化道潰瘍的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。關(guān)于PSCA基因在胃潰瘍發(fā)病和發(fā)展過程中的作用，還需后續(xù)基于動(dòng)物模型或細(xì)胞層面的深入研究。

本研究在我國廣東地區(qū)漢族人群中發(fā)現(xiàn)rs2294008位點(diǎn)的基因型頻率以及等位基因頻率均在胃潰瘍病例組和對照組間的分布存在著顯著性的差異，該位點(diǎn)的T等位基因在胃潰瘍病例中的分布頻率顯著性的高于對照組。針對PSCA基因多態(tài)性與消化道潰瘍的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)研究既往開展較少，目前僅見較早前發(fā)表的基于日本人群的針對十二指腸潰瘍的研究一項(xiàng)［3］。在該研究中，學(xué)者發(fā)現(xiàn)rs2294008的T等位基因?qū)κ改c潰瘍具有顯著性的保護(hù)作用，其OR值為0.67，這與本次研究獲得的關(guān)聯(lián)信號結(jié)果基本一致。此次研究結(jié)果提示廣東地區(qū)漢族人群胃潰瘍的的遺傳風(fēng)險(xiǎn)可能與PSCA基因rs2294008位點(diǎn)的基因型有關(guān)，后續(xù)研究可以通過檢查該位點(diǎn)的變異情況從遺傳流行病學(xué)的角度對胃潰瘍的易感人群進(jìn)行篩查。在后續(xù)的針對性別、吸煙、飲酒狀態(tài)以及幽門螺旋桿菌感染情況這四種非遺傳因素的分層分析中發(fā)現(xiàn)在不同的分層中SNP位點(diǎn)rs2294008對胃潰瘍的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)貢獻(xiàn)情況基本一致，這提示PSCA基因SNP位點(diǎn)rs2294008的遺傳學(xué)作用可能是獨(dú)立于這些已知的危險(xiǎn)因素而存在的。

表2 基于單個(gè)位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果Table 2 results of single marker based genetic association analyses for 11 selected SNPs

表3 rs2294008位點(diǎn)遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)效應(yīng)分層分析Table 3 Stratification analyses for SNP rs2294008

本次研究所使用的DNA多態(tài)性位點(diǎn)為單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，該位點(diǎn)為第3代遺傳標(biāo)記，具有覆蓋度高、密度大和分型成本低的特點(diǎn)，可以基本滿足遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)分析的需要［17］。此外本次研究使用了Sequenom MassARRAY平臺(tái)對所選SNP進(jìn)行基因分型，該平臺(tái)主要基于基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MAL-DI-TOF-MS）技術(shù)，是目前最為常用的SNP檢測技術(shù)，具有高通量以及高準(zhǔn)確度的特點(diǎn)，完全可以適合于本次研究的大規(guī)模篩查需要［18］。

群體分層是遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)研究的主要混雜因素，這一混雜因素如果不能得到有效控制，會(huì)顯著地提升遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)信號的假陽性率［19］。本研究作為一項(xiàng)基于候選基因的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)研究，分型的SNP位點(diǎn)數(shù)目有限，因此無法使用目前常見的統(tǒng)計(jì)學(xué)手段對潛在的群體分層進(jìn)行校正。然而在樣本納入過程中，通過對受試者來源地進(jìn)行限制，可以部分的對受試者的遺傳背景的遺傳異質(zhì)性進(jìn)行控制，從而部分的消除了群體分層這一混雜因素的干擾。本次研究中由于研究經(jīng)費(fèi)和人力的限制采用了候選基因的研究策略，選取了11個(gè)遺傳多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行研究，這11個(gè)位點(diǎn)所包含的信息并不能夠覆蓋整個(gè)PSCA基因區(qū)域，因此在進(jìn)行研究的過程中可能遺漏了某些較為重要的遺傳學(xué)位點(diǎn)。在未來的研究中通過選取更高密度的遺傳學(xué)變異位點(diǎn)對PSCA基因與胃潰瘍的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)進(jìn)行更加系統(tǒng)性的研究，或許可以彌補(bǔ)這一缺憾。此外，由于目前PSCA基因rs2294008位點(diǎn)與胃潰瘍易感性的作用機(jī)制尚未明確，因此有關(guān)該SNP位點(diǎn)的基于細(xì)胞或動(dòng)物模型的功能分析尚待開展，以期獲得更有說服力的結(jié)果。